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小鼠肺内气管移植：肺移植后闭塞性气道疾病研究模型

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DOI：

10.3791/65953

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2023年11月10日

 ,  ,  , 
1Latner Thoracic Research Laboratories, Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, 2Temerty Faculty of Medicine, University of Toronto

本文内容

摘要

小鼠肺内气管移植（IPTT）模型对于研究肺移植后闭塞性气道疾病（OAD）具有重要价值。该模型可深入揭示同种异体移植后气道闭塞过程中肺特异性的免疫学和血管生成行为，且具有高度可重复性。本文中，我们描述了IPTT的操作步骤及其预期结果。

摘要

小鼠肺内气管移植（IPTT）被用作肺移植后闭塞性气道疾病（OAD）的模型。该模型最初由我们团队报道，因其技术可重复性高，且适用于研究免疫学行为和治疗干预措施，现已被广泛应用于OAD的研究。

在IPTT模型中，将啮齿类动物的气管移植物通过胸膜直接植入受体肺组织内。该模型不同于异位气管移植（HTT）模型，后者将移植物移植至皮下或网膜部位；也不同于原位气管移植（OTT）模型，后者以供体气管替代受体自身的气管。

成功实施IPTT模型需要具备高级的麻醉和外科手术技能。麻醉技能包括对受体进行气管插管、设置合适的通气参数，以及在麻醉恢复后适时拔管。外科手术技能对于将移植物精确放置于肺内，以及有效闭合脏层胸膜以防止漏气和出血至关重要。通常，学习该技术的过程大约需要2个月。

与HTT和OTT模型不同，在IPTT模型中，同种异体移植气道在相应肺微环境中发生气道闭塞。这使得研究人员能够研究肺移植后气道闭塞所涉及的肺特异性免疫和血管生成过程。此外，该模型的独特之处还在于其可形成三级淋巴样器官（TLOs），这在人类肺移植受体中同样可见。TLOs由T细胞和B细胞群体组成，其特征是存在高内皮微静脉，可介导免疫细胞的募集；因此，TLOs可能在移植物的接受与排斥过程中发挥关键作用。我们得出结论：IPTT模型是研究肺移植受体中气道闭塞发展所涉及的肺内免疫和促纤维化通路的有力工具。

引言

肺移植已被确立为治疗终末期呼吸系统疾病患者的有效方法。然而，肺移植受者的中位生存期仅为约6年，移植后第一年以上的死亡主要原因在于闭塞性细支气管炎（OB）的发生，这是一种阻塞性气道疾病（OAD）1。

已采用多种动物模型来研究阻塞性气道病（OAD）的发病机制。其中一种模型是异位气管移植（HTT）模型。2在此模型中，将气管移植物植入受体的皮下组织或网膜中。移植物因缺血导致气管上皮细胞丢失，随后发生同种反应性淋巴细胞浸润及供体上皮细胞凋亡。成纤维细胞和肌成纤维细胞迁移至气管周围，分泌细胞外基质。最终导致气道管腔完全纤维性闭塞。该异体气管移植模型技术操作简便，可提供 体内 环境，且具有高重复性。

另一种用于研究气道闭塞病（OAD）的模型是大鼠原位气管移植（OTT）模型，该模型将气管移植物植入受体气管中，以维持生理通气功能3。在此模型中，缺血导致供体上皮细胞耗竭，随后由受体来源的上皮细胞在气管内取代，形成通畅的气道，并伴有轻度纤维化。尽管这些模型有助于理解肺移植后气道闭塞的发生机制，但在模拟肺实质微环境方面仍存在局限性。

我们研究团队引入了大鼠肺内气管移植（intrapulmonary tracheal transplantation, IPTT）模型，该模型将气管移植物植入受体肺组织中4（图1）。IPTT模型表现出在肺微环境中发生的气道腔内纤维性闭塞。此外，该模型已成功应用于小鼠，而小鼠的技术操作难度较大鼠IPTT更高5,6,7,8,9,10。小鼠IPTT模型的建立使我们能够利用转基因小鼠更深入地探究肺移植后闭塞性细支气管炎（OAD）的肺部免疫微环境的复杂机制。

IPTT 模型具有一些独特的特征。其中之一是新生血管形成，该过程由肺循环促进，并在气道闭塞中发挥关键作用4,10。此外，IPTT 模型表现出淋巴样聚集物，其中部分聚集物含有表达外周淋巴结地址素的高内皮微静脉，表明其为三级淋巴器官（TLOs）7,8。TLOs 类似于淋巴结，由T细胞、B细胞组成，且通常伴有生发中心及滤泡树突状细胞11,12。TLOs 已在多种慢性炎症性疾病中被报道，包括气道闭塞，因此 IPTT 模型适用于研究 TLOs 在肺移植后气道闭塞中的作用7,8,11,12,13。本文介绍了小鼠 IPTT 模型的方法学，旨在帮助研究人员熟悉该模型，以促进对肺移植后气道闭塞的进一步研究。

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方案

所有动物的处理均遵循加拿大动物护理委员会《实验动物护理与使用指南》中规定的要求。实验方案已获得多伦多综合医院研究所（University Health Network）动物护理委员会的批准。

1. 供体手术

注意：本实验以 BALB/c 小鼠作为供体示例。所有操作必须采用无菌技术进行。

  1. 手术前，记录每只小鼠的体重。
  2. 使用 CO2 室处死小鼠。
  3. 确认死亡后，将小鼠置于仰卧位，并用胶带固定四肢。
  4. 用 70% 异丙醇对术区进行消毒。
    注意：如当地动物伦理委员会建议且有必要，可剪除切口部位的毛发。
  5. 从腹部中线开始，沿中线切开皮肤，向上延伸至颈前部。
  6. 通过小心牵开脂肪垫、将胸骨舌骨肌向两侧移动，并分离气管周围结缔组织以暴露气管。使用镊子在气管与食管之间创建间隙。
  7. 抬起剑突并剪开膈肌。
  8. 抬起胸骨，插入止血钳以确保从胸骨到颈部区域的通路清晰。夹住两侧肋骨，并剪开胸骨，向上延伸穿过颈部肌肉。
  9. 移除胸腺以及任何阻碍气管的脂肪或肌肉组织，以暴露气管分叉处。
  10. 剪断左右主支气管，并小心地将气道与食管分离。
  11. 剪断喉部并将其移除。
  12. 用无菌生理盐水或保存液喷洒已分离的气管，或用浸有无菌生理盐水或保存液的无菌纱布覆盖，并将其置于冰上以维持其活性。

2. 受体手术

注意：C57BL/6 小鼠用作本实验受体的示例。

  1. 在手术当天早晨，以1 mg/kg的剂量皮下注射缓释丁丙诺啡。
  2. 使用5%异氟烷在诱导室中诱导麻醉。
  3. 当小鼠进入轻度麻醉状态后，腹腔注射由（0.1 mg/g）赛拉嗪和（0.01 mg/g）氯胺酮组成的混合制剂。
  4. 将小鼠放回诱导室，维持2-3%异氟烷麻醉。
  5. 剃除手术部位的毛发。同时，在计划切口部位沿切口线皮下注射布比卡因，剂量为7 mg/kg，作为局部阻滞。
  6. 在进行口喉插管前，确认小鼠对脚趾夹捏无反射反应。使用20 G静脉导管经口喉插管，并连接至呼吸机，设置潮气量为500 µL，呼吸频率为120次/分钟，吸入100%氧气和2%异氟烷。使用带有夹子的支架固定舌头，将动物保持垂直体位，颈部伸展，以方便操作。
  7. 启动加热垫，将小鼠置于垫上右侧卧位，头部远离术者，尾部朝向术者（图2）。用胶带固定四肢。在眼睛上涂抹兽用眼膏，防止麻醉期间角膜干燥。
  8. 用7.5%聚维酮碘对手术区域进行刷洗，70%异丙醇消毒，再用10%聚维酮碘重复刷洗。铺设无菌手术巾覆盖手术区域。
  9. 在此期间，将供体气管装入16 G静脉导管中（图3C，D）。
  10. 使用手术刀在受体皮肤上做切口，并电凝肌肉和结缔组织。
  11. 打开第五或第六肋间隙，使用两个牵开器将肋骨撑开。
  12. 使用棉签和剪刀解剖下肺韧带。
  13. 模拟供体气管植入路径的建立过程（图3G，H）。
  14. 通过三通止血夹部分阻塞呼吸机呼气管路，以促进左肺膨胀。
  15. 使用20 G针头穿刺左肺，建立植入通道。确保穿刺深度大致等于气管异体移植物的长度。选择肺边缘处作为穿刺点（如图3I所示），并确保通道与台面平行（如图3J中蓝色圆圈所示）。
    注意：穿刺角度向上可能导致胸膜层穿透，而角度过深可能引起大血管出血（如图3J中红色叉号所示）。
  16. 将16 G静脉导管插入左肺，并将供体气管推出至左肺内。气管异体移植物植入后，释放三通止血夹，使呼气管路恢复通畅。
  17. 使用夹子封闭胸膜穿刺部位（图3K，L）。将夹子精确放置于穿刺点，其边缘应与肺边缘轮廓对齐（如图3L中蓝色圆圈所示）。
    注意：夹闭位置不正确可能导致密封不严和漏气，夹闭深度不足可能导致术后夹子脱落（如图3L中红色叉号所示）。
  18. 用生理盐水填充胸腔，并用纱布吸除盐水。
  19. 重新膨胀左肺，并采用连续缝合法关闭肋骨。
  20. 采用间断缝合法关闭肌肉和皮肤。
  21. 手术结束时，以5 mg/kg的剂量皮下注射美洛昔康镇痛剂。
  22. 观察受体小鼠直至其清醒，然后拔除气管插管，将小鼠放入笼中。
    注意：受体小鼠应单独饲养。
  23. 术后24小时开始，每日一次皮下注射美洛昔康（5 mg/kg），持续给药3天。

3. 从受体小鼠收集样本

  1. 使用5%异氟烷在诱导室中诱导麻醉。
  2. 在进行经口插管前，确认脚趾夹捏反射消失。插管方法和呼吸机设置与受体手术相同。
  3. 将小鼠置于仰卧位，并固定四肢。
  4. 用70%异丙醇对术区进行消毒处理。
  5. 从腹部中线开始，沿皮肤正中切口延伸至颈前区域。
  6. 使用连接25 G针头的1 ml注射器经下腔静脉放血，导致小鼠安乐死。
  7. 以与供体小鼠相同的方式打开胸腔并暴露气管。用7-0丝线将气管在插管周围结扎。
  8. 去除胸腺、脂肪和肌肉组织，以暴露心脏。
  9. 剪开左心房、右心房和下腔静脉。通过右心室灌注3 mL无菌生理盐水冲洗肺脏。
  10. 对于组织学分析，经插管向肺内注入10%福尔马林进行肺膨胀固定。
  11. 拔出通气管，并用7-0丝线结扎气管。
  12. 切断喉部和食管，将其向下牵拉，随后取出心肺组织块，并置于10%福尔马林中。

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结果

根据我们的经验，熟练掌握该模型通常需要约2个月的培训。一旦达到熟练水平，供体操作通常需要15分钟，而受体操作则大约需要30分钟。对于熟练的操作者，预期死亡率为0%。

图4A中，气管异体移植物被纤维母细胞组织完全阻塞，上皮细胞明显遭到破坏。相反，在图4B中，气管同系移植物保持通畅，上皮细胞得以保留。

图5展示了一例肺部，其中已移植气管异体移植物，可见淋巴样聚集物的存在。

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讨论

小鼠IPTT手术包含若干关键步骤。在麻醉过程中，首要的关键步骤是气管插管。必须将小鼠保持在适当高度，使其四肢接触桌面，以便观察声带并立即进行插管。此外，需仔细调节呼吸潮气量和呼气末正压（PEEP）。通常情况下，对于体重为25–30 g的小鼠，500 µL的潮气量和2 cmH2O的PEEP已足够。然而，体型较大的受体小鼠可能会出现"呃逆"现象，提示存在缺氧。此时，可能需要增加潮气量、PEEP，并暂时夹闭呼气管以促进肺复张。如果呃逆持续存在，应调整气管插管的深度。最后，气管插管的拔管时机至关重要，必须确认受体小鼠的呼吸频率，以确保其已充分恢复。若未做到这一点，可能导致拔管后死亡。

关于手术操作，移植气管的准确定位至关重要。必须模拟合适的进针方向，以准确放置气管移植物（图3G）。如果进针路径过浅，气管移植物可能穿透胸膜；而插入过深则可能导致肺血管穿孔并引发严重出血。另一个关键步骤是确保插入部位的严密封闭，需使用不锈钢夹将插入同种异体气管移植物后的胸膜切口牢固固定（

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披露

本文作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Jerome Valero 对本文稿的编辑。 图1 和 图3I,J,L 使用 BioRender.com 创建。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BALB/cJ杰克逊实验室8-10 周，25-30 克雄性，供体
BD 1 mL 注射器贝克顿·迪金森309659
BD PrecisionGlide 针头 Aiguile BD
PrecisionGlide		贝克顿·迪金森305122
Bovie Change-A-Tip 豪华高温电凝笔BovieDEL1
C57BL/6J杰克逊实验室8-10 周，25-30 克雄性，受体
Dumont #5/45 镊子F·S·T11251-35
Ethicon Ligaclip 多夹施夹器EthiconLX107
超细 Graefe 镊子F·S·T11150-10
Glover 蛙嘴钳Integra320-127
Halsted-蚊式止血钳F·S·T13009-12
Horizon 钛夹结扎夹Teleflex001201
Leica M651 显微外科手术手动显微镜Leica
带弹簧锁的 Magnetix 固定器CD+ LABSACD-001
显微外科剪刀Jarit277-051
小动物及围产期大鼠呼吸机 Model 687哈佛55-0001
Perfadex PlusXVIVO19850
钝头牵开器头 - 2.5 mmCD+ LABSACD-011
小动物手术台CD+ LABSACD-003
Surgipro 蓝色 24" CV-1 锥形双针缝线CovidienVP702X
Systane 软膏Alconn1444062
System ElastomerCD+ LABSACD-007
Terumo Surflo 静脉导管，20 G x 1 英寸Terumo Medical CorporationSR-OX2025CA
VMT 台式手术台benson91803300

参考文献

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