阿尔茨海默病埋线针灸疗法的操作步骤与注意事项

摘要

本研究介绍了一种针对阿尔茨海默病样大鼠的埋线针灸治疗方案。

摘要

埋线疗法（TEAT）是一种通过将可生物降解的缝合线植入穴位，从而提供持久刺激以预防和治疗疾病的方法。TEAT操作简便，避免了常规针灸带来的不适，且能产生持续的治疗效果。本文探讨了TEAT对具有阿尔茨海默病样症状大鼠的学习与记忆能力的潜在影响。由于化学诱导的大鼠神经元变性和认知功能障碍并不能完全反映阿尔茨海默病的真实病理变化，因此，本研究团队将这些表现定义为阿尔茨海默病样症状。本研究已建立一套标准化操作流程，详细说明了头颈部及腰背部穴位的选择、操作步骤以及相关注意事项。实验共分为三组：对照组、模型组和TEAT组，每组各6只大鼠。为诱导阿尔茨海默病样症状，所有模型组和TEAT组大鼠连续7周（共49天）接受腹腔注射D-半乳糖。TEAT组大鼠随后接受穴位羊肠线埋置治疗。干预结束后，采用莫里斯水迷宫（MWM）实验评估大鼠的学习与记忆能力。随后处死大鼠并取脑组织进行病理学检查，以明确TEAT对阿尔茨海默病样症状大鼠脑部病理变化的影响。本研究表明，TEAT可能改善具有阿尔茨海默病样症状大鼠的学习与记忆功能，提示其在治疗此类神经退行性疾病方面具有潜在的应用前景。

引言

埋线针灸（TEA）是指使用特制针具将羊肠线或可吸收缝合线植入穴位的技术。该技术具有持续效应，直至缝合线被吸收和降解。它可对穴位产生连续而持久的刺激，持续时间达一周或更久¹，在无需每日重复操作的情况下达到类似疗效²。这在一定程度上减少了患者就诊次数，从而节约了医疗资源。近年来，TEA在中国的多个医学领域中应用日益广泛，包括内科、外科、皮肤科、五官科、妇科和儿科³。研究表明，该疗法对某些慢性病和复杂疾病具有长期且可靠的疗效，例如癫痫⁴和面神经麻痹⁵。其优势在于创伤小、操作简便⁶。此外，有报道显示TEA的治疗成本低于电针（EA）⁷。因此，TEA在临床和科学研究中正受到越来越多的重视。

阿尔茨海默病（AD）是一种随时间进展的神经退行性疾病。其病理生理过程在临床症状出现前约20年便已开始积累，但其机制尚未完全阐明⁸。鉴于目前可用于AD的有效药物有限，研究 increasingly 集中于该疾病的前驱期和临床前期阶段⁹。预防是应对AD发生与进展的关键策略^9,10。近年来，中医药（TCM）取得了显著进展，有望为AD的预防和治疗提供新的可能性^11,12。作为针灸的一种亚型，经皮耳穴刺激疗法（TEAT）因其治疗范围广、创伤小、操作简便、治疗频率低且疗效持久，较其他疗法更具优势⁶。新兴文献表明，TEAT可能对肥胖^13,14、糖尿病¹⁵、失眠¹⁶、绝经后骨质疏松¹⁷和抑郁症¹⁸等AD风险因素产生有益影响。此外，TEAT可通过调节线粒体自噬改善衰老大鼠的衰老状态²，改善血管性痴呆（VD）大鼠的空间学习与记忆障碍，减轻海马病理损伤，并抑制炎症反应¹⁹。因此，探讨TEAT是否也能作用于AD的病理过程显得尤为有意义。

目前的研究在埋线疗法（TEAT）操作的多个关键要素上缺乏统一性和标准化，包括埋线方法、埋线工具、缝线材料以及埋线间隔周期。这种缺乏标准化的情况影响了对治疗效果的评估和相关机制的探索，也限制了该疗法的对外推广与交流。既往研究^20,21表明，通过腹腔注射D-半乳糖（D-gal）可诱导大鼠产生类似阿尔茨海默病的病理改变，包括神经元变性和认知功能障碍。此外，电针刺激百会（GV20）和肾俞（BL23）已被证实能有效改善认知衰退，减轻神经炎症反应，并减少神经元损伤。本研究以阿尔茨海默病模型大鼠为例，介绍在此类模型下埋线疗法的选穴原则、操作流程及注意事项，并探讨实验研究中埋线疗法的关键操作环节，为今后的研究提供参考依据。

方案

所有实验均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行，并经湖北省疾病预防控制中心实验动物管理和使用委员会批准。实验共使用18只3月龄雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重为220–250 g。所有大鼠饲养于12小时光照/12小时黑暗循环、温度23 ± 1 °C、湿度40%–50%的环境中，自由摄食和饮水。经过为期一周的适应期，使大鼠适应实验室条件后，开始进行实验。

1. 模型构建

1. 实验设计如图所示 图1将18只体重为220–250 g的3月龄雌性Sprague-Dawley大鼠随机分为对照组、模型组和TEAT组，每组6只。
2. 每日于下腹部区域向模型组和TEAT组注射D-半乳糖（D-gal；120 mg/kg/天），对照组注射等量生理盐水（120 mg/kg/天），连续给药7周（49天）²²注射应在每天上午8:00至9:00之间进行。
3. 每周第7天上午9:00至10:00称量大鼠体重。实验持续49天。每14天埋植缝线一次，分别在第14^th, 28^th，和 42^nd 天。每次线程嵌入的时间固定在上午9:00至12:00之间。
4. 持续7周对大鼠腹腔注射D-半乳糖，以诱导阿尔茨海默病相关病理表现²².

2. TEAT 的准备工作

1. 对眼科剪刀、托盘和镊子等外科手术器械进行灭菌和消毒。彻底清洁手术室环境中的所有表面，并进行消毒。
2. 准备手术平台：将小型动物加热垫平铺于台面，再覆盖无菌毛巾。随后将已清洁并消毒的手术板平稳放置其上，粗糙面朝上。然后打开加热垫，将温度设定为 32 °C。
3. 手术操作选用直径为 0.6 mm 的 6 号一次性埋线针，以及长度为 2 cm 的 5-0 可吸收外科缝合线（胶原蛋白缝合线）。使用眼科剪将 2 cm 长的 5-0 可吸收缝合线剪成 0.5 cm 和 0.2 cm 的小段。将剪好的缝线浸泡于 0.9% 生理盐水中，备用。
4. 用肥皂和水洗手 20 秒，然后擦干。随后佩戴无菌手套。
5. 通过腹腔注射水合氯醛（300 mg/kg）对大鼠进行麻醉，注射部位为腹部下侧区域；当动物处于手术麻醉平面且对足趾夹捏测试无反应时，确认麻醉生效，并维持其生理状态稳定。此外，为防止大鼠在麻醉期间角膜干燥及可能的损伤，需在眼部涂抹足量的兽用眼膏，确保整个手术过程中角膜保持润滑。
   注意：建议对大鼠实施麻醉，因为穿刺过程会引发疼痛。

3. 百会穴（GV 20）埋线操作

1. 在大鼠顶骨右侧中点处定位百会穴（GV 20）（图2A）。将大鼠体位固定，充分暴露头部，向前牵拉双耳，模拟人类连接耳尖连线的方法。通过触诊颅骨中央纵向骨嵴，并确定其大致中点位置来定位百会穴（GV 20）。进一步确认该穴位位于双耳平贴头部时与头接触的水平面，即矢状缝与顶骨交汇处。使用标记笔标记百会穴（GV 20）。
2. 使用修毛器（通常为电动男士胡须修剪器）剃除大鼠穴位周围头部区域的毛发。
3. 术前用0.5%碘溶液以同心圆方式从中心向外周擦拭穴位及周围皮肤进行消毒。随后进行三次消毒：每次使用碘伏消毒后，均用酒精脱碘，确保充分去污，为无菌操作做好准备。
4. 用镊子夹取已浸泡在生理盐水中的0.2 cm可吸收外科缝线，将其置于套管针前端，然后连接针芯。
5. 一手用拇指和食指捏起百会穴（GV 20）周围的皮肤，另一手持针。
6. 捏住皮肤的同时，将针以与皮肤表面呈15°角的方向水平快速刺入，进针点位于百会穴（GV 20）下方0.1 cm处（图3A）。
7. 当针尖到达百会穴（GV 20）上方0.1 cm处时，边推进针芯边缓慢退出套管针，将0.2 cm可吸收外科缝线完全植入穴位皮下组织内（图3B）。
8. 缓慢拔出针具，确保无缝线外露。用无菌干棉球压迫针孔10秒，防止出血。若埋线后缝线位于体外，应将其取出并重新操作。

4. 肾俞穴（BL 23）埋线操作

1. 大鼠的肾俞穴（BL 23）位于第二腰椎棘突下缘旁开5 mm处^nd 腰椎（图2B）。首先，找到 6^th 根据大鼠髋结节定位腰椎，然后定位第2节^nd 通过向上计数四个椎体确定腰椎，肾俞（BL 23）位于其外侧5 mm处²³.
   注意：根据中医理论，百会（GV 20）与肾俞（BL 23）穴位组合常用于脑部疾病的预防与治疗。此前的研究已证实这一点^20,21这种配穴方法因其疗效而被确立。
2. 用记号笔标记肾俞穴（BL 23）。使用修剪器（通常为电动胡须修剪器）剃除大鼠穴位周围背部及腰部的毛发。
3. 手术前，使用0.5%碘溶液以由中心向外旋转的方式对穴位及周围皮肤进行消毒。随后进行三次消毒：每次先用碘伏消毒，再用酒精脱碘，确保手术部位充分去污，为无菌操作做好准备。
4. 使用镊子夹取浸有生理盐水的0.5 cm可吸收外科缝线，将其置于针管前端，然后连接针芯。
5. 用按压手的食指和中指或拇指与食指绷紧皮肤。持针手握住针头。
6. 快速将针垂直刺入肾俞穴（BL 23）下方0.25 cm处。见 图4A.
7. 当针尖到达皮下0.5 cm处时，调整针尖方向，使其进针方向朝向中心，与皮肤表面呈45°角，斜向刺入0.5 cm（图4B).
   注意：针刺肾俞（BL 23）时需格外谨慎，因该穴位靠近肾脏。进针过深或反复提插可能造成损伤，因此建议进针深度为0.3–0.6 cm左右。
8. 在退管的同时推进针芯，将0.5 cm可吸收外科缝线完全植入穴位的肌肉组织中图4C).
9. 缓慢拔出针头，确保无缝线外露。随后用无菌干棉球按压针孔10秒，以防止出血。若埋线后缝线位于体外，需将其取出并重新操作。

5. 术后护理

1. 术后将大鼠置于设定温度为 32°C 的小型动物加热垫上，以促进其从麻醉中恢复。在将动物送回饲养笼之前，确保其已完全清醒且状态良好。
2. 手术后，观察受影响区域在一周内是否出现无菌性炎症反应的迹象，这些迹象可能包括发红、肿胀或类似脓液的分泌物。通常情况下，这些症状无需治疗。然而，若渗出物过多，则需对患处进行引流和消毒，并涂抹红霉素软膏直至伤口完全愈合。

6. 行为学测试与组织学检查

1. 干预后第8周，进行Morris水迷宫（MWM）实验^2,24，以评估其学习和记忆能力。学习试验持续5天，每天进行4次试验。最后一次获取训练结束后24小时，进行一次探针试验。
2. 使用统计分析软件进行统计比较。采用单因素方差分析（ANOVA）及事后Tukey检验分析学习能力的行为学数据。逃逸潜伏期数据的显著性通过双因素重复测量方差分析（ANOVA）及事后Bonferroni检验进行评估。所有检验中，p <0.05被认为具有统计学意义。
3. 行为学评估结束后，按照前述方法麻醉大鼠，并通过腹腔注射150 mg/kg体重的戊巴比妥钠实施安乐死。
4. 通过血管系统灌注4%多聚甲醛固定大鼠脑组织²⁵。
   1. 灌胃针的插入与固定
      1. 准备一根12G针头，确保其笔直且适合穿过大鼠心室。定位大鼠心室（通常为左心室），将针头经心室插入升主动脉。此步骤需要精准操作及对大鼠解剖结构的充分了解。
      2. 针头就位后，使用止血钳在针头进入主动脉处附近夹紧灌胃针，以固定针头并防止其移动。
      3. 确保止血钳夹紧程度足以牢固固定针头，但不可过紧以免损伤主动脉或阻碍血流。在整个操作过程中，灌胃针应始终保持在升主动脉内，以保证灌注顺利进行。
   2. 生理盐水灌注
      1. 准备一支50 mL无针头注射器用于灌注。将位于大鼠体外的灌胃针另一端连接至装有生理盐水的注射器。
      2. 在右心耳处做一小切口，使血液能够流出心脏。此步骤可确保灌注过程中血液被生理盐水充分置换。
      3. 以稳定且恒定的速度开始向升主动脉注入生理盐水，以冲洗血液并为后续组织固定做好准备。
      4. 观察从右心耳流出的液体，并根据需要及时更换注射器，以维持持续的新鲜生理盐水灌注。
         ​针头就位后，准备进行固定液灌注。
      5. 将装有生理盐水的注射器更换为装有4%多聚甲醛的注射器（多聚甲醛是组织学中常用的固定剂），继续使用多聚甲醛进行灌注，以原位固定组织，便于后续处理与分析。
         注：在整个操作过程中，必须严格保持无菌技术以防止感染，并轻柔操作大鼠以尽量减少损伤。此外，所有操作人员均应接受相关技术培训，以确保操作的一致性和有效性。
5. 取出大鼠脑组织，置于含有4%多聚甲醛的标本瓶中，在4 °C下固定24–48小时^25,26。依次进行乙醇脱水和二甲苯处理，随后进行常规连续冠状切片（4–5 µm）以进行测量。采用苏木精-伊红（H&E）染色法（200倍放大）评估各组海马区神经元的形态学变化及神经元丢失情况。
   注：由于在整个实验期间未观察到提示胃肠道（GI）功能紊乱的临床症状，因此未对啮齿类动物进行尸检以评估胃肠道病变。动物未表现出明显的不良反应，提示不存在此类病理改变。

结果

本文介绍了在阿尔茨海默病样大鼠中进行经颅电刺激治疗（TEAT）的具体操作方法，探讨了实验研究中TEAT的关键操作要素，以为今后的研究提供参考。

经颅电刺激改善阿尔茨海默病样大鼠的学习能力
如流程图（图5）所示，在适应性训练期间，观察到各组大鼠在游泳时均会观察周围环境。游泳速度分析（图6）显示各组之间无显著差异，表明各组在运动速度和视觉感知方面的基线水平一致。实验结果中观察到的任何差异并非由运动能力或视觉感知的差异所致。

大鼠接受了5天的平台搜索训练。图7A显示，在训练的早期和晚期，各组大鼠的运动轨迹存在差异。在第2天，大多数具有逃避动机的大鼠呈随机游泳状态；而在第5天，对照组大鼠的游泳具有方向性，模型组大鼠则沿水池壁随机游动，TEAT组大鼠在目标象限的运动轨迹变得更加密集。实验检测了逃避潜伏期，潜伏期越短表明...

讨论

干预时机
阿尔茨海默病（AD）的病因复杂，其发病机制尚不明确。目前尚无对该病有效的治疗方法，且病程不可逆转。因此，学术界已达成共识，认为应重视AD的预防与治疗。AD的防治策略强调早期干预，遵循中医“治未病”的理念，注重未病先防、既病防变、瘥后防复。在人群^29,30和啮齿类动物^31,32中积累的研究表明，早期针灸和艾灸干预可在无明显副作用的情况下取得显著效果，是一种具有前景的AD防治潜在方法。因此，本研究在造模过程中即开始实施干预。TEAT在腹腔注射D-半乳糖（D-gal）的同时即开始实施。

穴位选择
阿尔茨海默病（AD）是一种严重的神经退行性疾病，主要影响负责记忆、语言、推理和社会行为的大脑区域。在中医理论中，脑（Nao）被视为髓（Sui）之海。髓（Sui）由...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 氯化钠溶液，4% 多聚甲醛，苏木精，伊红 Y（水溶性），无水乙醇，0.01 M 磷酸盐缓冲液干粉，二甲苯，盐酸，包埋石蜡，中性树胶	国药集团（www.sinopharm.com）
5-0 可吸收外科缝线	博达医疗（www.bodamedical.com）
70%酒精、碘伏、棉球			用于消毒。
水合氯醛	sigma	C8383
盖玻片，载玻片	广州五强实验设备有限公司
脱水机	武汉俊杰JT-12J型计算机化生物组织脱水机
豪华恒温加热垫	Zhenhua Instruments		用于维持大鼠体温。
D-半乳糖	sigma	G0750
电动男士胡须修剪器			用于剃除大鼠体毛。
小型动物电子秤（ZK-DST）	河南智科信息技术有限公司
红霉素软膏	前沿药学
玻璃培养皿			用于放置切割后的可吸收缝线。
高压蒸汽灭菌器（YM100Z）	上海三申医疗器械厂		用于外科器械的灭菌。
制冰机（CMB40）	上海舍岩仪器有限公司
显微镜（BX-53）	OLYMPUS
奶粉			用于MWM测试。
莫里斯水迷宫视频追踪系统 &和数据分析软件（版本：Watermaze 2.0）	成都泰盟科技有限公司
6号埋线针	博达医疗（www.bodamedical.com）
眼科剪、托盘、镊子
病理学切片机  （RM 2016）	德国徕卡（LEICA）
戊巴比妥钠	德国	P11011
永久性记号笔			用于标记穴位。
切片刀（R35）	羽毛，日本
肥皂			用于洗手。
无菌手套