小鼠圆头精子细胞注射

摘要

本文介绍了一种在小鼠中进行圆头精子细胞注射（ROSI）的方法，该技术具有潜在的临床应用价值，并可用于研究胚胎发育背后的机制。

摘要

圆形精子细胞具有单倍体遗传物质，是成熟精子的前体细胞。通过创新的圆形精子细胞注射技术（ROSI），可成功使卵母细胞受精并发育为可存活的胎儿。1995年，科学家首次利用ROSI技术成功诞生了小鼠胎儿，实现了里程碑式的突破。此后，ROSI逐渐成为解析胚胎发育复杂机制的关键工具，并在加速小鼠世代更替、制备基因修饰小鼠等多种应用中展现出重要潜力。1996年，首例通过ROSI技术诞生的人类胎儿成功出生，标志着该技术在人类生殖领域的又一重要进展。然而，该方法在临床应用中的成功率起伏不定，至今尚未在临床实践中得到广泛应用，主要原因在于其出生效率较低，且胎儿安全性尚未得到充分验证。本文系统阐述了在小鼠中实施ROSI技术的精确操作方法，旨在为相关基础研究及其潜在的临床应用提供新的见解。

引言

精子发生的最后阶段涉及将圆形的精子细胞转化为结构完整的精子，其特征是具有明显的头部、颈部和细长的尾部结构¹。这一转化过程伴随着细胞形态的显著变化，包括细胞核内染色质的浓缩、组蛋白被鱼精蛋白取代、顶体的形成、线粒体鞘的发育、中心粒的迁移与消失、尾部结构的形成以及细胞残余物的清除²。

1992年，首例通过卵胞浆内单精子注射（ICSI）技术成功诞生的人类胎儿出生³。自此以后，研究人员开始探索利用具有与成熟精子相同单倍体遗传组成的圆型精子细胞（round spermatids）来使卵母细胞受精并维持可存活妊娠的可能性^2,4。随后，1996年，首例通过圆型精子细胞注射（ROSI）技术孕育的人类胎儿顺利出生^5,6。值得注意的是，由于小鼠卵母细胞膜在注射过程中易受损伤，小鼠中的ICSI和ROSI研究进展落后于人类。这一问题随着压电膜穿刺装置（Piezo membrane-breaking device）的引入得以成功解决。因此，1995年，首只通过ROSI技术诞生的小鼠成功出生。此外，针对其他多种动物的ROSI研究也....

方案

本实验所用的 B6D2F1 (C57BL/6 x DBA/2)、C57BL/6 和 ICR 小鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司（中国北京）。所有动物处理均遵循经吉林大学第一医院实验动物伦理委员会批准的实验程序和标准（批准编号：20200435）。

1. 相关试剂的准备

1. 商业采购部分试剂，其余试剂自行配制。
   1. 获取 M₂一种用于 体外 来自供应商的圆头精子细胞（RS）、精子和卵母细胞的处理
   2. 制备 Ca²⁺无C.L. Chatot、C.A. Ziomek和B.D. Bavister（CZB）培养基用于AOA，按照先前发表的方案进行²⁰.
   3. 从供应商处获取添加氨基酸的钾离子优化培养基（KSOMaa）溶液，用于胚胎培养。
   4. 将0.1 g透明质酸酶溶解于1 mL胚胎水中，配制终浓度为0.1%（1 g/L）的透明质酸酶工作液。取10 µL浓缩储存液，溶于990 mL M中₂，可在 4 °C 下保存 1 周。
   5. 通过将1.2 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP，平均分子量为360,000）溶解于10 mL M中，配制质量浓度为12%的PVP溶液₂所得溶液可在 4 °C 下保存 1 ....

结果

我们首先通过考察卵母细胞激活（AOA）对胚胎发育能力的影响来开展研究。实验设计的示意图见图1A。在精子注射前，卵母细胞接受AOA处理（A-ICSI）或不进行处理（ICSI）。胚胎发育的详细数据见表1。结果显示，A-ICSI组与ICSI组在卵裂率、囊胚率和出生率方面均无显著差异（P > 0.05；图1B）。这些结果表明，使用10 mM SrCl₂处理20分钟的AOA方案未对胚胎的发育潜能产生影响。

先前有报道称，通过流式细胞术（FACS）或在显微镜下直接肉眼观察所筛选的ROSI胚胎，在发育效率上未见明显差异²²。本实验采用FACS技术来鉴定圆形精子细胞（RS）（图2A,B）。在显微镜下，小鼠圆形精子细胞直径约为10 µm，中央具有类似突起的核仁结构（图2C

讨论

辅助卵母细胞激活
ROSI 的一个关键前提是辅助卵母细胞激活（AOA），因为圆头精子细胞本身无法启动卵母细胞的激活。目前，在小鼠中最成熟的方法是使用氯化锶^23,24，而在人类应用中最为先进的方法则是电激活^13,14。卵母细胞激活的时机也极为重要。文献报道显示，在小鼠中最佳的激活策略是先激活卵母细胞，然后再注射圆头精子细胞²⁵。这与传统的受精过程相反，后者是精子首先进入卵母细胞，随后释放磷脂酶 C ζ 以激活卵母细胞²⁶。Satoshi Kishigami 及其同事开展的专门研究表明，ROSI 在预先激活或后激活的卵母细胞中形成雄性原核的能力存在差异。为了实现高效的后代出生率，两种操作都必须在卵母细胞进入 G1 期之前完成²⁵

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CaCl22H2O	西格玛	C7902	CZB 液体的配制
葡萄糖	西格玛	G6152	CZB 液体的配制
HEPES-Na（碱性）	西格玛	H3784	CZB 液体的配制
Hoechst 33342	碧云天	C1025	FACS
人绒毛膜促性腺激素（HCG）	宁波第二激素厂	HCG	促排卵药物
透明质酸酶	西格玛	H3506	去除卵母细胞周围的颗粒细胞
KCl	西格玛	P5405	CZB 液体的配制
KH2PO4	西格玛	P5655	CZB 液体的配制
KSOMaa	Caisson 实验室	IVL04-100ML	含氨基酸的优化钾盐单纯培养基
L-谷氨酰胺	西格玛	G8540	CZB 液体的配制
M2	西格玛	M7167-50ML	操作液
MgSO47H2O	西格玛	M1880	CZB 液体的配制
Na2-EDTA2H2O	西格玛	E5134	CZB 液体的配制
NaCl	西格玛	S5886	CZB 液体的配制
NaHCO3	西格玛	S5761	CZB 液体的配制
60% 乳酸钠糖浆，密度 = 1.32 g/L	西格玛	L7900	CZB 液体的配制
丙酮酸钠	西格玛	P4562	CZB 液体的配制
压电钻头（ICSI）	艾本德	piezoXpert	压电膜穿孔
孕马血清促性腺激素（PMSG）	宁波第二激素厂	PMSG	促排卵药物
PVA	西格玛	P8136	CZB 液体的配制