利用表面等离子体共振（SPR）技术实时检测生物分子间的动态亲和力

摘要

本研究旨在阐明表面等离子体共振（SPR）技术的原理与方法，该技术在多个领域具有广泛的应用。本文介绍了SPR技术的基本原理、操作简便性及其卓越的效能，旨在促进读者对该技术的更广泛认知与应用。

摘要

表面等离子体共振（SPR）技术是一种灵敏且精确的检测方法，可用于病毒、致病性分子蛋白和受体的检测、血型鉴定以及食品掺假分析等多种生物分子检测。该技术能够快速识别生物分子之间潜在的结合反应，实现无需标记、快速、便捷且非侵入性的多种指标筛查。此外，SPR技术还支持高通量药物筛选的实时检测。本项目简要介绍了SPR技术的应用领域和基本原理，详细阐述了操作流程，包括仪器校准和系统基本操作、配体捕获以及分析物的多循环分析。文中还深入解析了槲皮素和毛蕊异黄酮与KCNJ2蛋白结合的实时曲线及实验结果。总体而言，SPR技术为药物筛选、相关药代动力学的实时检测、病毒检测以及环境与食品安全鉴定提供了一种高度特异、简便、灵敏且快速的方法。

引言

表面等离子体共振（SPR）技术是一种光学检测技术，无需对分析物进行标记，可实现对结合亲和力、动力学和热力学参数的实时、动态定量监测。该方法具有高通量、高灵敏度和良好的重复性，能够测定多种结合速率（on rates）、解离速率（off rates）及亲和力。此外，该技术所需样品量少，进一步提升了其应用价值^1,2。这种快速响应的生物分子检测方法³通过监测生物分子间的亲和结合，已成为当前重要的研究领域。

表面等离子体共振（SPR）技术在药物研发领域具有多种应用⁴。其用途之一是揭示特定药物靶点的结构基础。该技术还可用于鉴定具有显著药理活性的中药有效成分，并研究其作用机制，以进行药物筛选与验证。Gassner 等人通过 SPR 测定建立了双特异性抗体的线性剂量-反应曲线，可用于浓度分析和质量控制⁵。此外，SPR 还可用于药典中的临床免疫原性检测以及疫苗研发⁶。

该技术可应用于农产品和食品安全检测中，用于检测农药残留、兽药残留、非法添加物、致病菌以及重金属

方案

注意：完整的实验传感曲线表明，实验过程可分为八个不同的阶段。

1. 样品与缓冲液的制备

1. 实验前准备传感器芯片。
   1. 将芯片用piranha溶液（30% H₂O₂ : H₂SO₄ = 1:3；v/v）处理2分钟，随后用大量去离子水彻底清洗，并浸泡于无水乙醇中，自然晾干。
   2. 接着，将芯片在浓度为50 M的11-巯基-1-十一醇（MUOH）溶液中浸泡过夜。之后，将芯片置于表氯醇溶液中，在25 °C下反应4小时。
   3. 将芯片从溶液中取出，用蒸馏水和无水乙醇充分清洗。最后，在芯片的金膜表面滴加葡聚糖基础溶液，在25 °C下反应20小时。用去离子水清洗芯片，然后将其浸入溴乙酸溶液中，以实现葡聚糖羟基的羧甲基化修饰。所用槲皮素和芒柄花素的纯度分别≥98.5%和≥99%。
2. 配制所有缓冲液，包括运行缓冲液、活化剂、固定化缓冲液（10 mM醋酸钠）以及再生溶液（10 mM甘氨酸-盐酸，pH 1.5）。活化剂包含115 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、750 mg 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）以及10.5 mL pH 8.5的1 M盐酸乙醇胺-NaOH溶液。通过向每瓶中加入10 mL过滤后的去离子水溶解EDC和NHS....

结果

为了确定蛋白质是否固定在芯片表面，使用 SPR 传感器图的纵坐标（响应信号），同时获得 SPR 曲线的角度位移。图 1、图 2 和 图 3 描绘了在 KCNJ2 重组蛋白固定化表面，槲皮素和芒柄花素与 KCNJ2 重组蛋白相互作用的 SPR 曲线，其浓度范围为 3.9 µM 至 250 µM，并以对照组进行校正。为尽量减少由质量传递效应引起的误差，KCNJ2 重组蛋白分子不仅以低浓度固定，而且在动力学测试期间采用了 20 µL/min 的较高流速。因此，获得了槲皮素和芒柄花素的剂量-响应传感图。表 1 和 表 2 列出了动力学速率常数（结合速率常数 Ka；解离速率常数 Kd）以及解离平衡常数 KD 的计算结果。比较两者发现，芒柄花素的 Ka 常数高于槲皮素，表明其形成复合物所需时间更短；相反，槲皮素的 Kd 常数低于芒柄花素，说明当更多 KCNJ2 重组蛋白固定在表面时，槲皮素降解该蛋白所需时.......

讨论

表面等离子体共振（SPR）分析循环分为四个阶段。第一阶段为基线期，注入缓冲液。随后进入第二阶段，即配体捕获。使用EDC/NHS（1:1）以20 µL/min的流速活化COOH传感器芯片，然后以20 µL/min的流速用1 M盐酸乙醇胺-NaOH对芯片进行封闭。进入第三阶段，即多循环分析物法。以20 µL/min的流速将分析物注入通道，进行240秒的结合期，随后进行360秒的解离期。结合与解离过程均在运行缓冲液中进行。根据分析物浓度由低到高的顺序重复进行分析物循环。每次相互作用分析循环结束后，需使用10 mM甘氨酸-HCl作为注入缓冲液，以150 µL/min的流速对传感器芯片表面进行彻底再生，以去除残留的分析物。随后，通过重复分析物注入和再生步骤，进行下一个浓度的循环。最后，在第四阶段，通过在运行缓冲液中以150 µL/min的流速注入10 mM甘氨酸-HCl对芯片进行再生。该循环可实现对多种指标的快速、无损筛选，有助于高通量药物筛选²³。

此外，该技术可检测早期抗体反应并预测可能的结果²⁴

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）	Nan Jing Reagent,南京,中国	C08296594
无水乙醇	Merck Chemical Technologies Ltd., 上海, 中国	459836
BIAnormalizing 溶液	Merck Chemical Technologies Ltd., 上海, 中国	49781
封闭溶液	博生生物技术有限公司, 上海, 中国	110050
溴乙酸	Merck Chemical Technologies Ltd., 上海, 中国	17000
毛蕊异黄酮	普世生物技术有限公司, 成都, 中国	PU0124-0025
葡聚糖	康赛普科学仪器有限公司, 上海, 中国	PM10036
表氯醇	Merck Chemical Technologies Ltd., 上海, 中国	492515
乙醇胺盐酸盐	远业生物科技有限公司, 上海, 中国	S44235
甘氨酸-HCl	Merck Chemical Technologies Ltd., 上海, 中国	G2879
H2O2	Merck Chemical Technologies Ltd., 上海, 中国	3587191
H2SO4	南通高新技术产业开发区, 中国	2020001150C
HEPES	西亚试剂有限公司, 山东, 中国	S3872
KCNJ2（人）重组蛋白	Abnova, 西美杰科技有限公司, 北京, 中国	H00003759-Q01
MUOH	吉至生化科技有限公司, 上海, 中国	M40590
NaOH	Merck Chemical Technologies Ltd., 上海, 中国	SX0603
N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）	远业生物科技有限公司, 上海, 中国	S13005
OpenSPRTM	Nicoya
槲皮素	普世生物技术有限公司, 成都, 中国	PU0041-0025
COOH 传感器芯片	Nicoya
乙酸钠	Merck Chemical Technologies Ltd., 上海, 中国	229873