本文介绍一种用于鉴定可调节ADCC机制化合物的方法，ADCC是抗肿瘤抗体杀伤癌细胞的重要机制。通过该方法，在存在曲妥珠单抗（Trastuzumab）的条件下，检测自然杀伤（NK）细胞对乳腺癌细胞球状体的细胞毒性作用。图像分析可识别球状体中存活和死亡的效应细胞及靶细胞。
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本文内容
摘要
摘要
基于单克隆抗体的免疫疗法靶向肿瘤抗原现已成为癌症治疗的主要手段。抗体的作用机制之一是抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC），即抗体结合癌细胞后，招募免疫系统的细胞组分（如自然杀伤细胞，NK细胞）以杀伤肿瘤细胞。通过鉴定能够增强癌细胞敏感性或提高免疫细胞活性的佐剂化合物，有望提升此类疗法的疗效。此外，癌症患者因既往疾病或癌症相关症状而接受合并用药时，可能产生尚未被发现的药物相互作用，从而影响抗体治疗的效果；因此，需排除此类不良药物相互作用。基于上述目标，我们建立了癌症ADCC模型，并在此描述一种用于筛选ADCC调节药物的简便实验方案。由于三维模型（如肿瘤细胞球状体）在预测方面优于二维培养体系 体内 通过建立表达EGFP的HER2+ JIMT-1乳腺癌细胞与NK92.CD16细胞系的肿瘤球共培养模型，并使用临床批准用于HER2阳性乳腺癌治疗的单克隆抗体曲妥珠单抗（Trastuzumab）进行诱导，以评估肿瘤对抗癌治疗的响应。JIMT-1细胞在抗粘附U型底96孔板中培养形成肿瘤球。第3天加入NK细胞和曲妥珠单抗。随后用Annexin V-Alexa 647染色检测细胞凋亡，并利用自动化显微镜定量分析肿瘤球外围区域的凋亡细胞死亡。本实验方法可用于筛选调节抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）的分子，例如证明了美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于转移性癌症治疗的受体酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼（Sunitinib）几乎完全抑制ADCC效应。该肿瘤球生成方法及图像采集与分析流程适用于在癌细胞球模型中高通量筛选调节ADCC的化合物。
引言
多细胞肿瘤球体（MCTS）是一种广泛应用的三维（3D）模型，由贴壁细胞因聚集倾向自发形成，是深入理解癌细胞生物学机制的重要工具。可通过多种技术，如基于液体和基于支架的三维培养方法，从多种细胞类型中生成多细胞肿瘤球体。1与单层二维模型相比，其主要优势在于能够重现 体内 肿瘤的结构组织和缺氧特性，通过模拟肿瘤细胞的生物学行为，特别是导致治疗逃逸和药物耐药性的机制2因此，由于多细胞球体（MCTS）能够提高毒性与药物敏感性的可预测性，它们被广泛用于三维癌症研究，并有望促进针对不同类型癌症的有效药物开发。3.
研究任何疾病都需要相关且便捷的模型。建立癌症免疫学研究模型具有挑战性，因为免疫系统由多种细胞类型组成，每种细胞类型又包含多个亚型以及广泛的活化状态。这些不同的免疫细胞类型与癌细胞及其他肿瘤组分相互作用，最终影响疾病的进程。传统的二维体外（2D in vitro）细胞培养方法无法充分模拟这些复杂的细胞间相互作用，因其缺乏可转化性，且无法在系统层面（例如在组织中）预测药物的作用效果4,5。此外，由于人类与小鼠免疫系统之间存在根本性差异，小鼠模型也具有严重局限性。因此，三维（3D）培养系统可填....
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方案
1. 建立JIMT-1增强型荧光蛋白（EGFP）球状体模型
- 为了形成U形细胞排斥性底部，用0.5%琼脂糖-PBS溶液（每孔30 µL）包被96孔板。在室温下孵育约30-45分钟。
- 用2 mL无菌PBS洗涤JIMT-1-EGFP细胞两次（JIMT1-EGFP细胞系的构建已在先前的出版物中报道17）。使用T25组织培养瓶和JIMT-1培养基（DMEM/F-12培养基添加20%胎牛血清（FBS）、0.3 U/mL胰岛素（100 IU/mL，Humulin R）和1%青霉素-链霉素）进行细胞培养。
- 向培养瓶中加入2 mL胰蛋白酶-EDTA，并在CO2培养箱中孵育10分钟。
- 轻敲培养瓶，检查JIMT-1细胞在孵育后是否已脱落。
- 使用2 mL JIMT-1培养基终止消化，并将细胞悬液收集至15 mL离心管中。
- 用0.4%台盼蓝染液（80 µL染液 + 20 µL细胞悬液）在Bürker计数板中计数细胞，并将细胞浓度调整为20,000个细胞/mL。
- 将100 µL细胞悬液（每孔2000个细胞）移入96孔板的每个孔中（该板已按步骤1.1所述预先包被0.5%琼脂糖-PBS溶液）。
- 将细胞在37 °C的CO2培养箱中孵育3天，使其聚集成团。
- 定期....
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结果
通过转染表达EGFP的JIMT-1细胞，并由这些细胞生成球状体。选用舒尼替尼作为测试化合物，因其既往已被证明可影响ADCC的过程17。球状体允许聚集培养72小时。在第3天，向球状体中加入10 µg/mL曲妥珠单抗（或等摩尔浓度的6.6 µg/mL TR-F(ab')219）以及NK细胞（效靶比20:1），同时设置或不设置20 µM舒尼替尼预处理1小时，共作用24小时。单独培养的JIMT-1细胞以及与NK细胞（效靶比20:1）共孵育的JIMT-1细胞作为CTL对照。球状体用Annexin V 647染色1小时以检测凋亡性细胞死亡，随后使用高内涵分析仪进行成像。
如Annexin V染色所示，将NK细胞与曲妥珠单抗（Trastuzumab）共同加入JIMT-1细胞后，导致肿瘤类球体发生细胞死亡。Annexin阳性（凋亡）细胞出现在类球体的外周区域，如图3A所示。相比之下，单独加入NK细胞并未引起肿瘤细胞凋亡。为.......
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讨论
尽管在过去几十年中乳腺癌（BC）的治疗取得了显著进展，患者仍经常出现药物耐药性或经历不良副作用24。与乳腺癌相关的高发病率和高死亡率迫切需要持续深入研究其潜在的分子机制，同时也需要建立可靠的筛选平台，以鉴定可用于治疗开发的新分子靶点25。这些研究策略依赖于基于细胞培养的转化实验。近年来，三维肿瘤培养系统（如球状体和肿瘤类器官）作为一种低成本、易于实施的模型逐渐兴起，相较于传统的单层细胞培养，能更真实地模拟肿瘤病理生理的关键特征。其中一项重要特征是多种肿瘤相关免疫细胞与癌细胞之间在空间上协调的相互作用。这使得三维共培养模型成为筛选作用于免疫细胞以治疗恶性肿瘤的药物调节剂的更优工具26。
在本研究中，我们建立了一种新的类球体模型，用于研究自然杀伤细胞（NK细胞）介导的、曲妥珠单抗依赖的针对JIMT-1乳腺癌细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC），并描述了一种用于评估NK细胞杀伤癌细胞的自动化成像与分析工作流程。该方法已应用于高内涵成像.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
LV 获得了匈牙利国家研究、发展与创新办公室资助项目 GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS"、GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE、OTKA K132193 和 K147482 的支持。本项目还获得了匈牙利研究网络（HUN-REN）的资助。CD16.176V.NK-92 细胞由 Kerry S. Campbell 博士（费城福克斯蔡斯中心，代表加州圣地亚哥 Brink Biologics, Inc.）提供，该细胞在全球范围内受专利保护，并由 Nantkwest, Inc.（www.nantkwest.com）授权使用。作者感谢 György Vereb 和 Árpád Szöőr 在使用 NK-92 细胞系和 TR-F(ab’)2 以及技术指导方面提供的帮助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔玻璃底细胞培养超微孔板 | PerkinElmer，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | LLC 6055302 | 用于类球体测量 |
| 96孔组织培养板 | TPP | 92096 | 用于细胞接种 |
| α- MEM 培养基 | Sigma | M8042 | 在NK培养基中 |
| 琼脂糖 | Sigma | A9539 | 用于球状体接种 |
| Annexin V-Alexa Fluo 647 偶联物 | Invitrogen-ThermoFisher Scientific | A23204 | 用于高内涵筛选的细胞凋亡检测 |
| CD16.176 V.NK-92 细胞 | Kerry S. Campbell 博士（美国宾夕法尼亚州费城福克斯蔡斯癌症中心，代表加利福尼亚州圣地亚哥 Brink Biologics 公司） | ATCC CRL-2407 | 用于细胞培养 |
| 细胞示踪蓝 | Invitrogen-Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | C2110 | 用于自然杀伤细胞染色 |
| DMEM/F-12 培养基 | Sigma | D8437 | 在 JIMT1-EGFP 培养基中 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma | D8418 | 用于在转移类球体前包被HCS板 |
| 胎牛血清（FBS） | Biosera | FB-1090/500 | JIMT-1-EGFP 和 NK 培养基 |
| 谷氨酰胺 | Gibco | 35,050–061 | 在NK培养基中 |
| GraphPad Prism 8.0.1 | GraphPad Software Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | 用于统计分析 | |
| Harmony 软件 | PerkinElmer，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 用于HCA | |
| IL-2 | Proleukin，诺华匈牙利ária Kft.，布达佩斯，匈牙利 | PHC0026 | 在NK培养基中 |
| 胰岛素（Humulin R） | Eli Lilly | HI0219 | JIMT-1-EGFP 培养基 |
| JIMT-1 乳腺癌细胞 | 用于细胞培养 | ||
| MEM非必需氨基酸（MEM-NEAA） | Gibco | 11,140–050 | 在NK培养基中 |
| Na-丙酮酸 | Lonza | BE13-115E | 在NK培养基中 |
| Opera Phenix 高内涵分析设备 | PerkinElmer，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | HH14001000 | 用于HCA |
| PBS（磷酸盐缓冲盐水） | Lonza | BE17-517Q | 用于洗涤细胞 |
| 青霉素-链霉素 | Biosera | LM-A4118 | JIMT-1-EGFP 和 NK 培养基 |
| pLP-1、pLP-2、pLP-VSV-G、pWOXEGFP | Invitrogen，（Prof. József T<图片替代文本="公式 1" 源文本：src="/files/ftp_upload/65922/65922eq01v2.jpg" 样式="margin: auto;"/>zsér，德布勒森大学 | 用于JIMT-1-EGFP细胞系 | |
| Pluronic-F127 | Sigma | P2443 | 用于在转移类球体前包被HCS板 |
| 苹果酸舒尼替尼 | SigmaAldrich | PZ0012 | 用于处理 |
| 曲妥珠单抗抗体（人源化抗HER2单克隆抗体） | Herzuma®，匈牙利布达佩斯 EGIS 制药公司 | NDC-63459-303-43 | 用于处理 |
| 曲妥珠单抗-F(ab')2 | Gy教授惠赠örgy Vereb 和 Árpád Szö<图片替代文本"公式 1" src="/files/ftp_upload/65922/65922eq01v2.jpg" 样式="margin: auto;"/>r | 德布勒森大学生物物理学与细胞生物学系 | 用于处理 |
| 0.4% 台盼蓝溶液 | Sigma | T8154 | 用于细胞计数 |
| PBS中的1X胰蛋白酶-EDTA | Biosera | LM-T1706 | 用于细胞脱离 |
参考文献
- Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell Biosci. 12 (1), 155(2022).
- Mittler, F., et al. High-content monitoring of drug effects in a 3D spheroid model. Front Oncol. 7, 293(2017).
- Badr-Eldin,....
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重印与许可
