使用表面等离子体共振 （SPR） 技术实时检测生物分子之间的动态亲和力

Summary

本研究旨在阐明表面等离子体共振 （SPR） 技术的原理和方法，该技术在多个领域中具有广泛的应用。本文介绍了 SPR 技术、其作简单性和卓越的功效，旨在促进读者更广泛地了解和采用这项技术。

Abstract

表面等离子体共振 （SPR） 技术是一种灵敏的精确方法，用于检测病毒、病原分子蛋白和受体、确定血型和检测食品掺假等生物分子检测。该技术允许快速识别生物分子之间的潜在结合，有助于快速、用户友好、无创地筛选各种指示剂，而无需标记。此外，SPR 技术有助于实时检测高通量药物筛选。在本节目中，简要介绍了 SPR 技术的应用领域和基本原理。详细概述了作过程，从仪器校准和基本系统作开始，然后是配体捕获和分析物的多循环分析。详细阐述了槲皮素和毛萊糖素与 KCNJ2 蛋白结合的实时曲线和实验结果。总体而言，SPR 技术为药物筛选、相关药代动力学的实时检测、病毒检测以及环境和食品安全鉴定提供了一种高度特异性、简单、灵敏和快速的方法。

Introduction

表面等离子体共振 （SPR） 技术是一种无需标记分析物的光学检测技术。它能够实时和动态监测定量结合亲和力、动力学和热力学。这种高通量容量具有高度的灵敏度和可重复性，可以测量各种开放速率、关闭速率和亲和力。此外，所需的少量样品进一步增强了该方法的实用性 ^1,2。监测生物分子之间亲和结合的快速响应生物分子检测方法³ 已成为一个突出的研究领域。

SPR 技术在药物研发领域具有多种应用⁴.它的用途之一是发现特定药物靶点的结构基础。它还可用于鉴定具有显着药理活性的中草药的活性成分，并研究其药物筛选和验证机制。Gassner 等人通过 SPR 测定建立了双特异性抗体的线性剂量反应曲线，从而可以进行浓度分析和质量控制⁵。此外，SPR 还可用于在药典和疫苗开发中进行临床免疫原性测试⁶。

它可以利用的一个领域是检测农产品和食品安全检测中的农药残留、兽药残留、非法添加剂、病原菌和重金属 7,8,9,10。通过使用 SPR 技术，可以提高这些测试的准确性和效率。

SPR 技术可以应用的另一个领域是毒素和抗生素的快速检测。该技术允许将病毒抗体、小分子化合物和适配体连接到 SPR 生物传感器芯片上。然后，SPR 生物传感器芯片检测与分析物¹¹ 不同浓度的病毒 RNA。该方法已成功用于 H5N1、H7N9 禽流感病毒和新型冠状病毒^12、13、14 等病毒的快速检测。除了这些应用外，SPR 技术还可用于蛋白质组学、药物筛选、相关药代动力学的实时检测以及病毒和致病蛋白和受体的研究 15,16,17,18。它特别适用于大学和研究机构的科学研究和教学实验，是各种科研环境中的宝贵工具。

SPR 的原理是由入射光波引起的自由电子在金属膜和电介质之间的界面处的集体振荡运动¹⁹。它本质上是金属表面上的消逝波和等离子体波之间的共振²⁰.当光从光密介质过渡到疏光介质时，在某些条件下会发生全反射。从波动光学的角度来看，当入射光到达界面时，它不会立即产生反射光。相反，它首先以大约一个波长的深度穿过疏光介质。然后它沿着界面流动大约半个波长，然后返回光密度介质。只要光的总能量保持不变，这种穿过疏光介质的波就被称为规避波。由于金属含有自由电子气体，因此可以视为等离子体。入射光激发电子气体的纵向振动，导致沿金属-介电界面产生电荷密度波，称为表面等离子体波。这种共振在两种介质中都以指数衰减的形式传播。因此，反射光的能量显着降低。反射光完全消失的相应入射角称为谐振角²¹。SPR 对粘附在金属膜表面²⁰ 上的介质的折射率高度敏感。SPR 角随金属膜表面的折射率而变化，折射率变化主要与金属膜表面的分子量成正比²²。表面介质特性或粘附量的任何变化都会导致不同的共振角。因此，可以通过检查共振角的变化来分析分子相互作用。

这种无损、无标记、实时光学 SPR 分析基于上述原理，适用于各个领域的研究。因此，我们以槲皮素和毛蕊糖素与 KCNJ2 重组蛋白的组合为例，通过多周期分析证明了 SPR 曲线的角位移和实验结果。

Protocol

注意:完整的实验传感曲线表明实验过程可分为八个不同的阶段。

1. 样品和缓冲液制备

1. 实验前准备传感器芯片。
   1. 用食人鱼溶液（30% H₂O₂:H₂SO₄ = 1:3;v / v）处理芯片2分钟。随后，用大量去离子水彻底清洁芯片，然后将其浸泡在无水乙醇中，使其自然干燥。
   2. 接下来，将芯片浸泡在浓度为 50 M 的 11-巯基-l-十一醇 （MUOH） 溶液中过夜。然后将芯片放入环氧氯丙烷溶液中，使其在 25 °C 下反应 4 小时。
   3. 从溶液中取出芯片，用蒸馏水和无水乙醇彻底清洗。最后，将葡聚糖碱性溶液滴到芯片的金膜表面，使其在 25°C 下反应 20 小时。用去离子水清洗芯片，然后将其浸入溴乙酸溶液中，实现葡聚糖羟基羧甲基化修饰。使用纯度分别为 ≥98.5% 和 ≥99% 的槲皮素和毛萼红。
2. 制备所有含有电泳缓冲液、活化剂、固定缓冲液（10 mM 乙酸钠）和再生溶液 10 mM 甘氨酸-HCl（pH 1.5）的缓冲液。该活化剂含有 115 mg N-羟基琥珀酰亚胺 （NHS）、750 mg 1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳二亚胺盐酸盐 （EDC） 和 10.5 mL pH 值为 8.5 的 1 M 乙醇胺盐酸盐-NaOH。向每个小瓶中加入 10 mL 过滤后的去离子水，溶解 EDC 和 NHS（参见 材料表）。
   注:将 EDC 和 NHS 等分试样储存在 -18 °C 或更低温度下，在 2 个月内使用等分试样。所有溶液在使用前都应脱气。

2. 仪器校准

1. 在裸金上注入不同浓度（2%、1%、0.5%、0.2% 和 0.1% 体积比）的酒精浓度和峰值的标准曲线，并比较酒精的最大峰值。
   注:以 50 μL/min 的流速进样，通过来源数据分析软件获得标准曲线。
2. 根据技术手册，使用以下公式计算仪器的校正因子，以 K 表示:
   K=Δθ/Δ[（A-B）/（A+B）]
   在此公式中，A 和 B 表示各自检测器的信号值。如手册所示，理论斜率值为 0.06。因此，校正因子 K 可以计算为 K=0.06/R（其中 R 是从标准曲线获得的线性回归方程的斜率）。
3. 将测得的 Δ[（A-B）/（A+B）] 值乘以校正因子，得到实际的 Δθ 值。

3. 基本系统作

1. 要启动系统，请打开电源开关并等待检测单元达到预设温度（通常为 25 °C）。
2. 点击 OpenSPRTM 控制软件> 开始>程序 打开控制软件，软件程序运行后会自动连接到主机系统。
3. 按照 SPR 仪器的标准作程序安装 COOH 芯片（基于葡聚糖的芯片）。首先，在 SPR 生物芯片的背面滴一滴雪松油。然后，将 COOH 芯片贴在传感器的棱镜表面，确保芯片和棱镜之间没有气泡。最后，安装流量池并将其拧紧到光点。
   注意: 将液流池放入指定槽中，并使用固定螺钉将其牢固固定。通道尺寸为 10 mm x 1 mm x 1 mm。
4. 芯片放置
   1. 要打开芯片影线，请从 Tools 菜单中选择 Insert Chip 选项。如果芯片托架中已有芯片，请单击 Tools 菜单中的 Eject Chip 选项。
   2. 如果使用新芯片，请从芯片类型下拉菜单中选择相应的 芯片类型 ，并在芯片 ID 中填写与芯片相关的实验信息。可以填写芯片批号（可选）。如果是二手芯片，请选择 Reuse Chip ，并在 chip ID 下拉菜单中找到对应的芯片信息。
   3. 握住芯片，字面朝上，按照芯片上箭头的方向轻轻将芯片推入卡槽，最后关闭芯片仓门。
   4. 点击 Dock Chip 按钮。芯片放置后，系统会自动切换到待机状态。
   5. 要以高流速冲洗整个内部流动系统，请选择 Tools > Prime 命令> Start。整个过程需要 6-7 分钟。单击 Close 自动将系统切换到备用状态。
5. 按住试管支架右侧的 黑色按钮 ，然后打开左侧的金属盖。放置合适的试管后，轻轻关闭金属盖。如果您听到咔嗒声，则金属盖已锁定。
6. 将试管架沿卡槽轻轻推入样品室，听到咔嗒声，表示试管架处于正确位置并已锁定。
7. 单击 Eject Rack Tray（弹出样品架托盘）对话框中的 OK（确定），将样品架自动送入样品室并关闭门。
   注意:样品室门打开时有时间限制。门将在打开 60 秒后自动关闭。在最后 15 秒内，对话框中的倒计时以红色字体显示并闪烁。请等待门关闭后再重新打开，以免夹到您的手。
8. 响应信号的归一化
   1. 选择 Tool > More Tools，在 Maintenance Tools 目录下选择 Normalize，然后单击 Start > Next。
   2. 将 120 μL 的 70% BIAnormalizing 溶液添加到 7 mm 试管中。将试管放在程序 （R2F6） 中所示的指定位置。确认管架盖已正确关闭后，将管架放入样品室并关闭舱门，然后单击开始运行程序。

4. 配体捕获

1. pH 测量
   1. 在将配体固定在芯片上之前，筛选合适的配体缓冲液 pH 值，通过静电吸附在芯片表面附近富集配体，以达到更好的偶联效果。一般配体浓度为 10-100 μg/mL，对于第一个实验，尝试使用 20 μg/mL。
   2. 从 pH 值为 5.5、5.0、4.5 和 4 的 10 mM 乙酸钠中筛选配体。要设置工艺参数，请选择 Run-Wizard（运行向导）、Surface Preparation（表面制备）- Immobilization pH Scouting（表面制备 - 固定化 pH Scouting），然后单击 New（新建）。
   3. 选择芯片通道，可以从通道 1、2、3 或 4 中选择。该缓冲液有四个预设条件:10 mM 乙酸钠、pH 5.5、5.0、4.5 和 4。接下来，输入配体名称、接触时间 （180 s） 和流速 （5 μL/min）。
   4. 用 50 mM NaOH 再生表面后，设置芯片表面温度和样品室的温度。接下来，选择左侧的 sample 和 reagent rack1，将溶液按照样品架中的相应位置放置。保存实验方法，然后单击 Next（下一步）开始实验。
2. 配体固定
   1. 选择 Run-Wizard、Surface Preparation - Immobilization ，然后单击 New。将动员能力设置为 FC1、FC2、FC3 和 FC4 四个通道。通常，通道 1 和 2 配对时用作参考，通道 3 作为所有四个通道移动时的参考。
   2. 使用参考通道进行空白造影剂或活化闭合的无配体固定，使用通道 1 和 2 偶联通道 2 上的配体。
      注意: 有两种耦合模式可用:瞄准固定水平和指定接触时间。在瞄准固定水平模式下，输入目标耦合水平，软件会自动达到相应的水平。接触时间模式需要输入注射时间和流速，一般根据预实验使用。

5. 多循环分析物法

1. 运行 Prime 并用固定缓冲液填充注射器和腔室。选择 Run-Manual run（运行 - 手动 运行），在流路上选择串联的 通道 1-2 ，然后单击 Start（开始）。
2. 以最大流速 （150 μL/min） 开始运行并检测缓冲液 HEPES （pH 7.4）。当达到稳定的基线时，用缓冲液冲洗样品环并清空样品环。
   注:如果在 10 分钟内未达到基线（缓冲液运行时在感应曲线上形成的平衡线），请尝试注入 10 mM 氢氧化钠 30 秒。
3. 用 EDC/NHS（1:1，各 50 μL）溶液活化芯片。
4. 在样品上运行 200 μL 用活化缓冲液稀释的配体 4 分钟。结合稳定后，用缓冲液洗涤样品环。
5. 采样 200 μL 封闭溶液，用缓冲液冲洗样品环，然后用空气清空。观察基线 5 分钟以确保稳定性。
6. 用缓冲溶液稀释分析物，然后以 20 μL/min 的流速取 3.9 μM、7.8 μM、15.625 μM 和 31.25 μM 槲皮素，以及 15.625 μM、31.25 μM、62.5 μM、125 μM 和 250 μM 毛蕊糖素作为样品。
7. 蛋白质 （10 μg/mL-50 μg/mL） 与配体的结合时间为 240 s，自然解离时间为 360 s。将流速提高至 150 μL/min，并注入适当的再生缓冲液以去除分析物。

6. 再生

1. 对于再生，使用 10 mM 甘氨酸-HCl、高盐或不同 pH 值（例如 2.5、4.5、5.0、5.5 等）的酸碱溶液。
2. 要筛选再生条件，请使用 run-wizard-assay development-regeneration scouting 并单击 New。在流路上选择 1-2 个串联的通道，选择芯片，然后单击 Next。
3. 要预热芯片，请单击 Startup，这应该完成 3 次以上。输入分析物的名称，并将再生溶液的流速设置为 150 μL/min。

7. 数据分析

1. 使用 SPR 数据分析软件，使用一对一分析模型分析实验结果。
   注意:整个过程在运行缓冲区中进行。SPR 分析过程中使用的其他缓冲液与注射缓冲液相同。

8. 系统维护

1. 实验完成后，取出检测芯片，换上维护芯片。用足够的新鲜纯水更换电泳缓冲液，并用灌注冲洗系统。灌注后，系统将自动切换到待机模式以清洁废液瓶并更换针头水。

Results

为了确定蛋白质是否固定在芯片表面，使用 SPR 传感器图的纵坐标（响应信号）（图 1），同时获得 SPR 曲线的角度位移。 图 2 和 图 3 描述了在 3.9 μM 至 250 μM 的浓度范围内对照还原后，槲皮素和毛萊糖素与 KCNJ2 重组蛋白在 KCNJ2 重组蛋白固定化表面上相互作用的 SPR 曲线。为了最大限度地减少质量传递效应导致的不准确，KCNJ2 重组蛋白分子不仅以低浓度固定，而且在动力学测试期间还受到 20 μL/min 的更高流速。因此，获得了槲皮素和毛萊糖素的剂量反应感觉图。 表 1 和 表 2 显示了动力学速率常数（缔合速率常数 Ka;解离速率常数 Kd）和解离平衡常数 （KD） 的计算结果。在比较两者时，观察到毛萼花素的 Ka 常数高于槲皮素，表明形成复合物所需的时间更少。相反，槲皮素的 Kd 常数低于花萼花素的 Kd 常数，表明当大量 KCNJ2 重组蛋白固定在表...

Discussion

SPR 分析周期分为四个阶段。第一阶段（基线）涉及缓冲区的注入。接下来是第二阶段，配体捕获。传感器芯片 COOH 用 EDC/NHS （1:1） 以 20 μL/min 的流速激活。然后使用 1 M 乙醇胺盐酸盐-NaOH 以 20 μL/min 的流速灭活芯片。进入第三阶段，多循环分析物方法。将分析物以 20 μL/min 的流速注入通道中，缔合期为 240 s，然后解离期为 360 s。缔合和解离过程都在 running buffer 中进行。根据分析物浓度按升序重复分析物的循环。在每个相互作用分析循环之后，需要使用 10 mM 甘氨酸-HCl 作为进样缓冲液，以 150 μL/min 的流速完全再生传感器芯片表面，以去除分析物。然后，通过进行分析物进样和再生步骤来重复分析物的下一个浓缩循环。最后，在第四步中，通过在电泳缓冲液中以 150 μL/min 的流速注入 10 mM 甘氨酸-HCl 来再生芯片。该循环能够快速、无创地筛选各种指标，促进高通量药物筛选²³。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐 （EDC）	南晶试剂，南京，中国	C08296594
无水乙醇	默克化工技术有限公司，中国上海	459836
BIA正化溶液	默克化学技术有限公司，中国上海	49781
封闭液	博盛生物科技有限公司上海，中国	110050
溴乙酸	默克化工技术有限公司，中国上海	17000
钙	新普什生物科技有限公司，中国成都	PU0124-0025
葡聚	糖 Canspec 科学仪器有限公司，中国上海	PM10036
环氧氯丙烷	默克化工技术有限公司，中国上海
乙醇胺盐酸盐	元业生物科技有限公司，中国上海	S44235
甘氨酸-盐酸	默克化工有限公司	G2879
H2O2	默克化工有限公司，中国上海	3587191
H2SO4	南通高新技术产业开发区	2020001150C
HEPES	西雅试剂有限公司，山东，中国	S3872
KCNJ2（人）重组蛋白	Abnova，西美洁科技有限公司，中国北京	H00003759-Q01
MUOH	吉之生化科技有限公司，中国上海	M40590
NaOH	默克化工科技有限公司，中国上海	SX0603
N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）	元业生物科技有限公司，中国上海	S13005
OpenSPRTM	Nicoya
槲皮素	推送生物科技有限公司，中国成都	PU0041-0025
传感器芯片 COOH	Nicoya
醋酸钠	默克化工有限公司，中国上海	229873