血脑屏障的重建 体外 用于建模及治疗性靶向神经系统疾病

Camille Goldman; Natalie Suhy; Jessica E. Schwarz; Emily Ruth Sartori; Rikki B. Rooklin; Braxton R. Schuldt; Louise A. Mesentier-Louro; Joel W. Blanchard

doi:10.3791/65921

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方法文章

血脑屏障的重建体外用于建模及治疗性靶向神经系统疾病

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DOI：

10.3791/65921

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2023年10月20日

Camille Goldman^*¹^,²^,³^,⁴^,⁵ , Natalie Suhy^*¹^,²^,³^,⁴^,⁵ , Jessica E. Schwarz¹^,²^,³^,⁴^,⁵ , Emily Ruth Sartori¹^,²^,³^,⁴^,⁵ , Rikki B. Rooklin¹^,²^,³^,⁴^,⁵ , Braxton R. Schuldt¹^,²^,³^,⁴^,⁵ , Louise A. Mesentier-Louro¹^,²^,³^,⁴^,⁵ , Joel W. Blanchard¹^,²^,³^,⁴^,⁵

¹Icahn School of Medicine at Mount Sinai, ²Black Family Stem Cell Institute at Mount Sinai, ³Ronald M. Loeb Center for Alzheimer’s Disease at Mount Sinai, ⁴Friedman Brain Institute at Mount Sinai, ⁵Nash Family Department of Neuroscience at Mount Sinai

^* These authors contributed equally

本文内容

摘要

血脑屏障（BBB）在维持稳定且健康的脑环境方面起着至关重要的作用。BBB功能障碍与多种神经系统疾病相关。我们开发了一种源自干细胞的三维血脑屏障模型，用于研究脑血管病理、血脑屏障完整性，以及遗传因素和疾病如何改变血脑屏障。

摘要

血脑屏障（BBB）是中枢神经系统（CNS）的关键生理结构，负责维持营养物质、清除代谢废物并保护大脑免受病原体侵袭。BBB固有的屏障特性为治疗神经系统疾病的药物向CNS递送带来了挑战。BBB功能受损与多种神经系统疾病相关。脑淀粉样血管病（CAA）表现为淀粉样物质在脑血管系统的沉积，导致BBB功能受损，大多数阿尔茨海默病（AD）病例中均伴有CAA，提示BBB功能障碍或破坏可能参与了神经退行性病变的发生。由于难以获取人源BBB组织，目前对维持BBB正常功能及导致其退变的机制仍不明确。为克服这些局限，我们开发了一种源自人多能干细胞的BBB模型（iBBB），该模型在三维基质中整合了内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞。iBBB可自发组装，重现BBB的解剖结构和细胞间相互作用。在iBBB中接种淀粉样蛋白可模拟CAA的关键特征。此外，iBBB提供了一个灵活的平台，可用于调控与脑血管疾病和神经退行性病变相关的遗传与环境因素，从而研究遗传背景和生活方式如何影响疾病风险。最后，iBBB可用于药物筛选和药物化学研究，以优化治疗策略。递送至中枢神经系统。在本方案中，我们描述了由人多能干细胞分化而来的三种细胞类型（内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞）的分化方法，如何将这些分化后的细胞组装成诱导型血脑屏障（iBBB），以及如何建立淀粉样蛋白血管病（CAA）模型体外使用外源性淀粉样蛋白。该模型克服了研究活体人脑组织的难题，提供了一个兼具生物学保真度和实验灵活性的系统，能够探究人血脑屏障（BBB）及其在神经退行性变中的作用。

引言

血脑屏障（BBB）是一个关键的微血管网络，将中枢神经系统（CNS）与外周系统分隔开来，以维持神经元正常功能所需的理想环境。它在调控物质向中枢神经系统的流入和流出方面发挥着关键作用，包括维持代谢稳态¹^,²^,³^,⁴、清除代谢废物⁴^,⁵^,⁶，以及保护大脑免受病原体和毒素侵害⁷^,⁸。

血脑屏障（BBB）的主要细胞类型是内皮细胞（EC）。内皮细胞起源于中胚层谱系，构成血管系统的管壁¹^,⁹。微血管内皮细胞之间形成紧密连接，显著降低其膜的通透性¹⁰^,¹¹^,

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方案

1. 将iPSCs分化为iBBB细胞

注意：这些分化方案此前已在 Mesentier-Louro 等人的研究中描述过³⁴。

包被细胞培养板
1. 在 4 °C 下过夜解冻低生长因子（GF）基底膜基质。将 500 µL 基底膜基质加入 49.5 mL DMEM 中稀释。保持该溶液低温，以防止包被液过早聚合。
2. 向 6 孔组织培养处理板的每孔中加入 1–2 mL。在 37 °C 下孵育至少 20 分钟后，更换为预热的适当培养基。
将人诱导多能干细胞（iPSCs）分化为 ETV2 诱导型内皮细胞
耗时：8 天
注：本方案改编自 Blanchard 等人²⁴ 和 Qian 等人³⁵。我们采用 Wang 等人³⁶ 所述的强力霉素诱导转录因子 ETV2 表达，以提高产量。ETV2 通过 PiggyBac 质粒导入，并对细胞进行转染。
1. 在低生长因子基底膜基质包被的培养板上，使用无饲养层的多能干细胞培养基培养 iPSCs，直至细胞汇合度达到约 70%。
  注：建议对诱导型 iPSCs 维持 Pig....

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结果

形态正常的iBBB会凝固成一个半透明的圆盘状结构（图3A）。iBBB在培养数天后从最初接种的表面脱落是正常现象，虽无法避免，但只要在更换培养基时小心操作，避免意外吸走iBBB，便不会对其正常形成造成严重影响。接种24小时后，可在明场显微镜下观察到分布均匀的单个细胞（图3B）。培养两周后，可能观察到更明显的结构，但其细节仍难以清晰分辨（图3C）。

iBBB的质量高度依赖于输入细胞分化质量。我们强烈建议将部分剩余细胞接种于二维单层培养体系中，进行固定并染色检测细胞类型特异性标志物。由超过70%表达PECAM1或VE-cadherin的内皮细胞（图2A）、超过95%表达PDGFRB的周细胞（图2B）以及超过95%表达S100B和CD44的星形胶质细胞（.......

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讨论

血脑屏障功能障碍是多种神经系统疾病的共病因素，且可能作为病因或加重因素⁷^,⁴⁰^,⁴¹然而，几乎不可能在患有神经血管疾病的人类中研究血脑屏障功能障碍和破坏背后的分子与细胞生物学机制。本方案中介绍的可诱导血脑屏障（iBBB）提供了一种体外可重现血脑屏障（BBB）关键细胞相互作用的系统，包括血管管腔形成以及星形胶质细胞终足与血管系统的定位。该体外血脑屏障模型（iBBB）可用于研究BBB功能障碍各个阶段所涉及的分子通路，并可模拟神经血管疾病的表型，如脑淀粉样血管病中出现的淀粉样-β蛋白聚集。

iBBB 的构建过程较为直接，但 iBBB 的质量在很大程度上取决于所用 iPSC 分化细胞的质量。尽管 iBBB 可提供一种多细胞微环境，促进各组分细胞的成熟，但在包封前每种细胞类型都必须经过正确的定向分化。对每种分化细胞进行质量检测至关重要，应通过对单细胞培养物进行细胞类型特异性标志物的免疫.......

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）3-UG3-NS115064-01、R01NS14239、治愈阿尔茨海默病基金会（Cure Alzheimer's Fund）、美国国家航空航天局（NASA）80ARCO22CA004、陈-扎克伯格倡议（Chan-Zuckerberg Initiative）、迈克尔·J·福克斯基金会/加速帕金森研究联盟（MJFF/ASAP Foundation）以及美国脑损伤协会（Brain Injury Association of America）资助。C.G. 获美国国立卫生研究院 F31NS130909 项目支持。图1A 使用 BioRender.com 制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
6e10 淀粉样蛋白-β 抗体	Biolegend	SIG-39320	使用稀释比例为 1:1000
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
Activin A	Peprotech	20-14E
Alexa Fluor 488、555、647 二抗	Invitrogen	Various	使用稀释比例为 1:1000
淀粉样蛋白-β 40 纤维	AnaSpec	AS-24235
淀粉样蛋白-β 42 纤维	AnaSpec	AS-20276
Aquaporin-4 抗体	Invitrogen	PA5-53234	使用稀释比例为 1:300
星形胶质细胞基础培养基及添加剂	ScienCell	1801
B-27 无血清添加剂	Gibco	17504044
BMP4	Peprotech	120-05ET
CHIR99021	Cyamn Chemical	13112
含 GlutaMAX 的 DMEM/F12 培养基	Gibco	10565018
多西环素	Millipore-Sigma	D3072-1ML
碱性 FGF	Peprotech	100-18B
Fluoromount-G 封片剂	VWR	100502-406
佛司可林	R&D Systems	1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-合格低生长因子基底膜基质	Gibco	A1413302
玻璃底 48 孔培养皿	Mattek Corporation	P48G-1.5-6-F
GlutaMAX 添加剂	Gibco	35050061
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
人内皮细胞无血清培养基	Gibco	11111044
LDN193189	Tocris	6053
最低必需培养基非必需氨基酸溶液（MEM-NEAA）	Gibco	11140050
N-2 添加剂	Gibco	17502048
Neurobasal 培养基	Gibco	21103049
正常驴血清	Millipore-Sigma	S30-100mL	使用与二抗宿主匹配的血清
多聚甲醛（PFA）	ThermoFisher	28908
PDGF-BB	Peprotech	100-14B
PDGFRB（血小板源性生长因子受体β）抗体	R&D Systems	AF385	使用稀释比例为 1:500
磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4	Gibco	10010031
Pecam1（血小板内皮细胞黏附分子1）抗体	R&D Systems	AF806	使用稀释比例为 1:500
青霉素-链霉素	Gibco	15140122
PiggyBac 质粒（PB_iETV2_P2A_GFP_Puro）	AddGene	目录号 #168805
S100B 抗体	Sigma-Aldrich	S2532-100uL	使用稀释比例为 1:500
SB43152	Reprocell	04-0010
硫黄素 T	Chem Impex	22870	使用浓度为 25 µM
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-250mL
VE-钙黏蛋白（CD144）抗体	R&D systems	AF938	使用稀释比例为 1:500
VEGF-A	Peprotech	100-20
Y27632	R&D Systems	1254/10
ZO-1	Invitrogen	MA3-39100-A488	稀释比例 = 1:500

参考文献

Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412(2015).
Segarra, M., Aburto, M. R., Acker-Palmer, A. Blood-brain barrier dynamics to maintain brain homeostasis. Trends in Neurosciences. 44 (5), 393-405 (2021)....

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