主动位置回避（APA）测试：一种有效、多用且可重复的小鼠空间学习任务

摘要

本文介绍了一种主动位置回避测试的实验方案，这是一种针对啮齿类动物设计的依赖海马体的空间学习范式。通过调整关键参数，可在处理前、处理后或不同时间点对动物进行重复测试。

摘要

依赖海马体的空间学习在啮齿类动物中已通过多种方法进行测试，包括莫里斯水迷宫（MWM）、Y迷宫以及新物体位置（NOL）任务。近年来，主动位置回避（APA）任务作为一种替代方法被开发出来，用以补充这些较为传统的研究手段。在APA任务中，小鼠需利用放置于旋转平台周围的空间线索，避开一个固定的电击区域。由于该任务具有多个可调节的参数，已被证明是一种非常灵活的实验方法。它适用于对同一批小鼠进行纵向和重复性的研究。本文提供了一个成功实施APA任务的详细实验方案，并介绍了可用于探究空间学习不同组分的其他APA变式。我们还描述了数据采集与分析的具体流程，并讨论了APA任务中的关键步骤，以提高实验成功的可能性。相较于传统的空间导航测试，APA任务具有多项优势：它适用于老年小鼠或具有疾病表型（如阿尔茨海默病）的小鼠；任务复杂性易于调整，因而可广泛用于不同品系的小鼠；此外，APA任务也适合用于评估接受过手术或实验性干预（如脑卒中或创伤性脑损伤）后可能影响运动功能或神经功能的动物模型。

引言

主动位置回避（APA）是一种用于检测啮齿类动物海马依赖性空间学习的有效工具^1,2,3,4。在APA任务中，动物被放置在一个旋转的平台上，需要利用视觉线索进行定向，并避开具有厌恶性电击的区域⁵。平台的旋转确保了小鼠无法采用自身运动线索（idiothetic）进行导航，也无法利用气味标记，因为这些线索随平台一同旋转，而电击区域则保持静止⁵。通过改变平台的旋转速度和方向，以及电击区域和视觉线索的位置，可实现对小鼠的多次重复测试^6,7,8。与目前最常用的空间学习测试方法——莫里斯水迷宫（MWM）相比，APA具有多项明显优势。重要的是，小鼠天生厌恶游泳，MWM任务会使其承受极大的应激压力⁹。此外，已有报道指出老年小鼠在MWM任务中会出现漂浮现象¹⁰，导致该方法在许多情况下不适用于空间学习评估。同时，MWM任务要求在测试过程中设置一个隐藏的、浸没于水下的平台，这需要水体呈不透明状态，通常通过添加白色颜料实现。然而，在行为学任务中对动物进行追踪和分析需要实验个体与背景之间具备足够的对比度，因此如Swiss或BALB/c等特定品系的小鼠无法在MWM中进行有效测试。在APA任务中，通过在网格下方添加黑色塑料片即可有效解决这一问题。

已设计多种主动位置回避（APA）范式用于测试空间学习能力，表明其作为一种有效的行为学工具具有重要用途。例如，空间学习的习得、保持和巩固通常通过连续3至5天对动物进行每日测试来实现^6,7,11,12。通过比较动物在每天习得阶段所接受的电击次数，可对记忆与学习能力进行量化。首次进入电击区的时间以及最长避电击时间也是可用于评估任务过程中学习能力变化的重要参数。此外，可通过开展一次持续30分钟的APA实验来检测空间工作记忆^2,13，其中空间学习能力通过会话内分段分析行为表现（如每5分钟时间段内的电击次数）的变化情况进行测量。

本文介绍了APA任务，并重点阐述了在进行此项空间学习测试时必须考虑的关键特征。

方案

所有动物实验程序均经澳大利亚国家卫生与医学研究委员会指南下的昆士兰大学动物伦理委员会批准（批准编号：QBI/189/15）。

1. APA 房间设置

注意：APA 装置包含一个带金属网格地板的高架平台，周围由一个高 32 cm 的透明圆形边界围成。金属条均匀排列（间距 0.5 cm），直径为 0.3 cm。

1. 确保APA装置位于天花板上安装的摄像头视野范围内。使用市售的动物追踪软件对小鼠进行追踪。
2. APA实验区域通常以1 rpm的速度旋转，并在旋转区域内设定一个预先指定的60°固定电击区。当小鼠进入电击区时，给予0.5 mA（60 Hz，500 ms）的轻微足部电击。
3. 确保在测试期间电击区的位置保持不变，并在实验设置中通过电子方式设定。除非小鼠主动移动以避开，否则旋转的实验区域会带动小鼠进入电击区。
4. 在四个不同房间墙壁上、与旋转平台相同高度的位置放置四个新颖的视觉线索，通常距离实验区域30-50 cm。确保这些线索为中性颜色，例如打印在A3纸上的黑白符号或形状，并进行覆膜处理以便于清洁（图1A）。
5. 确保房间光照强度在30-70 Lux之间。增加光照强度会诱发类似焦虑的行为并减少探索活动。
6. 开始前，打开Tracker程序并选择APA任务。
7. 在Tracker 2D的选项中，选择实验标签页。在此确保选中回避-单帧-仅位置选项，以便配置所需参数。保存配置文件并根据需要进行调整。
8. 在实验标签页中，在实验时间框内设置实验持续时间。典型的实验持续时间为600秒或10分钟。
9. 确保选中启用计时器。在计时器区域中按上述讨论内容修改电击参数。
10. 在实验标签页的房间坐标系区域提供的空间中输入常见的实验信息。例如，确保默认输出文件名称包含日期、简单的实验标识符和测试日期。在文件名末尾加上下划线"_"，以便在实验过程中添加唯一的小鼠ID。
11. 房间坐标系区域还包括目标标签页。点击编辑按钮以确保整个实验区域被包含在感兴趣区域内。然后选择弧形以调整电击目标区的大小和位置参数（图1B）。
12. 打开追踪标签页，调整参数以确保成功追踪小鼠。对比度选项包括“深色”或“浅色”，适用于深色（如C57Bl/6）或浅色（如BALB/c）小鼠，从而在背景与小鼠之间形成有效对比。使用白化品系小鼠时，可在实验区域下方放置一块黑色塑料片以实现该对比效果（图2）。
13. 在此区域设置小鼠的大小和面积范围，以有效识别实验区域中的小鼠。或者，在按下来自校准器按钮后设置这些参数。
14. 选择来自校准器按钮，以确保实验区域完全位于感兴趣区域掩膜内。
    1. 在此标签页中启动实验区域，确保当实验区域旋转时仍保留在掩膜范围内。此标签页对于选择合适的对比度阈值也至关重要。在阈值面板中移动红线以调整对比度阈值。
       注意：图3A显示了最佳的阈值选择，表现为实心橙色区域以及小鼠所在位置的蓝色"X"标记。图3B显示了较差的阈值，仅表现为散在的橙色斑点且无"X"标记。
15. 使用设备标签页，通过速度按钮设置实验区域的旋转方向和速度。选择正负速度分别代表顺时针和逆时针旋转。在电流源部分设置电击强度。小鼠最常用的设置为1 rpm旋转速度和0.5 mA电击强度。
16. 在电流源标签页中调整电击的传递方式或时机。
    1. 确保电流模式设置为追踪依赖型。当小鼠进入电击区时，将提供电击。
    2. 选择时间选项，以用户设定的时间间隔给予电击。通过选择来自文件，可使用先前记录的轨迹对小鼠施加电击。此方法用于提供配对对照小鼠，使其接受相同数量、持续时间和强度的电击，而不受空间学习能力的影响。
       注意：文件输出和窗口标签页允许将数据和视频文件保存至特定目录。文件输出标签页中的来自图像按钮还允许选择感兴趣区域以完整捕获整个实验区域。
17. 退至帘幕后方并开始试验。实验人员靠近实验区域或产生不必要的噪音可能会影响动物表现。
18. 确保在试验期间尽量减少噪音和气味，因为这些因素可能为小鼠提供额外线索，从而影响其表现。减少此类干扰的措施包括：确保临床废物桶密闭、使用远离嘈杂实验室区域的房间、在每只小鼠之间彻底清洁设备。研究人员可考虑使用白噪音发生器屏蔽无关的外部噪音。
19. 在整个行为测试期间保持笼内垫料不变，因为更换可能带来新的刺激并影响行为。
20. 为避免昼夜节律变化，每天在固定时间进行测试。

2. 适应实验人员操作

1. 在测试前至少2-3天，每天用手抓取每只小鼠30秒至1分钟。动物抓取操作可显著减少测试过程中的应激和焦虑相关行为。
2. 在适应期和测试期间应穿着相同的实验服，并避免使用气味强烈的除臭剂、古龙水或香水。

3. 对 APA 实验环境的适应（1 天）

1. 将小鼠带入前室或测试室进行适应。让小鼠至少适应30分钟。在将小鼠带入前室或测试室前，预先设定好光照强度。
2. 设置追踪软件。
   1. 创建一个实验专用文件夹。根据实验范式，为每一天或每次试验分别建立独立文件夹。按照上述说明设置实验配置，并保存这些配置以供将来使用。
   2. 开始试验前，点击文件选项卡，打开已保存的配置，然后点击保存图标，在新打开的窗口中输入唯一的小鼠编号，并通过点击播放选项卡启动试验。
3. 通过让小鼠暴露于旋转 arena 中5分钟但不给予电击的方式，使其适应主动位置回避（APA）装置。
4. 抓住小鼠尾根部将其从饲养笼中提起，轻柔地放置于戴着手套的手掌上，将小鼠转移至APA装置，并将其放置在远离电击区域的位置，面朝墙壁。
5. 退至帘幕后方，开始试验。
6. 测试结束后，取出小鼠并放回饲养笼中。
7. 收集所有尿液和粪便，并用80%（v/v）乙醇彻底清洁栅格。
8. 对所有小鼠重复步骤3.4–3.7。

4. 使用 APA 进行获得性训练（第 1-6 天）

1. 将房间照明设置为与适应日相同的条件。
2. 将小鼠带入前室或测试室，并使其适应至少30分钟。
3. 按照上述方法设置Tracker软件。
4. 设定试验持续时间。
5. 确保当前电流已开启并设定（例如，0.5 mA）。
6. 将小鼠放置在远离电击区域的场地内，并使其面朝墙壁。
7. 退至帘幕后，按下播放按钮开始试验。通过计算机屏幕监测小鼠行为，并在必要时进行干预。例如，当小鼠未接收到电击或表现出过度应激（如频繁跳跃或发声）时。
8. 测试结束后，取出小鼠并放回其饲养笼。
   ​注意：务必确认小鼠能够接收并响应电击。小鼠通常会通过后肢直立和发声来反应电击。若未观察到此类反应，则可能未接收到电击，原因可能是网格上有粪便污染或追踪效果不佳。因此，每次试验后清洁网格并优化小鼠追踪效果至关重要。

5. 反向习得训练（可选，1-6 天）

1. 在反转任务中，将电击区域重新定位至新位置，通常与先前位置相距180°。评估小鼠灵活学习新电击区域位置的能力。反转学习过程中通常不改变房间内的线索。
2. 对所有小鼠重复步骤3.4–3.7。

6. 探针试验（可选，1 天）

1. 在探测试验中，记录首次进入避电区域的时间和/或避开电击区域的最长时间。
   注意：这表明在习得阶段后的记忆巩固情况。训练良好的小鼠会较长时间（>60 秒）避免进入电击区域，显示出空间学习的证据。
2. 将房间灯光强度设置为与习得训练日相同。
3. 让小鼠在测试室或前室适应环境 30 分钟。
4. 设置 Tracker 软件。
5. 将试验持续时间设定为与先前进行的测试期相同的时间（例如 10 分钟或 30 分钟，根据试验参数而定）。
6. 本试验中不给予电击。
7. 将小鼠放置在厌恶电击区域的对侧，面朝墙壁。
8. 开始试验，并退至窗帘后方。
9. 确保小鼠被有效追踪。
10. 在计算机屏幕上监测小鼠行为，当其进入电击区域时停止试验。部分研究人员倾向于继续试验 5 分钟，以观察小鼠是否会反复进入电击区域。
11. 轻柔地抓取小鼠并将其放回饲养笼。
12. 确保收集所有尿液和粪便，并用 80%（v/v）乙醇彻底清洁栅格。

7. 轨迹分析

注意：该任务的表现可通过不同的追踪软件实现。以下是使用配套软件确定APA任务期间表现的方法。在此示例中，数据通过Track Analysis程序进行分析。

1. 要分析数据，请打开 Track Analysis 程序，并在主窗口的下拉菜单中选择 回避。
2. 点击 添加任务，在新窗口中上传采集阶段保存的数据文件。在 组名称 中创建一个待分析的组，例如 第1天 或分析时间点。
3. 点击 输出目录，选择保存分析后数据的位置。
4. 通过点击 添加文件 选项卡，从本地驱动器中选择要分析的文件。
5. 点击 设置时间 选项卡，设定需要分析的时间段。此功能允许定义待分析的时间区间，例如 0 至 600 秒。或者，也可按时间分段进行分析，例如每段 60 秒。
6. 添加所有轨迹文件后，点击 分析 选项卡，然后选择 运行分析 以开始数据分析。分析完成后将生成多个文件夹，用于分析的数据将位于 TBLfiles 文件夹中。将这些数据文件导入电子表格软件，用于后续分析，例如成对比较或重复测量方差分析。
   注意：分析过程还将生成其他文件夹，包括 PS 文件，其中包含测试期间小鼠的单页描述，显示轨迹图以及电击发生的位置。

结果

具有完整空间学习能力的小鼠在连续的习得试验中会表现出电击次数减少（图4A）。类似地，随着小鼠学会成功避开电击区域，其避开电击区域的最长时间也会增加（图4B）。然而，无法学会有效回避策略的小鼠在每次习得试验中电击次数将保持恒定（图4A）。通常，未能识别电击区域的小鼠每次进入该区域时会遭受多次电击。轨迹图有助于展示学会避开电击区域的小鼠（图4C）和无法避开电击区域的小鼠（图4D）的示例。在这两种情况下，这些轨迹图均代表习得阶段的最后一天。图 4C 中的小鼠仅受到2次电击，由两个圆圈表示。此外，请注意轨迹图显示该小鼠大部分时间停留在电击区域的对侧，即由红色楔形表示的区域。相反，图 4D 中的小鼠受到更多次电击，其轨迹图显示出无序的运动模式。无法成功学会避开电击区域的小鼠示例包括因年龄较大而导致海马神经发生减少的小鼠，如18月龄小鼠所示（图4A、B—改编自 Blackmore 等，2021⁷）、未成熟神经元的化学消融⁶或海马损伤（参见 Codd 等，2020）⁸。

必须区分小鼠未能学会导致的试验失败与设备设置故障导致的失败。由于设备故障造成结果不佳的两个最常见原因是小鼠追踪效果差（图5A）或小鼠未接收到电击。追踪效果差可能导致小鼠进入电击区域时未能接收到电击；或者在小鼠未进入电击区域时错误地触发电击。在这两种情况下，小鼠均无法形成有效的回避策略。追踪效果差的问题可通过调整“校准器来源”（From Calibrator）选项卡中的阈值来解决。通常，若在10分钟内出现超过1000个无效帧，则定义为追踪效果差，但这种情况极为罕见。在老龄小鼠中，由于可能出现脱毛（alopecia），追踪问题可能更易发生。当接收到电击时，小鼠会表现出肌肉紧张，偶尔还会发出叫声。小鼠通常会移动，即使幅度很小，也可在实时追踪软件中观察到。当小鼠在电击区域内完全静止不动时，系统会显示一条清晰的电击记录线（图5B）。这可能是由于电击箱未开启，或有粪便卡在栅栏之间，导致传递给动物的电击强度降低所致。

图1：场景前条件化（APA）装置、行为实验房间及电击区域设置。（A）测试场地与房间布置示例。APA装置被抬高并置于房间中央，周围设有新颖的视觉线索。黑白视觉线索与平台处于相同高度。（B）在实验选项卡内的目标功能可用于遮蔽整个实验区域，并设定电击区域的位置。在此示例中，电击区域以红色楔形表示，位于270°位置。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：白化小鼠品系的APA实验装置。 对于BALB/c等白化小鼠品系，可在追踪选项卡中选择“亮场”模式，并设置黑色背景的实验区域，从而建立APA实验环境。在黑色背景下，白化小鼠具有较高的对比度，有利于实现更精确的小鼠运动追踪。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：调整小鼠追踪的阈值至关重要。 必须适当调整阈值，以确保实验过程中动物追踪效果良好。在 From Calibrator 选项卡的阈值面板中，通过移动红线来调整阈值。(A) 良好阈值选择的示例，目标区域呈实心橙色，且目标上有一个蓝色的 X。(B) 阈值设置不佳，橙色区域呈斑点状。追踪效果差会导致系统在实验区域内丢失动物，或导致小鼠进入电击区域时无法接收到电击。 请点击此处查看此图的放大版本。

图4：年轻（10周龄）与年老（18月龄）小鼠在为期5天的学习范式及轨迹图中的表现比较。（A）在为期5天的测试中，10周龄小鼠所受到的电击次数显著少于18月龄小鼠；值得注意的是，两组在测试第一天所受电击次数的差异较小，但具有完整记忆功能的年轻小鼠比年老组更快学会避免进入电击区域。（B）最大避震时间定义为在10分钟试验中避免电击的最长持续时间。与年老小鼠相比，年轻小鼠能更快学会避免进入电击区域，表明其学习能力较强。（C）该轨迹图中的小鼠在习得试验中仅受到两次电击，由图中两个圆圈表示。该小鼠在电击区对侧区域停留的时间更长，由红色楔形区域表示。（D）该小鼠受到更多次电击，并在电击区附近停留更长时间，提示该小鼠未能实现有效的空间学习。采用双因素重复测量方差分析（ANOVA）结合Bonferroni事后检验进行显著性检验。****p<0.0001。图A和图B修改自Blackmore等⁷。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：轨迹图可提供每次试验中每只小鼠的重要信息。（A）注意本示例跟踪结果中出现的直线，这是由于跟踪软件在任务过程中错误识别了小鼠所致。（B）试验中良好跟踪效果的示例。请点击此处查看该图的放大版本。

图6：不同动物追踪程序中的轨迹可视化与热图分析。（A）程序1和（B）程序2均可检测动物的位置与运动，生成轨迹图，用于直观判断动物是否学会任务或实验处理的效果。两个程序对高效学会任务的动物均显示出一致的轨迹图。（C） 还可生成热图，有助于识别数据点的热点区域与聚集模式。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

综上所述，主动位置回避测试是一种有效的空间学习任务，可用于多种小鼠品系和实验条件。APA 任务克服了其他空间学习范式（如莫里斯水迷宫，MWM）所存在的局限性¹⁴，后者会因小鼠皮质醇水平升高而产生较大应激反应⁹。此外，MWM 不适用于老年小鼠，因为据报道这些小鼠在实验过程中会出现漂浮现象¹⁰。尽管其他空间学习测试（如巴恩斯迷宫和新物体位置识别测试）应激性较低，但它们在对同一批小鼠进行重复测试的频率方面存在限制。因此，APA 任务的主要优势在于其可多次使用，因为可通过调整多个参数以维持任务的新颖性。事实上，我们已在同一批小鼠中重复使用 APA 任务多达 5 次，以研究海马损毁的影响以及后续运动干预的效果⁸。在每次测试中，均对包括 arena 旋转方向、电击区域和空间线索在内的参数进行调整。这种设计有效地确保了小鼠依赖空间导航线索重新学习任务，这一点在对照组动物的表现中得到证实：它们在每次测试周期的初期遭受较多电击，随后在后续测试日中电击次数逐渐减少⁸。通常情况下，在一个为期 5 天的测试范式结束时，若某只动物在最后一天遭受超过 10 次电击，或最长回避时间少于 60 秒，则认为其未学会该任务范式。

除了能够轻松调整设置以进行多轮空间测试外，APA任务还确保小鼠必须利用空间导航来有效避开电击区域。例如，动物必须利用外部线索，通过远离固定不动的电击区域来定位并避免进入其中⁵。由于实验 arena 在旋转，动物无法使用自身运动感知（idiothetic）方式进行导航，也无法利用气味等外部感觉线索（exteroceptive cues），因为这些线索会随 arena 一起旋转，而电击区域和空间线索则保持静止⁵。

还必须确保小鼠已适当适应研究人员和主动回避实验装置（APA arena）。足底电击强度也需要优化，因为电击强度过低或过高均可能影响小鼠的学习和任务执行能力⁵。通常将电击强度设定为0.5 mA，不应超过0.7 mA。对于表现出更高焦虑样行为的动物，可考虑同时降低光照强度和足底电击强度。在APA任务期间，焦虑增加的表现可能包括过度跳跃、在实验区域内无控制地奔跑或长时间的僵直不动。本方案中采用的电击强度为0.5 mA，该强度此前已在BALB/c小鼠中使用过，而该品系已知具有较高的焦虑样行为¹⁵。

此处，我们介绍由提供主动位置回避装置的公司配套提供的动物追踪软件。其他视频追踪软件也可用于分析行为表现。这些程序能够准确测量和分析小鼠在主动位置回避（APA）任务中的表现。这些程序允许在APA实验 arena 内设置多个区域和位置，以评估动物行为。APA实验的 arena 设置包含一个三角形电击区域，用于测量进入该区域的次数、首次进入时间以及在电击区域停留的时间。此外，还可以在 arena 内添加其他区域。例如，我们可以添加中央区域或与电击区域相对的区域，以测量动物在这些区域的停留时间及移动距离，从而评估其回避厌恶区域的行为策略。这些程序可追踪小鼠的质心位置，并将其数据保存下来，同时在参考帧上方显示，以便进行可视化检查（图6A、B）。最后，还可以生成个体或群体表现的密度热图（图6C）。

在进行APA任务时，可能存在一些需要解决的问题。有时，由于小鼠对电击区域无反应，需将其排除在分析之外。与往常一样，只有当小鼠符合预先定义的离群条件时（例如，其表现超出平均值两个标准差）才应考虑排除。像APA这类复杂的动物行为学任务通常需要较高的动物数量（N值）。我们建议在开展APA实验前先进行功效分析，以计算合适的样本量，具体数值取决于所用小鼠品系和处理组别。根据经验，我们发现每组至少10只小鼠即可在APA实验中提供足够的统计功效。该任务的主要难点在于确保在实验过程中对小鼠运动轨迹的高质量追踪。应利用任务中的适应阶段来确认追踪效果是否理想。小鼠对电击无反应的情况通常是因为粪便卡在栅格板之间所致。因此，每次实验后必须彻底清洁装置，清除所有粪便和尿液残留，这也有助于降低后续实验动物的应激水平。APA任务通常采用为期5天的实验范式，对于干预效果持续时间少于5天的研究可能会有一定局限性；但对于此类研究，仍可采用30分钟单次会话的方式评估短期记忆或空间学习的获取能力。

综上所述，本文详细描述了如何建立并使用主动位置回避范式来检测小鼠的空间学习能力。相较于莫里斯水迷宫（MWM）等传统空间测试方法，该范式能够调整实验条件以适用于不同毛色的多种小鼠品系，具有明显优势。此外，通过调节多个参数，可实现重复测试，从而在不同实验范式或生理衰老过程中精确比较空间学习能力的变化。在较短时间内，APA测试已被证明是依赖海马的空间学习的一种准确且有效的替代方法。未来，APA任务可作为评估野生型和转基因小鼠认知与空间行为中治疗干预或运动干预效果的可靠方法。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
恒流源 CS02	BioSignal Group	N/A	美国马萨诸塞州阿克顿
控制箱	BioSignal Group	N/A	美国马萨诸塞州阿克顿
Ethovision	Noldus	版本 16	荷兰瓦赫宁恩
电击随机化器	BioSignal Group	N/A	美国马萨诸塞州阿克顿
轨迹分析软件	BioSignal Group	版本 2.2	美国马萨诸塞州阿克顿
追踪程序	BioSignal Group	版本: 2.36	美国马萨诸塞州阿克顿