优化小鼠原代晶状体上皮细胞培养：胰蛋白酶消化的综合指南

摘要

本手稿概述了一种详细的视频实验方案，用于原代晶状体上皮细胞（LECs）的培养，旨在提高实验可重复性，并促进白内障及后囊膜混浊（PCO）相关研究。本文提供了晶状体解剖、LECs分离与鉴定的分步操作指南，尤其为该领域的新手研究人员提供了有价值的参考。

摘要

晶状体上皮细胞（LECs）在维持晶状体的稳态和正常功能中发挥多种重要作用。LECs 决定了晶状体的生长、发育、大小和透明度。相反，功能异常的 LECs 可导致白内障形成以及后囊膜混浊（PCO）。因此，建立一个稳定的原代 LEC 培养体系，对于从事晶状体发育、生物化学、白内障治疗及 PCO 预防研究的研究人员而言至关重要。然而，由于原代 LEC 来源有限、增殖速度缓慢且性质脆弱，其培养长期以来一直存在挑战。

本研究通过提供一种原代LEC培养的全面方案，解决了这些难题。该方案涵盖了优化培养基的配制、晶状体囊精确分离、胰蛋白酶消化技术、传代培养步骤、收获程序以及储存与运输指南等关键环节。在整个培养过程中，采用相差显微镜对细胞形态进行监测。

为了验证培养的晶状体上皮细胞（LECs）的真实性，通过免疫荧光检测关键晶状体蛋白αA-和γ-晶状体蛋白的存在及其亚细胞分布。该详细实验方案为研究人员提供了培养和鉴定原代LECs的宝贵资源，有助于推动对晶状体生物学的理解以及晶状体相关疾病治疗策略的开发。

引言

晶状体在视觉过程中起着至关重要的作用，它将进入眼内的光线聚焦到视网膜上。晶状体由透明且无血管的结构组成，包含多种特化细胞，其中晶状体上皮细胞（LECs）是关键组分。LECs 位于晶状体的前表面，负责维持晶状体的透明性、调节水分平衡，并参与晶状体的生长与发育^1,2。LECs 是一类位于晶状体前部的独特细胞，通过终生持续生成晶状体纤维，在维持晶状体透明性和功能方面发挥着关键作用。

白内障的特征是晶状体逐渐混浊，导致光线发生畸变和散射，从而造成视力受损^3,4。白内障形成的具体机制复杂且为多因素所致，涉及多种细胞和分子过程，如紫外线辐射、氧化损伤和糖基化^5,6。研究表明，晶状体上皮细胞（LECs）在白内障的发生发展中起着重要作用，因此成为研究的关键焦点^1,2,7,8,

方案

所有动物实验均遵循视觉与眼科研究中动物使用的研究视觉协会指南。实验程序已获得北德克萨斯健康科学中心动物护理与使用委员会的批准（方案编号：IACUC-2022-0008）。本研究使用年轻的C57BL/6J小鼠，通常年龄小于2周。

1. 培养基制备与晶状体分离

1. 在450 mL的DMEM中加入50 mL胎牛血清（FBS）和0.1 mL浓度为50 mg/mL的庆大霉素，配制培养基。
2. 人道处死小于2周龄的C57BL/6J小鼠。
   注意：我们采用CO₂吸入法进行处死。用于CO₂安乐死系统的最佳气流速率应为每分钟置换30%至70%的密闭室或笼子体积。
3. 使用手术剪小心去除眼睑，并用弯头镊子在眼眶两侧轻轻施加压力，使眼球向外突出。使用白内障手术刀在角膜上做精细切口，并用弯头镊子小心取出晶状体，确保不损伤晶状体或其囊膜。
   注意：操作这些步骤时需格外谨慎，以保持晶状体囊膜的完整性。由于晶状体结构精细，应使用具有弯曲且钝头的解剖工具，以最大限度降低晶状体损伤的风险。
4. 使用钝头弯镊将晶状体转移至一个盛有5 mL预热且无菌的、含10 µg/mL庆大霉素的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）的60 mm塑料组织培养皿中。
5. 用含10 µg/mL庆大霉素的DPBS溶液轻轻冲洗晶状体，以去除任何可能的碎片或污染物，....

结果

如图2所示，按照本方案操作，来自C57BL/6J小鼠的原代晶状体上皮细胞（LECs）在4小时内即可贴附于培养皿表面。值得注意的是，组织样本中可见少量其他组织残留，例如后囊膜片段和晶状体纤维细胞。然而，这些非目标成分无法贴壁，因此可通过更换培养基将其去除。随后，在第3至第5天之间，LECs进入增殖阶段。在第7至第10天期间，可观察到典型的对数生长期，表现为快速增殖。若细胞未能进入快速生长阶段，建议在培养基中添加生长补充剂（如EpiCGS-a）。此外，我们观察到，与含10% FBS的培养基相比，含20% FBS的培养基中细胞的生长速度更快。较低浓度的FBS通常导致生长较慢，模拟晶状体中央上皮的特性；而20% FBS浓度则可模拟晶状体增殖区的特性。

根据 Reddy 等人和 Andley 等人建立的永生化人晶状体上皮细胞系 B3 的研究，预期晶状体上皮细胞（LECs）应表达多种晶状体特异性蛋白，如 αA-和 γ-晶状体蛋白^2,

讨论

本文所述方案提供了完整、逐步的操作指南，用于成功分离、培养和传代原代晶状体上皮细胞（LECs），并配有相应的视频记录。详细的可视化指导与书面说明相结合，提高了该方案的清晰度和可及性，有助于推动领域内研究人员对该方法的使用与重复验证。最终目标是增进对LECs在白内障形成及白内障术后常见并发症——后发性白内障（PCO）中作用机制的认识，丰富相关知识体系。

与HLE-B3和SRA01/04等晶状体上皮细胞系相比，原代LEC在研究背景下各具独特的优势与挑战。HLE-B3细胞系与SRA01/04细胞系属于一类易于操作且耐受性较强的细胞系，但由于其持续复制和长期培养条件，常出现基因和表型的改变。这可能导致其功能与原始LEC存在显著差异，从而降低其反应的真实性。相比之下，原代LEC直接从患者或实验动物的活体组织中分离获得，能更准确地模拟晶状体的天然细胞环境及其固有的生物学反应。 体内尽管其提取与培养过程更为复杂，但在要求高度生理相关性的研究中，它们通常更受青睐，因为能提供更准确、可靠的结果。

在遵循本方案时，必须考虑一些关.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Thermo Fisher	#25300054	用于 LECs 解离
Alexa Fluor 488 二抗	Jackson ImmunoResearch	#715-545-150	用于细胞鉴定
Alexa Fluor 647 AffiniPure 山羊抗兔 IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-605-003	用于细胞鉴定
抗体稀释缓冲液	Licor	#927-60001	用于细胞鉴定
Beaver 安全刀	Beaver-Visitec International	#3782235	用于晶状体解剖
封闭缓冲液	Licor	#927-60001	用于细胞鉴定
前囊膜连续环形撕囊钳	Titan Medical Instruments	TMF-124	用于晶状体囊膜分离
DMEM	Sigma Aldrich	D6429	用于 LECs 培养基
DMSO	Sigma Aldrich	#D2650	用于配制冻存液
Dulbecco 磷酸盐缓冲液	Thermo Fisher	#J67802	用于晶状体解剖
Dumont 镊子	Roboz Surgical Instrument	RS-4976	用于晶状体囊膜分离
EpiCGS-a（可选）	ScienCell	4182	用于 LECs 培养基
FBS	Sigma Aldrich	F2442	用于 LECs 培养基
庆大霉素（50 mg/mL）	Sigma-Aldrich	G1397	用于 LECs 培养基
Hoechst 33342 溶液	Thermo Fisher	#62249	用于细胞鉴定
显微解剖剪	Roboz Surgical Instrument	RS-5983	用于晶状体解剖
显微解剖镊	Roboz Surgical Instrument	RS5137	用于晶状体解剖
PROX1 抗体	Thermo Fisher	11067-2-AP	用于细胞鉴定
Vannas 显微弹簧解剖剪	Roboz Surgical Instrument	RS-5608	用于晶状体囊膜分离
αA-晶状体蛋白抗体	Santa Cruz	sc-28306	用于细胞鉴定
γ-晶状体蛋白抗体	Santa Cruz	sc-365256	用于细胞鉴定