优化小鼠原代晶状体上皮细胞培养：胰蛋白酶消化的综合指南

摘要

本手稿概述了一种详细的视频实验方案，用于原代晶状体上皮细胞（LECs）的培养，旨在提高实验可重复性，并促进白内障及后囊膜混浊（PCO）相关研究。本文提供了晶状体解剖、LECs分离与鉴定的分步操作指南，尤其为该领域的新手研究人员提供了有价值的参考。

摘要

晶状体上皮细胞（LECs）在维持晶状体的稳态和正常功能中发挥多种重要作用。LECs 决定了晶状体的生长、发育、大小和透明度。相反，功能异常的 LECs 可导致白内障形成以及后囊膜混浊（PCO）。因此，建立一个稳定的原代 LEC 培养体系，对于从事晶状体发育、生物化学、白内障治疗及 PCO 预防研究的研究人员而言至关重要。然而，由于原代 LEC 来源有限、增殖速度缓慢且性质脆弱，其培养长期以来一直存在挑战。

本研究通过提供一种原代LEC培养的全面方案，解决了这些难题。该方案涵盖了优化培养基的配制、晶状体囊精确分离、胰蛋白酶消化技术、传代培养步骤、收获程序以及储存与运输指南等关键环节。在整个培养过程中，采用相差显微镜对细胞形态进行监测。

为了验证培养的晶状体上皮细胞（LECs）的真实性，通过免疫荧光检测关键晶状体蛋白αA-和γ-晶状体蛋白的存在及其亚细胞分布。该详细实验方案为研究人员提供了培养和鉴定原代LECs的宝贵资源，有助于推动对晶状体生物学的理解以及晶状体相关疾病治疗策略的开发。

引言

晶状体在视觉过程中起着至关重要的作用，它将进入眼内的光线聚焦到视网膜上。晶状体由透明且无血管的结构组成，包含多种特化细胞，其中晶状体上皮细胞（LECs）是关键组分。LECs 位于晶状体的前表面，负责维持晶状体的透明性、调节水分平衡，并参与晶状体的生长与发育^1,2。LECs 是一类位于晶状体前部的独特细胞，通过终生持续生成晶状体纤维，在维持晶状体透明性和功能方面发挥着关键作用。

白内障的特征是晶状体逐渐混浊，导致光线发生畸变和散射，从而造成视力受损^3,4。白内障形成的具体机制复杂且为多因素所致，涉及多种细胞和分子过程，如紫外线辐射、氧化损伤和糖基化^5,6。研究表明，晶状体上皮细胞（LECs）在白内障的发生发展中起着重要作用，因此成为研究的关键焦点^1,2,7,8,9。

此外，目前眼科学中最紧迫的问题之一是后囊膜混浊（PCO），也称为继发性白内障，其发生率相对较高。PCO 仍是白内障手术后最常见的并发症，在成人患者中术后5年内发生率高达20–40%，而在儿童中则可达100%¹⁰。PCO 主要由白内障摘除术后残留在晶状体囊袋内的晶状体上皮细胞（LECs）引起。这些细胞经历复杂的病理生理学转变，不仅涉及上皮-间质转化（EMT），还包括 LECs 向晶状体纤维的分化，最终形成由 LECs、纤维细胞和肌成纤维细胞混合组成的细胞群体^11,12,13。转化后的细胞在后囊膜上增殖并迁移，导致视力受损。通过体外培养模型研究 LECs 的行为及其调控机制，可为预防和治疗 PCO 提供重要见解。因此，该 LECs 培养方案为眼科研究人员提供了一种关键工具，有助于深入研究、理解并最终应对这一常见的术后并发症。

为了揭示晶状体上皮细胞生物学的复杂性及其在白内障形成和后发性白内障中的作用，建立可靠且可重复的实验方法至关重要 体外 原代细胞培养系统。原代LEC培养为研究者提供了可控的环境，用于研究LEC的功能、信号传导及分子特性。此外，它还能够用于探究细胞过程以及不同实验条件的影响，为晶状体生理学和病理学提供有价值的见解。

既往研究已加深了我们对淋巴管内皮细胞（LEC）培养技术的理解^{14,15,16,17,18,19,20}。尽管这些研究采用了多种方法，并在LEC的行为和特性方面取得了重要发现，但目前文献中尚缺乏一套全面且易于获取的LEC培养视频操作规程。这一局限性可能阻碍新手研究人员准确重复相关技术，导致实验结果出现不一致和变异。本研究论文旨在通过提供视频操作规程，弥补这一空白，建立标准化资源，以提高LEC培养领域的可重复性，并促进知识的传递。

方案

所有动物实验均遵循视觉与眼科研究中动物使用的研究视觉协会指南。实验程序已获得北德克萨斯健康科学中心动物护理与使用委员会的批准（方案编号：IACUC-2022-0008）。本研究使用年轻的C57BL/6J小鼠，通常年龄小于2周。

1. 培养基制备与晶状体分离

1. 在450 mL的DMEM中加入50 mL胎牛血清（FBS）和0.1 mL浓度为50 mg/mL的庆大霉素，配制培养基。
2. 人道处死小于2周龄的C57BL/6J小鼠。
   注意：我们采用CO₂吸入法进行处死。用于CO₂安乐死系统的最佳气流速率应为每分钟置换30%至70%的密闭室或笼子体积。
3. 使用手术剪小心去除眼睑，并用弯头镊子在眼眶两侧轻轻施加压力，使眼球向外突出。使用白内障手术刀在角膜上做精细切口，并用弯头镊子小心取出晶状体，确保不损伤晶状体或其囊膜。
   注意：操作这些步骤时需格外谨慎，以保持晶状体囊膜的完整性。由于晶状体结构精细，应使用具有弯曲且钝头的解剖工具，以最大限度降低晶状体损伤的风险。
4. 使用钝头弯镊将晶状体转移至一个盛有5 mL预热且无菌的、含10 µg/mL庆大霉素的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）的60 mm塑料组织培养皿中。
5. 用含10 µg/mL庆大霉素的DPBS溶液轻轻冲洗晶状体，以去除任何可能的碎片或污染物，为后续处理做好准备，并维持无菌的培养环境。
6. 为获得足够数量的晶状体上皮细胞（LEC），每24孔培养板使用4个晶状体合并培养，每6孔培养板使用6个晶状体合并培养。

2. 肝窦内皮细胞（LECs）的分离

1. 完成冲洗过程后，将晶状体置于滤纸上，使其自然干燥。
2. 待晶状体充分干燥后，小心将其转移至培养皿盖上，以备进行晶状体囊膜剥离。
3. 将晶状体翻转至正面朝上，确保前段朝上。用镊子夹住前囊膜的同时，主手使用撕囊钳在囊膜上制造一个小撕口。轻轻将两件工具向相反方向拉动，以去除囊膜，并将剥离的囊膜置于DPBS中，直至所有晶状体解剖操作完成。
   注意：为避免实验偏差，研究人员应立即对每一片晶状体上皮囊膜进行解剖，并暂时保存于DPBS中。只有在完成全部解剖操作后，才将所有囊膜统一转移至37 °C预热的胰蛋白酶溶液中，以确保消化过程同步且均匀。
4. 小心将晶状体囊膜转移至6孔板中。每孔加入1 mL 0.05%胰蛋白酶溶液，以启动酶消化过程。
5. 轻轻振荡胰蛋白酶溶液，确保其均匀渗透。将培养板放入细胞培养箱中，在37 °C条件下消化8–10分钟。
   注意：此步骤有助于晶状体囊膜组织的分解，以及随后单个上皮细胞的释放。
6. 孵育结束后，使用解剖剪小心剪碎已消化的晶状体囊膜，以破坏任何残留的组织团块，促进细胞分离。
   注意：应充分剪碎组织，以确保从消化后的晶状体囊膜中高效释放细胞。
7. 加入0.5 mL含10% FBS的培养基以中和胰蛋白酶活性。将组织样本转移至离心管中，以1,000 × g 离心5分钟。
8. 小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。用1 mL培养基重悬细胞，并将细胞接种至24孔板中。
9. 每2–3天更换一次培养基。

3. LEC 的传代培养

1. 当细胞达到汇合状态时，移除培养皿中的培养基。随后用 1 mL DPBS 洗涤细胞 2 次。
2. 加入 200 µL 胰蛋白酶-EDTA 溶液，将细胞放入培养箱中孵育 5 分钟。
3. 孵育结束后，从培养箱中取出细胞，在显微镜下观察，确认细胞已从培养皿表面脱落并开始漂浮。
4. 加入 1 mL 培养基，轻轻吹打细胞 3–5 次，以确保所有细胞完全脱落。
5. 将细胞转移至离心管中，在 1,000 × g 条件下离心 5 分钟。
6. 小心吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于完全培养基中。
7. 如有需要，使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。
8. 按 1:2 或 1:3 的比例分装细胞悬液，用于传代培养。
9. 当培养物再次达到汇合状态时，重复上述操作。
   ​注意：LEC 在高密度培养条件下生长良好。避免过度稀释细胞，以免影响其生长。

4. 储存与运输

注意：保存细胞的理想数量约为 1 × 10⁶ 个。

1. 用 1 mL DPBS 将细胞彻底清洗 3 次。清洗后，加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液，将细胞置于培养箱中孵育 5 分钟。
2. 加入 2 mL 完全培养基，将细胞悬液转移至离心管中，在 1,000 × g 条件下离心 5 分钟。
3. 弃去上清液，将细胞重悬于由 90% FBS 和 10% DMSO 组成的冻存液中，调整细胞密度至 1 × 10⁶ 个细胞/mL。将细胞悬液转移至冻存管中。
4. 立即将细胞置于 -20 °C 环境中 1 小时，随后在 -80 °C 过夜，之后转移至液氮中长期保存。
   NOTE: 若无液氮，细胞可在 -20 °C 放置 1 小时后，于 -80 °C 保存。
5. 如需运输，应将装有细胞的冻存管置于含干冰的包装中，进行次日达运输。
6. 收到细胞后，应尽快复苏并进行传代培养。若无法立即培养，应将细胞转移至液氮中长期保存。
   ​NOTE: 若需运输细胞，应确保样本深埋于干冰中，以防止温度波动造成潜在损伤。

5. LEC 的验证

1. 将LEC接种于含盖玻片的35 mm培养皿中，培养约48小时。
2. 用PBS洗涤细胞2次，加入冷甲醇于-20 °C固定10分钟。
3. 用PBS洗涤固定后的细胞3次，每次5分钟，然后在室温下用封闭缓冲液孵育1小时，以防止非特异性结合。
4. 封闭后，分别将αA-晶状体蛋白抗体、γ-晶状体蛋白抗体和PROX1抗体按1:50比例用稀释缓冲液稀释，于4 °C与细胞共孵育过夜。
5. 用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟，然后加入按1:100比例用稀释缓冲液稀释的二抗，孵育1小时。
6. 用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟，再加入5 µg/mL Hoechst 33342染色液（溶于PBS），室温染色10分钟以显示细胞核。
7. 用PBS洗涤细胞2次，每次5分钟，以去除多余的染色液，然后使用荧光显微镜采集图像，其中细胞核使用DAPI通道检测，αA-晶状体蛋白、γ-晶状体蛋白和PROX1使用FITC通道检测。

结果

如图2所示，按照本方案操作，来自C57BL/6J小鼠的原代LEC在4小时内即可贴附于培养皿表面。值得注意的是，样本中可见少量其他组织残留，例如晶状体后囊片段和晶状体纤维细胞。然而，这些非目标成分无法贴壁，因此可通过更换培养基将其去除。随后，在第3至第5天之间，LEC进入增殖阶段。在第7至第10天期间，可观察到典型的对数生长期特征，即细胞快速增殖。若细胞未能进入快速生长阶段，建议在培养基中添加生长补充剂（如EpiCGS-a）。此外，我们观察到，与含10% FBS的培养基相比，含20% FBS的培养基中细胞生长速度更快。较低浓度的FBS通常导致较慢的增殖速率，模拟晶状体中央上皮的特性；而20% FBS浓度则可模拟晶状体增殖区的特性。

根据 Reddy 等人和 Andley 等人建立的永生化人晶状体上皮细胞系 B3，预期晶状体上皮细胞（LECs）应表达多种晶状体特异性蛋白，如 αA-和 γ-晶状体蛋白^2,21。因此，在本研究中，我们采用 αA-和 γ-晶状体蛋白作为细胞标志物，以验证细胞的身份为晶状体上皮细胞。前三代以内的 LECs 被培养在玻璃盖玻片上。使用针对 αA-和 γ-晶状体蛋白的特异性一抗对细胞进行过夜孵育。如图3所示，这些细胞均强烈表达 αA-和 γ-晶状体蛋白，提供了明确证据表明其为晶状体来源的上皮细胞。此外，我们使用 PROX1 作为纤维细胞的明确标志物对原代 LECs 进行标记。结果显示，这些 LECs 对 PROX1 呈阴性染色，证实这些细胞为上皮细胞，尚未分化为纤维细胞。

图 1：晶状体上皮细胞（LEC）培养的逐步操作流程。 该图展示了原代晶状体上皮细胞培养所涉及的连续步骤。第1步是在前囊膜上制造一个小的撕裂口。第2步是轻柔地取出晶状体囊膜。在第3步中，将晶状体囊膜小心转移至24孔板，并在37 °C下用0.05%胰蛋白酶溶液孵育10分钟。孵育后，使用解剖剪将消化后的晶状体囊膜剪碎，以促进细胞分离。第4步是通过向离心管中加入0.5 mL含20%胎牛血清（FBS）的培养基来终止胰蛋白酶反应，并将组织样本在1,000 × g 下离心5分钟。第5步要求将细胞重悬于1 mL培养基中，并接种至24孔板。最后，第6步是在整个实验过程中每隔2–3天更换一次培养基，以支持细胞的生长与维持。缩写：LECs = 晶状体上皮细胞；FBS = 胎牛血清。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：LEC随时间推移的生长模式。 使用相差显微镜记录了原代晶状体上皮细胞在不同时间点生长过程中的形态学变化。第1、2、3、5、7和10天拍摄的图像展示了细胞形态的动态演变，有助于了解晶状体上皮细胞随时间的发育过程和行为特征。红色箭头指示活跃增殖的晶状体上皮细胞的位置。比例尺 = 100 µm。缩写：LECs = lens epithelial cells。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：LECs的鉴定。（A）小鼠LECs中αA-晶状体蛋白的免疫染色。原代小鼠LECs用Hoechst 33342（蓝色）和αA-晶状体蛋白抗体（绿色）染色。（B）小鼠LECs中γ-晶状体蛋白的免疫染色。（C）小鼠LECs中PROX1的免疫染色。原代小鼠LECs用Hoechst 33342（蓝色）和PROX1抗体（绿色）染色。比例尺 = 50 µm。缩写：LECs = 晶状体上皮细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文所述方案提供了完整、逐步的操作指南，用于成功分离、培养和传代原代晶状体上皮细胞（LECs），并配有相应的视频记录。详细的可视化指导与书面说明相结合，提高了该方案的清晰度和可及性，有助于推动领域内研究人员对该方法的使用与重复验证。最终目标是增进对LECs在白内障形成及白内障术后常见并发症——后发性白内障（PCO）中作用机制的认识，丰富相关知识体系。

与HLE-B3和SRA01/04等晶状体上皮细胞系相比，原代LEC在研究背景下各具独特的优势与挑战。HLE-B3细胞系与SRA01/04细胞系属于一类易于操作且耐受性较强的细胞系，但由于其持续复制和长期培养条件，常出现基因和表型的改变。这可能导致其功能与原始LEC存在显著差异，从而降低其反应的真实性。相比之下，原代LEC直接从患者或实验动物的活体组织中分离获得，能更准确地模拟晶状体的天然细胞环境及其固有的生物学反应。 体内尽管其提取与培养过程更为复杂，但在要求高度生理相关性的研究中，它们通常更受青睐，因为能提供更准确、可靠的结果。

在遵循本方案时，必须考虑一些关键点。本研究使用了年轻的C57BL/6J小鼠，通常为2周龄以下。我们观察到，从这些年轻小鼠中分离的LEC比2月龄及以上小鼠的LEC表现出更旺盛的生长能力。这表明小鼠年龄与细胞生长之间存在负相关关系。

从小鼠眼球中分离晶状体是一项精细的操作，需要谨慎使用解剖工具，以保持晶状体及其囊膜的完整性。第1部分实验方案中所述的步骤可确保晶状体被成功取出且损伤最小。尽管维持晶状体囊膜的健康与完整性具有挑战性，但其重要性不容忽视，因为任何损伤都可能影响所分离的晶状体上皮细胞（LECs）的质量和数量。值得注意的是，细胞分裂通常主要发生在晶状体赤道区附近的生发区，而该区域不易用于培养。根据Zetterberg等人的研究，尽管在正常情况下晶状体上皮中央区域的有丝分裂活性较低，但利用氚标记胸腺嘧啶核苷（³H-Tdr）标记的实验已将这些位于中央区域的晶状体上皮细胞标记为潜在的干细胞^17,22。干细胞具有独特的特征，例如在标准条件下增殖速率较低，但仍具备无限增殖的能力。因此，与生发区相比，晶状体上皮的中央区域可能更能代表LECs的增殖潜能。

如方案第2节所述，晶状体上皮细胞（LEC）的分离是本实验过程中的关键步骤。通过仔细执行去除晶状体囊膜、酶消化和组织破碎等关键操作，可将单个上皮细胞从囊膜中分离出来。该过程中一个关键因素是胰蛋白酶消化的时间。建议将消化时间控制在8至10分钟之间。若时间缩短至不足5分钟，可能导致细胞分离不完全；反之，若时间过长，则可能显著影响细胞活力。选择胰蛋白酶-EDTA作为细胞解离试剂，并结合添加20%胎牛血清（FBS）和10 µg/mL庆大霉素的DMEM培养基，可在促进细胞释放和后续增殖的同时，有效降低潜在的污染风险。

抗生素常用于预防原代LEC培养过程中的细菌污染。然而，抗生素的选择应谨慎。常用的抗生素（如青霉素和链霉素）以及抗真菌试剂可能影响LEC的存活率。作为替代方案，建议使用浓度为10 µg/mL的庆大霉素溶液，以获得最佳的LEC生长效果。

此外，保持较高的细胞密度是成功培养原代淋巴管内皮细胞（LEC）的另一个关键因素。与永生化细胞系不同，原代LEC需要更高的细胞密度才能实现最佳生长。这主要归因于其依赖有效的细胞间通讯，这种通讯通过直接接触或旁分泌信号传导实现，有助于维持细胞的分化状态和功能。较高的细胞密度还有助于减轻不利因素的影响 "文化冲击，" 原代细胞在分离并置于体外环境时所经历的一种状态 体外 环境与其显著不同 体内 起源²³. 通过模拟一种更 体内类环境，高细胞密度可提高细胞存活率。此外，这种密度有助于建立生长因子和细胞因子的浓度梯度，从而支持细胞的生长与功能。由于许多原代细胞为贴壁依赖性细胞，需附着于表面才能增殖，较高的细胞密度可提供足够的邻近细胞用于黏附，进而促进健康生长。因此，由于细胞密度对细胞间通讯、存活和增殖具有显著影响，在原代细胞培养过程中调控细胞密度是一项关键考虑因素。建议选用较小的培养皿，如24孔板或6孔板，以为淋巴内皮细胞（LECs）创造理想的培养环境。按照本方案操作，通常可在培养后约10–14天获得融合状态的LECs。建议在较低代次（理想范围为P0至P6）使用LECs，以确保实验中细胞行为的自然性。当细胞代次超过7–10代时，LECs可能出现增殖能力下降，并对实验条件的反应不同于低代次细胞。

血清浓度与细胞生长速率直接相关。较低的胎牛血清（FBS）浓度更可能诱导较慢的生长，类似于中央上皮的特征。相比之下，较高的FBS浓度则模拟了增殖区的条件。如果细胞生长缓慢，例如在需要从年老或基因修饰动物中分离角膜上皮细胞（LEC）时可能发生的情况，则可考虑将FBS浓度提高至20%，或在培养基中添加如EpiCGS-a（5 mL，参见材料表）之类的生长补充剂。这种血清和补充剂的富集可增强细胞增殖，促进上皮细胞的最佳生长。

储存与运输方案（方案第5部分）考虑了活细胞保存和运输过程中面临的挑战。冻存液的选择对于淋巴内皮细胞（LEC）在储存和运输期间的存活至关重要。我们尝试了多种不同的冻存液，包括70%完全培养基 + 20%胎牛血清（FBS） + 10%二甲基亚砜（DMSO）；90% FBS + 10% DMSO；以及无DMSO和无血清的冻存液。实验结果表明，由10% DMSO和90% FBS组成的溶液在维持细胞活力方面表现更优。采用这一特定配方，我们已成功将原代LEC在-80 °C条件下储存超过10年，证明了该方法的稳定性及其在冻存后恢复细胞活性的能力。

αA-晶状体蛋白和γ-晶状体蛋白被用作晶状体上皮细胞（LECs）的标志物。PROX1 被用作晶状体纤维细胞的标志物。其他标志物如 PAX6、FOXE3 和 E-钙黏蛋白也可用于表征 LEC 表型。如果研究人员希望研究上皮-间质转化（EMT），应使用αSMA作为标志物。必须根据具体实验需求以及所用抗体的推荐说明，调整孵育时间和稀释比例。

尽管本研究提出了一种培养原代晶状体上皮细胞（LECs）的可靠方法，但仍需承认其局限性。虽然最初分离的细胞为原代LECs，但任何传代培养、胰酶消化及复苏操作均会导致其状态发生改变。我们设计的方案主要采用小鼠晶状体作为LECs的来源；然而，LECs也可从其他资源中培养获得，包括白内障患者样本、眼库眼球，或患有不同眼部疾病（如青光眼和糖尿病视网膜病变）的患者样本^17,24。来自年长个体或具有特定眼部疾病状况的个体所获取的LECs，可能无法像来自较年轻、健康状况更佳的个体的细胞那样有效地遵循本方案。从年长个体或基因修饰个体或动物中培养LECs可能需要优化培养基，例如将胎牛血清（FBS）浓度提高至20%，或添加额外的生长因子。此外，Menko等人先前对原代鸡胚晶状体上皮细胞培养的研究表明，在培养第二天后即出现自发性分化现象²⁵。因此，研究人员应谨慎对待方法学上的差异，尤其是在以研究分化为主要研究目标时需特别注意。

培养原代晶状体上皮细胞（LEC）可采用多种方法。例如，Ibaraki 等人、Sundelin 等人以及 Andjelic 等人建立的方法，均涉及在白内障手术中获取晶状体囊膜前部，并将其直接接种于培养皿中以培养原代 LEC^16,17,19,20。该方法可维持细胞间天然的细胞连接及细胞外基质，具有较高的生理相关性，对于后发性白内障（PCO）等研究条件尤为重要。另一种替代方法为晶状体组织块培养法，如 Zelenka 等人所述，该方法可保留天然的组织结构，适用于更具生理相关性的研究，尤其有利于探索 LEC 的终末分化、细胞间相互作用以及晶状体发育过程，从而深入理解分化过程中连续的细胞与分子事件²⁶。

相比之下，本方案中所述的胰蛋白酶消化法可产生均一的单细胞悬液，便于实现均匀接种和精确的细胞计数，这对于细胞活力和增殖实验、药物筛选以及细胞信号通路分析等特定实验具有优势。然而，必须认识到，尽管该方法因获得均一的细胞群体而有利于开展可控且精确的研究，但由于经过酶处理，可能改变细胞行为，并削弱组织块培养法和直接培养法中所具有的生理相关性。对于仅专注于上皮细胞研究的研究人员而言，该方法具有高度适用性和便利性，可提供关于这些细胞特性和行为的可靠信息。然而，对于研究问题涉及细胞分化的科研人员，则必须考虑采用组织块培养等替代方法，或对该方法进行调整和优化，以涵盖这些研究方面。

总体而言，本实验方案在设计时充分考虑了晶状体上皮细胞（LECs）的特定需求和要求。从解剖到验证的每一步操作，均经过精心设计，以维持细胞的存活能力与功能特性。因此，该方案可为研究LECs及其在眼部生理与病理过程中作用的研究人员提供有价值的参考。未来的研究可在此基础上调整和改进该方案，以探索LEC生物学的不同方面，为深入理解晶状体相关疾病以及开发白内障和后发性白内障（PCO）预防的新治疗策略提供平台。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Thermo Fisher	#25300054	用于 LECs 解离
Alexa Fluor 488 二抗	Jackson ImmunoResearch	#715-545-150	用于细胞鉴定
Alexa Fluor 647 AffiniPure 山羊抗兔 IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-605-003	用于细胞鉴定
抗体稀释缓冲液	Licor	#927-60001	用于细胞鉴定
Beaver 安全刀	Beaver-Visitec International	#3782235	用于晶状体解剖
封闭缓冲液	Licor	#927-60001	用于细胞鉴定
前囊膜连续环形撕囊钳	Titan Medical Instruments	TMF-124	用于晶状体囊膜分离
DMEM	Sigma Aldrich	D6429	用于 LECs 培养基
DMSO	Sigma Aldrich	#D2650	用于配制冻存液
Dulbecco 磷酸盐缓冲液	Thermo Fisher	#J67802	用于晶状体解剖
Dumont 镊子	Roboz Surgical Instrument	RS-4976	用于晶状体囊膜分离
EpiCGS-a（可选）	ScienCell	4182	用于 LECs 培养基
FBS	Sigma Aldrich	F2442	用于 LECs 培养基
庆大霉素（50 mg/mL）	Sigma-Aldrich	G1397	用于 LECs 培养基
Hoechst 33342 溶液	Thermo Fisher	#62249	用于细胞鉴定
显微解剖剪	Roboz Surgical Instrument	RS-5983	用于晶状体解剖
显微解剖镊	Roboz Surgical Instrument	RS5137	用于晶状体解剖
PROX1 抗体	Thermo Fisher	11067-2-AP	用于细胞鉴定
Vannas 显微弹簧解剖剪	Roboz Surgical Instrument	RS-5608	用于晶状体囊膜分离
αA-晶状体蛋白抗体	Santa Cruz	sc-28306	用于细胞鉴定
γ-晶状体蛋白抗体	Santa Cruz	sc-365256	用于细胞鉴定