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阿尔茨海默病埋线针灸疗法的操作步骤与注意事项

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DOI：

10.3791/65895

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2024年5月10日

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Acupuncture and Orthopedics, Hubei University of Chinese Medicine, 2Hubei Shizhen Laboratory, 3Hubei International Science and Technology Cooperation Base of Preventive Treatment by Acupuncture and Moxibustion, 4Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究介绍了一种针对阿尔茨海默病样大鼠的埋线针灸治疗方案。

摘要

埋线疗法（TEAT）是一种通过将可生物降解的缝合线植入穴位，从而提供持久刺激以预防和治疗疾病的方法。TEAT操作简便，避免了常规针灸带来的不适，且能产生持续的治疗效果。本文探讨了TEAT对具有阿尔茨海默病样症状大鼠的学习与记忆能力的潜在影响。由于化学诱导的大鼠神经元变性和认知功能障碍并不能完全反映阿尔茨海默病的真实病理变化，因此，本研究团队将这些表现定义为阿尔茨海默病样症状。本研究已建立一套标准化操作流程，详细说明了头颈部及腰背部穴位的选择、操作步骤以及相关注意事项。实验共分为三组：对照组、模型组和TEAT组，每组各6只大鼠。为诱导阿尔茨海默病样症状，所有模型组和TEAT组大鼠连续7周（共49天）接受腹腔注射D-半乳糖。TEAT组大鼠随后接受穴位羊肠线埋置治疗。干预结束后，采用莫里斯水迷宫（MWM）实验评估大鼠的学习与记忆能力。随后处死大鼠并取脑组织进行病理学检查，以明确TEAT对阿尔茨海默病样症状大鼠脑部病理变化的影响。本研究表明，TEAT可能改善具有阿尔茨海默病样症状大鼠的学习与记忆功能，提示其在治疗此类神经退行性疾病方面具有潜在的应用前景。

引言

埋线针灸（TEA）是指使用特制针具将羊肠线或可吸收缝合线植入穴位的技术。该技术具有持续效应，直至缝合线被吸收和降解。它可对穴位产生连续而持久的刺激，持续时间达一周或更久1，在无需每日重复操作的情况下达到类似疗效2。这在一定程度上减少了患者就诊次数，从而节约了医疗资源。近年来，TEA在中国的多个医学领域中应用日益广泛，包括内科、外科、皮肤科、五官科、妇科和儿科3。研究表明，该疗法对某些慢性病和复杂疾病具有长期且可靠的疗效，例如癫痫4和面神经麻痹5。其优势在于创伤小、操作简便6。此外，有报道显示TEA的治疗成本低于电针（EA）7。因此，TEA在临床和科学研究中正受到越来越多的重视。

阿尔茨海默病（AD）是一种随时间进展的神经退行性疾病。其病理生理过程在临床症状出现前约20年便已开始积累，但其机制尚未完全阐明8。鉴于目前可用于AD的有效药物有限，研究 increasingly 集中于该疾病的前驱期和临床前期阶段9。预防是应对AD发生与进展的关键策略9,10。近年来，中医药（TCM）取得了显著进展，有望为AD的预防和治疗提供新的可能性11,12。作为针灸的一种亚型，经皮耳穴刺激疗法（TEAT）因其治疗范围广、创伤小、操作简便、治疗频率低且疗效持久，较其他疗法更具优势6。新兴文献表明，TEAT可能对肥胖13,14、糖尿病15、失眠16、绝经后骨质疏松17和抑郁症18等AD风险因素产生有益影响。此外，TEAT可通过调节线粒体自噬改善衰老大鼠的衰老状态2，改善血管性痴呆（VD）大鼠的空间学习与记忆障碍，减轻海马病理损伤，并抑制炎症反应19。因此，探讨TEAT是否也能作用于AD的病理过程显得尤为有意义。

目前的研究在埋线疗法（TEAT）操作的多个关键要素上缺乏统一性和标准化，包括埋线方法、埋线工具、缝线材料以及埋线间隔周期。这种缺乏标准化的情况影响了对治疗效果的评估和相关机制的探索，也限制了该疗法的对外推广与交流。既往研究20,21表明，通过腹腔注射D-半乳糖（D-gal）可诱导大鼠产生类似阿尔茨海默病的病理改变，包括神经元变性和认知功能障碍。此外，电针刺激百会（GV20）和肾俞（BL23）已被证实能有效改善认知衰退，减轻神经炎症反应，并减少神经元损伤。本研究以阿尔茨海默病模型大鼠为例，介绍在此类模型下埋线疗法的选穴原则、操作流程及注意事项，并探讨实验研究中埋线疗法的关键操作环节，为今后的研究提供参考依据。

方案

所有实验均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行，并经湖北省疾病预防控制中心实验动物管理和使用委员会批准。实验共使用18只3月龄雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重为220–250 g。所有大鼠饲养于12小时光照/12小时黑暗循环、温度23 ± 1 °C、湿度40%–50%的环境中，自由摄食和饮水。经过为期一周的适应期，使大鼠适应实验室条件后，开始进行实验。

1. 模型构建

  1. 实验设计如图所示 图1将18只体重为220–250 g的3月龄雌性Sprague-Dawley大鼠随机分为对照组、模型组和TEAT组，每组6只。
  2. 每日于下腹部区域向模型组和TEAT组注射D-半乳糖（D-gal；120 mg/kg/天），对照组注射等量生理盐水（120 mg/kg/天），连续给药7周（49天）22注射应在每天上午8:00至9:00之间进行。
  3. 每周第7天上午9:00至10:00称量大鼠体重。实验持续49天。每14天埋植缝线一次，分别在第14th, 28th，和 42nd 天。每次线程嵌入的时间固定在上午9:00至12:00之间。
  4. 持续7周对大鼠腹腔注射D-半乳糖，以诱导阿尔茨海默病相关病理表现22.

2. TEAT 的准备工作

  1. 对眼科剪刀、托盘和镊子等外科手术器械进行灭菌和消毒。彻底清洁手术室环境中的所有表面，并进行消毒。
  2. 准备手术平台：将小型动物加热垫平铺于台面，再覆盖无菌毛巾。随后将已清洁并消毒的手术板平稳放置其上，粗糙面朝上。然后打开加热垫，将温度设定为 32 °C。
  3. 手术操作选用直径为 0.6 mm 的 6 号一次性埋线针，以及长度为 2 cm 的 5-0 可吸收外科缝合线（胶原蛋白缝合线）。使用眼科剪将 2 cm 长的 5-0 可吸收缝合线剪成 0.5 cm 和 0.2 cm 的小段。将剪好的缝线浸泡于 0.9% 生理盐水中，备用。
  4. 用肥皂和水洗手 20 秒，然后擦干。随后佩戴无菌手套。
  5. 通过腹腔注射水合氯醛（300 mg/kg）对大鼠进行麻醉，注射部位为腹部下侧区域；当动物处于手术麻醉平面且对足趾夹捏测试无反应时，确认麻醉生效，并维持其生理状态稳定。此外，为防止大鼠在麻醉期间角膜干燥及可能的损伤，需在眼部涂抹足量的兽用眼膏，确保整个手术过程中角膜保持润滑。
    注意：建议对大鼠实施麻醉，因为穿刺过程会引发疼痛。

3. 百会穴（GV 20）埋线操作

  1. 在大鼠顶骨右侧中点处定位百会穴（GV 20）（图2A）。将大鼠体位固定，充分暴露头部，向前牵拉双耳，模拟人类连接耳尖连线的方法。通过触诊颅骨中央纵向骨嵴，并确定其大致中点位置来定位百会穴（GV 20）。进一步确认该穴位位于双耳平贴头部时与头接触的水平面，即矢状缝与顶骨交汇处。使用标记笔标记百会穴（GV 20）。
  2. 使用修毛器（通常为电动男士胡须修剪器）剃除大鼠穴位周围头部区域的毛发。
  3. 术前用0.5%碘溶液以同心圆方式从中心向外周擦拭穴位及周围皮肤进行消毒。随后进行三次消毒：每次使用碘伏消毒后，均用酒精脱碘，确保充分去污，为无菌操作做好准备。
  4. 用镊子夹取已浸泡在生理盐水中的0.2 cm可吸收外科缝线，将其置于套管针前端，然后连接针芯。
  5. 一手用拇指和食指捏起百会穴（GV 20）周围的皮肤，另一手持针。
  6. 捏住皮肤的同时，将针以与皮肤表面呈15°角的方向水平快速刺入，进针点位于百会穴（GV 20）下方0.1 cm处（图3A）。
  7. 当针尖到达百会穴（GV 20）上方0.1 cm处时，边推进针芯边缓慢退出套管针，将0.2 cm可吸收外科缝线完全植入穴位皮下组织内（图3B）。
  8. 缓慢拔出针具，确保无缝线外露。用无菌干棉球压迫针孔10秒，防止出血。若埋线后缝线位于体外，应将其取出并重新操作。

4. 肾俞穴（BL 23）埋线操作

  1. 大鼠的肾俞穴（BL 23）位于第二腰椎棘突下缘旁开5 mm处nd 腰椎（图2B）。首先，找到 6th 根据大鼠髋结节定位腰椎，然后定位第2节nd 通过向上计数四个椎体确定腰椎，肾俞（BL 23）位于其外侧5 mm处23.
    注意：根据中医理论，百会（GV 20）与肾俞（BL 23）穴位组合常用于脑部疾病的预防与治疗。此前的研究已证实这一点20,21这种配穴方法因其疗效而被确立。
  2. 用记号笔标记肾俞穴（BL 23）。使用修剪器（通常为电动胡须修剪器）剃除大鼠穴位周围背部及腰部的毛发。
  3. 手术前，使用0.5%碘溶液以由中心向外旋转的方式对穴位及周围皮肤进行消毒。随后进行三次消毒：每次先用碘伏消毒，再用酒精脱碘，确保手术部位充分去污，为无菌操作做好准备。
  4. 使用镊子夹取浸有生理盐水的0.5 cm可吸收外科缝线，将其置于针管前端，然后连接针芯。
  5. 用按压手的食指和中指或拇指与食指绷紧皮肤。持针手握住针头。
  6. 快速将针垂直刺入肾俞穴（BL 23）下方0.25 cm处。见 图4A.
  7. 当针尖到达皮下0.5 cm处时，调整针尖方向，使其进针方向朝向中心，与皮肤表面呈45°角，斜向刺入0.5 cm（图4B).
    注意：针刺肾俞（BL 23）时需格外谨慎，因该穴位靠近肾脏。进针过深或反复提插可能造成损伤，因此建议进针深度为0.3–0.6 cm左右。
  8. 在退管的同时推进针芯，将0.5 cm可吸收外科缝线完全植入穴位的肌肉组织中图4C).
  9. 缓慢拔出针头，确保无缝线外露。随后用无菌干棉球按压针孔10秒，以防止出血。若埋线后缝线位于体外，需将其取出并重新操作。

5. 术后护理

  1. 术后将大鼠置于设定温度为 32°C 的小型动物加热垫上，以促进其从麻醉中恢复。在将动物送回饲养笼之前，确保其已完全清醒且状态良好。
  2. 手术后，观察受影响区域在一周内是否出现无菌性炎症反应的迹象，这些迹象可能包括发红、肿胀或类似脓液的分泌物。通常情况下，这些症状无需治疗。然而，若渗出物过多，则需对患处进行引流和消毒，并涂抹红霉素软膏直至伤口完全愈合。

6. 行为学测试与组织学检查

  1. 干预后第8周，进行Morris水迷宫（MWM）实验2,24，以评估其学习和记忆能力。学习试验持续5天，每天进行4次试验。最后一次获取训练结束后24小时，进行一次探针试验。
  2. 使用统计分析软件进行统计比较。采用单因素方差分析（ANOVA）及事后Tukey检验分析学习能力的行为学数据。逃逸潜伏期数据的显著性通过双因素重复测量方差分析（ANOVA）及事后Bonferroni检验进行评估。所有检验中，p <0.05被认为具有统计学意义。
  3. 行为学评估结束后，按照前述方法麻醉大鼠，并通过腹腔注射150 mg/kg体重的戊巴比妥钠实施安乐死。
  4. 通过血管系统灌注4%多聚甲醛固定大鼠脑组织25。
    1. 灌胃针的插入与固定
      1. 准备一根12G针头，确保其笔直且适合穿过大鼠心室。定位大鼠心室（通常为左心室），将针头经心室插入升主动脉。此步骤需要精准操作及对大鼠解剖结构的充分了解。
      2. 针头就位后，使用止血钳在针头进入主动脉处附近夹紧灌胃针，以固定针头并防止其移动。
      3. 确保止血钳夹紧程度足以牢固固定针头，但不可过紧以免损伤主动脉或阻碍血流。在整个操作过程中，灌胃针应始终保持在升主动脉内，以保证灌注顺利进行。
    2. 生理盐水灌注
      1. 准备一支50 mL无针头注射器用于灌注。将位于大鼠体外的灌胃针另一端连接至装有生理盐水的注射器。
      2. 在右心耳处做一小切口，使血液能够流出心脏。此步骤可确保灌注过程中血液被生理盐水充分置换。
      3. 以稳定且恒定的速度开始向升主动脉注入生理盐水，以冲洗血液并为后续组织固定做好准备。
      4. 观察从右心耳流出的液体，并根据需要及时更换注射器，以维持持续的新鲜生理盐水灌注。
        ​针头就位后，准备进行固定液灌注。
      5. 将装有生理盐水的注射器更换为装有4%多聚甲醛的注射器（多聚甲醛是组织学中常用的固定剂），继续使用多聚甲醛进行灌注，以原位固定组织，便于后续处理与分析。
        注：在整个操作过程中，必须严格保持无菌技术以防止感染，并轻柔操作大鼠以尽量减少损伤。此外，所有操作人员均应接受相关技术培训，以确保操作的一致性和有效性。
  5. 取出大鼠脑组织，置于含有4%多聚甲醛的标本瓶中，在4 °C下固定24–48小时25,26。依次进行乙醇脱水和二甲苯处理，随后进行常规连续冠状切片（4–5 µm）以进行测量。采用苏木精-伊红（H&E）染色法（200倍放大）评估各组海马区神经元的形态学变化及神经元丢失情况。
    注：由于在整个实验期间未观察到提示胃肠道（GI）功能紊乱的临床症状，因此未对啮齿类动物进行尸检以评估胃肠道病变。动物未表现出明显的不良反应，提示不存在此类病理改变。

结果

本文介绍了在阿尔茨海默病样大鼠中进行经颅电刺激治疗（TEAT）的具体操作方法，探讨了实验研究中TEAT的关键操作要素，以为今后的研究提供参考。

经颅电刺激改善阿尔茨海默病样大鼠的学习能力
如流程图（图5）所示，在适应性训练期间，观察到各组大鼠在游泳时均会观察周围环境。游泳速度分析（图6）显示各组之间无显著差异，表明各组在运动速度和视觉感知方面的基线水平一致。实验结果中观察到的任何差异并非由运动能力或视觉感知的差异所致。

大鼠接受了5天的平台搜索训练。图7A显示，在训练的早期和晚期，各组大鼠的运动轨迹存在差异。在第2天，大多数具有逃避动机的大鼠呈随机游泳状态；而在第5天，对照组大鼠的游泳具有方向性，模型组大鼠则沿水池壁随机游动，TEAT组大鼠在目标象限的运动轨迹变得更加密集。实验检测了逃避潜伏期，潜伏期越短表明能力越强。图7B显示，与对照组相比，模型组大鼠的学习和记忆能力下降；然而，TEAT组显著改善了具有阿尔茨海默病样病理特征大鼠的空间参考记忆障碍。

TEAT 改善阿尔茨海默病样大鼠的空间记忆能力
在探针试验中，动物花费时间的位置反映了其空间偏好27。大鼠寻找平台主要采用四种方法：基于边缘的搜索、随机性搜索、趋向性搜索和线性搜索28。结果表明，各组大鼠采用了不同的搜索策略（图8A）。对照组大鼠主要采用线性和定向搜索策略，表明其具有较强的记忆能力，能够回忆平台的位置。相比之下，模型组大鼠主要表现为基于边缘的搜索策略，提示其记忆能力显著下降，未能学会寻找平台或记住其位置。TEAT 处理组大鼠则表现出趋向性搜索策略，其轨迹密度在原平台所在象限以及相邻象限最高，表明与模型组相比，其记忆能力有所改善。

图8B 和 图8C 显示了大鼠在原平台所在象限停留时间以及穿越平台位置次数的结果。与对照组相比，模型组大鼠在原平台象限的停留时间显著缩短，穿越平台次数也显著减少（p <0.01）。与模型组相比，TEAT组大鼠在原平台象限的停留时间以及穿越平台次数均显著增加（p <0.01）。这些结果表明，TEAT能够改善具有AD样病理特征大鼠的空间学习和记忆障碍。

TEAT 可改善大鼠海马体的衰老（图9）。与对照组相比，模型组大鼠表现出严重的病理改变，包括锥体细胞数量显著减少及其排列不规则。此外，还观察到细胞核固缩、神经元变性及其他异常现象。然而，在接受 TEAT 治疗后，大鼠海马体锥体细胞数量增加，排列更为有序。尽管部分细胞核仍存在固缩现象，但整体细胞形态更趋正常。细胞分布更密集且排列整齐，胞质染色更加均一，细胞周围水肿明显减轻。值得注意的是，可见到正常的锥体细胞。

小鼠研究时间线示意图，持续8周的D-半乳糖处理方案用于认知功能分析。
图1：实验流程图。经过1周的适应期（第0周）后，研究将18只大鼠分为三组：对照组、模型组和TEAT组。在第1至第7周，对照组接受生理盐水注射，而模型组和TEAT组则给予D-半乳糖处理。TEAT组在第2、4、6周 additionally 接受埋线针灸治疗。所有大鼠在第8周进行Morris水迷宫测试，随后实施安乐死。缩写：Adapt = 适应期，Con = 对照组，Mod = 模型组，TEAT = 埋线针灸治疗组，D-gal = D-半乳糖，MWM = Morris水迷宫测试。 请点击此处查看该图的放大版本。

小鼠皮肤研究；使用尺子测量无毛区域，用于皮肤病学研究。
图2：穴位位置。（A）大鼠的百会穴（GV 20）。位于顶骨右侧中点。（B）大鼠的肾俞穴（BL 23）。位于第二腰椎外侧5 mm处。缩写：GV = 督脉，中医（TCM）中的一个概念，指沿身体背侧中线走行的主要经脉；BL = 膀胱经，代表膀胱经脉，在中医中对应足太阳经，是六条阳经之一，沿身体背部和腿部走行。请点击此处查看该图的放大版本。

动物注射技术；操作示意图；研究方法；实验大鼠麻醉应用。
图3：百会（GV 20）穴位埋线操作的详细步骤。（A）将皮肤捏起以利于操作，在百会（GV 20）穴位下方0.1 cm处，以与皮肤表面呈15°角的方向水平进针。（B）当针尖到达百会（GV 20）穴位上方0.1 cm位置时，在回撤针管的同时推进针芯，将0.2 cm可吸收外科缝线完全植入穴位处的皮下组织中。缩写：GV = 督脉，中医理论中的一个概念，指沿人体背部正中线走行的主要经络。请点击此处查看该图的高清版本。

使用注射器进行动物注射方法；生物医学研究过程的实验装置。
图4：肾俞穴（BL 23）埋线操作的详细步骤。（A） 将针头快速垂直刺入肾俞穴（BL 23）下方 0.25 cm 深处。（B） 当针尖到达皮下 0.5 cm 深度时，将针体转向穴位中心方向，与皮肤呈 45°角，然后斜向刺入至 0.5 cm 深度。（C） 在推进针体的同时回抽导管，确保将一段 0.5 cm 长的可吸收外科缝合线完全植入肾俞穴（BL 23）的肌肉组织中。缩写：BL = 膀胱经，代表膀胱经脉，在中医理论中对应足太阳经，是六条阳经之一，沿躯干背部及下肢后侧走行。请点击此处查看该图的高清版本。

Morris水迷宫示意图；游泳速度、逃避潜伏期、目标象限分析的时间线。
图5：Morris水迷宫（MWM）实验流程图。 实验前的适应性训练记为第0天，用于观察大鼠的运动能力并对游泳速度进行统计分析。随后进行为期五天的空间导航训练阶段（第1至第5天），比较并分析不同组别之间的逃避潜伏期（escape latency）。第6天进行空间探索试验，评估大鼠在目标象限停留的时间（target quadrant dwell time）以及穿越平台位置的次数。请点击此处查看该图的放大版本。

游泳速度比较，柱状图，对照组、模型组与TEAT组性能分析。
图6：各组游泳速度（m/s）比较。 本图展示了不同实验组大鼠的平均游泳速度（单位：米/秒），每组包含六只动物（n=6）。误差线表示标准差。组间差异无统计学意义，如 ns 所示（p > 0.05）。统计分析使用 SPSS 软件进行，所有数据均符合正态分布。请点击此处查看该图的放大版本。

行为实验结果；迷宫导航图；逃避潜伏期图表；对照组与实验组。
图 7：WMW 空间导航实验结果。（A）该图展示了各实验组大鼠在空间导航试验中代表性运动轨迹图，用以反映其导航路径。（B）各组间逃避潜伏期（以秒，s 为单位）的比较，每组包含六只大鼠（n=6）。采用双因素重复测量方差分析（two-way repeated measures ANOVA）对导航试验过程中组内效应及组间差异进行统计分析。数据符合正态分布假设，以组均值 ± 标准差表示。与对照组相比，显著性差异以星号表示（*p < 0.05，**p < 0.01）；与模型组相比，显著性差异以井号表示（#p < 0.05，##p < 0.01）。请点击此处查看该图的放大版本。

Morris水迷宫实验示意图；小鼠导航路径，各组数据比较的柱状图。
图8：WMW探针试验的结果。（A）该图展示了各实验组大鼠在探针试验中空间探索行为的代表性运动轨迹图。（B）该图比较了各组大鼠在目标象限内的停留时间（单位：秒，s），反映其对平台位置的记忆保持能力。（C）该图显示了大鼠穿越平台区域的频率（freq），用以评估其空间记忆表现。每组包含六只大鼠（n=6），采用单因素方差分析（one-way ANOVA）对数据进行统计学分析，以评估组间差异。数据符合正态分布，以均值±标准差表示。与对照组相比，显著性差异用星号标记（**p < 0.01）；与模型组相比，显著性差异用井号标记（#p < 0.05，##p < 0.01）。**p < 0.01 vs. 对照组，#p < 0.05 vs. 模型组，##p < 0.01 vs. 模型组。请点击此处查看该图的放大版本。

脑组织显微图像；细胞结构比较；50 µm 比例尺。
图9：大鼠各组海马CA1区在200倍放大下的苏木精-伊红染色评估。（A）对照组显示典型的神经元结构，锥体细胞保存良好。（B）模型组表现出明显的病理改变，特征为锥体细胞密度显著降低、深染的变性神经元以及排列紊乱。（C）TEAT组显示出改善的海马结构，锥体细胞数量增加，排列更为有序，形态更趋正常。尽管偶见核固缩，但细胞排列更紧密，胞质染色均匀，细胞周围水肿显著减轻。可见大量形态正常的锥体细胞。比例尺 = 50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

干预时机
阿尔茨海默病（AD）的病因复杂，其发病机制尚不明确。目前尚无对该病有效的治疗方法，且病程不可逆转。因此，学术界已达成共识，认为应重视AD的预防与治疗。AD的防治策略强调早期干预，遵循中医“治未病”的理念，注重未病先防、既病防变、瘥后防复。在人群29,30和啮齿类动物31,32中积累的研究表明，早期针灸和艾灸干预可在无明显副作用的情况下取得显著效果，是一种具有前景的AD防治潜在方法。因此，本研究在造模过程中即开始实施干预。TEAT在腹腔注射D-半乳糖（D-gal）的同时即开始实施。

穴位选择
阿尔茨海默病（AD）是一种严重的神经退行性疾病，主要影响负责记忆、语言、推理和社会行为的大脑区域。在中医理论中，脑（Nao）被视为髓（Sui）之海。髓（Sui）由精（Jing）化生，精是中医特有的概念，被认为是人体基本的体质力量、活力和抗病能力。精（Jing）主要储藏于肾（Shen）中。若肾精（Shen Jing）亏虚，则脑（Nao）失所养，可能导致认知功能障碍。因此，中医认为补肾益精（Jing）有助于改善脑功能。某些经络可直接联系脑部，例如督脉（GV）和足太阳膀胱经（BL），因其循行入脑。督脉（GV）与足太阳膀胱经（BL）的配伍在防治AD方面应用广泛33,34。百会穴（GV 20）位于头顶正中，属于督脉。文献显示，在采用针灸与艾灸防治AD的研究中，百会穴（GV 20）出现频率最高，被视为组方中的关键穴位35。肾俞穴（BL 23）位于足太阳膀胱经，定位在第二腰椎棘突下缘旁开1.5寸处。作为肾的背俞—俞穴，它能够全面增强肾的功能，包括肾阴、肾阳、肾精（Jing）及肾气。针刺或艾灸百会穴（GV 20）与肾俞穴（BL 23）可通过多种途径改善认知功能，缓解AD症状36,37。

间隔时间
TEAT 的操作标准38 治疗间隔和疗程应根据疾病状况和所选操作部位来确定，间隔时间为1周至1个月，疗程可为1至5次。该建议也可适用于实验动物研究。根据所综述的文献39，治疗通常每周或每两周进行一次，多数情况下需连续治疗4至8次。实验持续49天，期间线材于第14天埋入th, 28th，以及 42nd 天。

工具与方法
目前在实验动物研究中使用多种埋线工具，包括7号40或9号41一次性埋线针、自行改造的针具以及12号腰穿针42。自行改造的针具通常以5–7号注射器作为针管，选用合适的毫针作为针芯，针尖已预先进行平滑处理。例如，在一项使用体重为250 ± 20 g的SD大鼠（文本未注明月龄）的研究中，可选择7号注射器配0.30 × 0.40 mm的毫针43,44。然而，自行改造的针具必须严格消毒，限制了其广泛应用。若针尖过大或过于锋利，则可能损伤血管和神经，增加瘀斑发生的风险45。腰穿针直径较大且针尖锋利，更易造成血管和神经损伤。在临床实践中，最常用的是一次性埋线针39。与自行改造针具和腰穿针相比，其使用更方便、操作更安全，是进行埋线疗法（TEAT）的理想选择。此外，实验的最终目标是改善人类健康，因此动物研究应尽可能反映临床实际情况。综上所述，建议采用一次性埋线针作为埋线工具。

羊肠线曾是经皮内固定技术（TEAT）中使用的主要缝合材料，但由于存在组织排斥反应及动物源性成分，目前已逐渐被生物合成的可吸收外科缝线所取代。缝线有多种规格，需与相应型号的针具匹配使用，例如4-0或3-0缝线使用7号针。在动物实验研究中，主要使用3-041、4-046和5-047规格的缝线。大多数缝线长度为1–2 cm。然而，啮齿类动物体型远小于人类，因此市售缝线缺乏适合其体型的尺寸。为此，研究人员必须将缝线剪切成0.2–0.5 cm的短段，以适用于啮齿类动物。因此，建议在剪切后、浸泡前，用洁净无菌的蒸馏水或生理盐水冲洗缝线，以便后续使用或立即应用，从而降低感染风险46。

一些研究对埋线方法提出了具体要求，例如将针头从穴位下方约0.5 cm处快速斜向刺入穴位48。这一点非常重要，因为啮齿类动物体型较小。除了下肢具有较丰富的肌肉组织外，其头部、背部和腹部的皮下组织及肌肉层相对较薄。因此，在动物研究中需特别强调穴位埋线疗法（TEAT）的进针点与进针角度问题。在对啮齿类动物下肢进行TEAT操作时，可直接在穴位处垂直进针。而对于躯干部位，则建议在穴位下方进针（距离可根据线体长度灵活调整），采用斜刺（<45°）或平刺（<15°）的方式，以避免损伤内脏器官。

穴位埋线疗法在阿尔茨海默病防治中的潜力
近年来，关于穴位埋线疗法（TEAT）的研究逐渐兴起，但其作用效果及机制仍不明确。如上所述，TEAT可改善阿尔茨海默病（AD）相关的多种风险因素，如肥胖13,14、糖尿病15、失眠16、绝经后骨质疏松17以及抑郁症18。TEAT对血管性痴呆（VD）大鼠的学习与记忆障碍具有改善作用19。TEAT可通过PPAR通路调节脂质代谢，从而减轻运动诱导疲劳大鼠的组织损伤49，并通过TRPV1通路在间歇性冷应激小鼠中发挥抗炎和镇痛作用50。在本研究中，我们证实了对AD样大鼠进行穴位埋线治疗可通过改善空间记忆缺失、减少海马CA1区变性细胞数量，从而缓解其学习与记忆障碍。然而，由于目前关于TEAT操作的关键要素（包括埋线方法、埋线工具、线材类型及埋线间隔时间）缺乏统一性和标准化，本文主要探讨了实验研究中TEAT的关键操作要素。本研究仅是对TEAT在AD中作用的初步探索，尚需在阐明确切的分子机制及其相互作用方面进行大量补充和完善。尽管如此，该研究为不可避免的AD进程提供了一种新的干预尝试，可能在一定程度上减轻公共卫生系统的沉重负担。

披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

本工作获得中国国家自然科学基金（NSFC）项目编号82374564（项目负责人：YJD）和编号82074566（项目负责人：YJD）、中国武汉世界针灸学会联合会孙国杰针灸传承基地项目（世界针灸学会联合会〔2019〕26号）（项目负责人：YJD）以及中国国家中医药管理局全国名老中医药专家传承工作室建设项目（国家中医药管理局〔2022〕5号）（项目负责人：YJD）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% 氯化钠溶液，4% 多聚甲醛，苏木精，伊红 Y（水溶性），无水乙醇，0.01 M 磷酸盐缓冲液干粉，二甲苯，盐酸，包埋石蜡，中性树胶国药集团（www.sinopharm.com）
5-0 可吸收外科缝线博达医疗（www.bodamedical.com）
70%酒精、碘伏、棉球用于消毒。
水合氯醛sigmaC8383
盖玻片，载玻片广州五强实验设备有限公司
脱水机武汉俊杰JT-12J型计算机化生物组织脱水机
豪华恒温加热垫Zhenhua Instruments用于维持大鼠体温。
D-半乳糖sigmaG0750
电动男士胡须修剪器用于剃除大鼠体毛。
小型动物电子秤（ZK-DST）河南智科信息技术有限公司
红霉素软膏前沿药学
玻璃培养皿用于放置切割后的可吸收缝线。
高压蒸汽灭菌器（YM100Z）上海三申医疗器械厂用于外科器械的灭菌。
制冰机（CMB40）上海舍岩仪器有限公司
显微镜（BX-53）OLYMPUS
奶粉用于MWM测试。
莫里斯水迷宫视频追踪系统 &和数据分析软件（版本：Watermaze 2.0）成都泰盟科技有限公司
6号埋线针博达医疗（www.bodamedical.com）
眼科剪、托盘、镊子
病理学切片机  （RM 2016）德国徕卡（LEICA）
戊巴比妥钠德国P11011
永久性记号笔用于标记穴位。
切片刀（R35）羽毛，日本
肥皂用于洗手。
无菌手套

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