通过激光显微切割从口腔黏膜下纤维化样本中分离具有形态学和空间信息的细胞

摘要

口腔黏膜下纤维化组织的激光显微切割技术可从组织学感兴趣区域精确提取细胞，从而结合形态学和空间信息对多组学数据进行分析。

摘要

口腔黏膜下纤维化（OSF）是口腔中一种常见的潜在恶性病变。在组织病理学切片中常可见上皮萎缩以及固有层和黏膜下层的纤维化。已有研究提出，上皮异常增生、上皮萎缩和衰老的成纤维细胞可能与OSF的恶性转化相关。然而，由于潜在恶性口腔病变和口腔鳞状细胞癌具有高度异质性，难以明确OSF恶性转化的具体分子机制。本文介绍一种利用激光显微切割技术从福尔马林固定石蜡包埋组织切片中获取少量携带形态学特征和空间信息的上皮或间充质细胞的方法。通过显微镜，可精确捕获微尺度（约500个细胞）的异常增生或萎缩上皮组织以及上皮下纤维化组织。所提取的细胞可用于基因组或转录组测序，从而获得包含形态学和空间信息的基因组与转录组数据。该方法消除了整体OSF组织测序中的异质性问题，以及非病变区域细胞带来的干扰，实现了对OSF组织的精确空间组学分析。

引言

口腔黏膜下纤维化（OSF）是一种慢性、隐匿性发展的疾病，主要发生于颊黏膜，导致张口受限¹。尽管OSF是一种多因素疾病，但咀嚼槟榔是其主要病因^2,3。由于这一习惯具有明显的地域性，OSF主要集中于东南亚和南亚地区的人群中³。OSF常见的组织病理学特征包括口腔黏膜上皮下方结缔组织中异常的胶原沉积、血管狭窄及闭塞¹。OSF的上皮组织可表现为萎缩或增生，若合并口腔白斑时，甚至可出现异型增生^4,5。

口腔黏膜下纤维性变（OSF）被世界卫生组织定义为一种常见的口腔潜在恶性病变（OPMD），具有进展为口腔鳞状细胞癌的可能性，其恶性转化率为4%-6%^6,7,8,9。OSF发生恶性转化的机制十分复杂¹⁰。上皮组织的异常增生，包括发育不良和萎缩，会增加癌变风险；而间质中衰老的成纤维细胞可能通过活性氧（ROS）及其他分子诱导上皮-间质转化（EMT），从而参与OSF的恶性进展过程¹⁰。

空间组学分析技术生成了包含形态学和空间信息的多组学数据，这些数据有助于揭示癌症的发病机制^11,12,13。本文介绍了一种利用激光显微切割技术从福尔马林固定石蜡包埋的口腔黏膜下纤维性变（OSF）组织中捕获与形态相关细胞群体的实验方案。对这些样本进行多组学分析，可克服组织内异质性带来的挑战，加深对OSF恶性转化分子病理学及作用机制的理解¹⁴。

方案

本研究经北京大学口腔医学院机构审查委员会批准。已获得患者的知情同意。本研究中使用的组织样本均已去标识化。研究方案如图1所示。

1. 样品制备

1. 使用切片机将福尔马林固定石蜡包埋的口腔黏膜下纤维化组织切成连续的3 µm和10 µm厚度切片。
2. 将切片在水中展平，然后捞至载玻片上。将3 µm切片和10 µm切片分别固定于粘附性显微镜载玻片（载玻片A）和PEN膜载玻片（载玻片B）上。
3. 将载玻片置于60 °C的加热板上，烘烤2小时。

2. 苏木精-伊红染色

1. 将载玻片 A 和 B 放入二甲苯（注意）中 10 分钟，并重复此步骤三次。
2. 将载玻片 A 和 B 按 100%、100%、90%、80% 和 70% 的顺序依次置于梯度乙醇溶液中，每种浓度中各 1 分钟。
3. 将载玻片 A 和 B 放入超纯蒸馏水中 30 秒。
4. 将载玻片 A 和 B 放入苏木精染液（Harris hematoxylin）中染色 90 秒。
5. 将载玻片 A 和 B 放入超纯蒸馏水中 30 秒，并重复此步骤三次。
6. 将载玻片 A 和 B 放入分化-苏木精溶液（div-hematoxylin，注意）中 2 秒。
7. 将载玻片 A 和 B 放入超纯蒸馏水中 30 秒，并重复此步骤三次。
8. 将载玻片 A 和 B 放入 1% 返蓝溶液中 2 秒。
9. 将载玻片 A 和 B 放入超纯蒸馏水中 30 秒，并重复此步骤三次。
10. 将载玻片放入伊红染液（eosin）中 2 秒。
11. 将载玻片 A 和 B 放入超纯蒸馏水中 30 秒，并重复此步骤三次。
12. 将载玻片按 70%、80%、90%、100% 和 100% 的顺序依次在梯度乙醇溶液中脱水，每种浓度中各 2 秒。
13. 将载玻片 A 放入二甲苯中 3 分钟，并重复此步骤两次。
14. 向载玻片 A 滴加一滴封片剂（注意），并加盖盖玻片。

3. 组织学形态观察与激光捕获显微切割

1. 启动激光显微切割系统及软件（图2）。
2. 将载玻片A放置在载物台上，观察组织学形态，以确定激光显微切割的目标区域。
3. 取下载玻片A，将载玻片B倒置放置在载物台上。
4. 点击卸载按钮（图2），推出收集装置。将聚合酶链式反应（PCR）管插入收集装置中，并确保管子固定稳妥。点击确定按钮（图3）。
5. 通过点击标记为收集装置：管盖的相应红色圆圈来选择一个管盖。选中的圆圈将变为绿色。
6. 点击绘制按钮和绘制+切割按钮，使用鼠标勾画目标区域。
7. 点击开始切割按钮以捕获目标区域；捕获的样本将由管盖收集（图4）。
8. 点击下降按钮，确保捕获的样本已被收集（图5）。
9. 点击样本按钮以捕获下一个样本。
10. 点击卸载按钮，卸下含有捕获样本的PCR管。

结果

通过对口腔黏膜下纤维化（OSF）组织进行激光显微切割，我们分别采集了发育异常的上皮、发育异常上皮下方的间质、萎缩性上皮以及萎缩性上皮组织下方的间质样本（图1）。通过提取DNA并进行低深度全基因组测序，我们得以分析与形态学相关的拷贝数变异（CNA）¹⁵。CNA是一种常见的基因组不稳定性形式，与口腔潜在恶性病变（OPMD）向恶性转化风险增加相关^15,16。我们在四类样本中检测到不同的CNA模式。如图6所示，上皮样本中存在CNA，而间质样本中未检测到CNA。尽管样本来自同一患者，发育异常上皮中的CNA模式与萎缩性上皮中的CNA模式并不相同。在发育异常上皮中检测到染色体3和8上的CNA，而在萎缩性上皮中仅在染色体8上以较低频率检测到CNA。

讨论

本方案报告了一种通过激光显微切割技术获取具有形态学和空间信息的OSF组织样本的流程，以用于后续的空间组学分析。从代表性结果中，我们鉴定了不同形态学相关样本之间存在的多种CNA模式。

口腔黏膜下纤维性变（OSF）是一种常见的口腔潜在恶性疾患（OPMD），为口腔鳞状细胞癌的癌前病变⁶。已有研究报道，基因组不稳定性与OPMD的发生及其恶性转化相关^17,18。多项研究基于基因组学、转录组学和蛋白质组学数据，报道了与OSF进展及恶性转化相关的染色体改变、基因表达差异以及表观遗传学变异^{19,20,21,22,23}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
黏附显微镜载玻片	CITOTEST	REF.188105
分化苏木精染液	YiLi	20230326
伊红溶液	BASO	BA4098
乙醇	PEKING REAGENT	No.32061
哈里斯苏木精染色液	YiLi	20230326
加热板	LEICA	HI1220
激光捕获显微切割系统	LEICA	LMD7	设备
激光显微切割微系统	LEICA	8.2.3.7603	软件
封片封固介质	LEICA	REF.3801731
显微镜盖玻片	CITOTEST	REF.10212450C
切片机	LEICA	RM2235
PCR管	AXYGEN	16421959
PEN膜载玻片	LEICA	No.11505158
返蓝溶液	YiLi	20230326
超纯蒸馏水	Invitrogen	REF.10977-015
二甲苯	PEKING REAGENT	No.33535