本文介绍了一种利用名为 Erasmus Ladder 的设备，对精细运动能力以及在面临挑战时的适应性和联合性运动学习进行无创且自动化评估的实验方案。该方法可调节任务难度，以检测从显著到细微不同程度的运动功能障碍。
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使用 Erasmus Ladder 监测小鼠的精细运动与联合运动学习
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
行为由动作塑造，而动作需要力量、协调性和学习等运动技能。如果没有从一个姿势转换到另一个姿势的能力，维持生命所必需的任何行为都将无法实现。然而，多种疾病都可能导致运动技能受损。因此，从细胞、分子和神经环路水平研究运动功能的机制，并理解运动障碍的症状、病因及进展过程，对于开发有效的治疗方法至关重要。小鼠模型常被用于此类研究。
本文介绍了一种利用一种名为 Erasmus Ladder 的自动化工具监测小鼠运动表现和学习能力多个方面的实验方案。该检测包含两个阶段：第一阶段为训练小鼠穿越由不规则横杆组成的水平梯子（"精细运动学习"）；第二阶段则在动物行进路径中设置障碍。该干扰可以是突发性的（"挑战性运动学习"），也可以在干扰前伴随一个听觉提示音（"关联性运动学习"）。该任务操作简便，且全程由自动化软件支持完成。
本报告展示了如何通过敏感的统计方法分析该测试的不同读数，从而利用少量小鼠对小鼠运动技能进行精细监测。我们提出，该方法将能够高度敏感地评估由环境改变引起的运动适应，以及运动功能受损的突变小鼠在早期阶段的细微运动缺陷。
引言
已开发出多种测试方法用于评估小鼠的运动表型。每种测试可提供有关运动行为特定方面的信息1。例如，开放旷场实验用于评估一般运动活性和焦虑状态；转棒实验和行走横梁实验用于评估协调性和平衡能力；足迹分析用于研究步态；跑步机或转轮实验用于研究强制性或自主性体力活动；而复杂转轮则用于研究运动技能学习。为了分析小鼠的运动表型，研究人员必须依次进行这些测试，这通常需要大量时间和精力，并涉及多个动物群组。如果已有细胞或神经环路水平的信息，研究人员通常会选择监测相关行为方面的测试，并据此展开后续研究。然而，目前尚缺乏能够以自动化方式区分运动行为不同方面的实验范式。
本文介绍了一种使用Erasmus Ladder2,3的实验方案，该系统可用于对小鼠多种运动学习特征进行综合评估。该方法的主要优势在于其可重复性和高灵敏度，同时能够调节运动难度，并将运动表现缺陷与关联性运动学习障碍区分开来。系统主要部件为一个水平梯子，其横档高低交替排列（高横档H，低横档L），并配备触敏传感器，用于检测小鼠在梯子上的位置。梯子由2 × 37个横档组成（低横档L，6 mm；高横档H，12 mm），横档间距为15 mm，左右交替排列，间隔30 mm（图1A）。各个横档可独立移动，以生成不同难度等级，例如通过将高横档升高18 mm来设置障碍。结合自动记录系统，并将横档模式的变化与感觉刺激相关联，Erasmus Ladder可用于检测精细运动学习能力以及对环境挑战（如出现更高的横档以模拟障碍物，即非条件刺激[US]）或与感觉刺激（如声音，即条件刺激[CS]）关联时的运动表现适应能力。测试包含两个不同阶段，每个阶段持续4天，每天评估小鼠运动表现的改善情况，期间小鼠每天接受42次连续试验。在初始阶段，训练小鼠穿越梯子以评估"精细"或"熟练"运动学习。第二阶段则包含交错进行的试验，在移动小鼠行进路径中设置更高横档形式的障碍。该干扰可为突发性，用于评估"受挑战"的运动学习（仅US试验），或由听觉音调预先提示，以评估"关联性"运动学习（配对试验）。
Erasmus梯子是相对较新开发的实验方法2,3。由于建立和优化该实验方案需要投入大量精力，且其最初设计主要用于评估依赖小脑的联想学习能力，而未深入探索其揭示其他运动功能障碍的潜力，因此尚未被广泛使用。迄今为止，该方法已验证可用于揭示与小鼠小脑功能障碍相关的细微运动损伤3,4,5,6,7,8。例如，缝隙连接蛋白36（connexin36，Cx36）基因敲除小鼠的橄榄核神经元中缝隙连接受损，导致因缺乏电紧张耦合而出现放电缺陷，但其运动表型此前难以明确。通过Erasmus梯子检测发现，下橄榄核神经元在小脑运动学习任务中的作用是精确编码刺激的时间信息，并促进对意外事件的学习依赖性反应3,4。脆性X智力低下蛋白1（Fragile X Messenger Ribonucleoprotein 1，Fmr1）基因敲除小鼠是脆性X综合征（FXS）的动物模型，表现出明显的认知障碍以及较轻的程序性记忆形成缺陷。Fmr1基因敲除小鼠在Erasmus梯子实验中，各次试验的步时、错误步数或跨会话的运动表现改善方面均未显示出显著差异，但在面对突然出现的障碍物时，无法像野生型（WT）同窝小鼠那样调整行走模式，从而证实了其存在特定的程序性记忆和联想记忆缺陷3,5。此外，具有小脑功能缺陷的细胞特异性小鼠突变系，包括浦肯野细胞输出、突触增强以及分子层中间神经元或颗粒细胞输出受损的小鼠，均表现出运动协调障碍，表现为高效步态模式的习得能力改变以及穿越梯子所需的步数异常6。新生儿脑损伤可导致小脑学习能力缺陷和浦肯野细胞功能障碍，这些异常同样可通过Erasmus梯子检测到7,8。
在本视频中，我们提供了一份全面的分步指南，详细介绍了行为学实验房间的设置、行为学测试流程以及后续的数据分析方法。本报告力求通俗易懂、便于操作，专为初学者设计。该实验方案有助于理解小鼠在运动训练不同阶段的表现及其所采用的典型运动模式。最后，本文提出了一套系统化的数据分析工作流程，采用强大的非线性回归方法，并提供了有价值的建议和指导，以帮助研究人员在其他研究背景下对本方案进行调整和应用。
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方案
在本研究中，使用了成年（2-3月龄）C57BL/6J小鼠，雌雄均有。动物每笼饲养2至5只， 随意摄取 在动物实验单元中，动物可自由获取食物和水，并置于温度可控、12小时明暗循环的环境中饲养。所有实验程序均遵循欧洲及西班牙相关法规（2010/63/UE；RD 53/2013），并经巴伦西亚自治区伦理委员会和米格尔·埃尔南德斯大学动物福利委员会批准。
1. 行为学实验房间的设置
- 每天在同一时间预约行为测试室，并确定待使用小鼠的名单和顺序，以及它们的饲养安排。
- 在未进行测试时，将实验小鼠安置在测试室外，以避免其听到空气压缩机和Erasmus Ladder发出的声音。
- 检查Erasmus Ladder系统的各个组件是否正常并已准备就绪：网络路由器、安装有软件的计算机（参见材料表）、空气压缩机、两个目标箱，以及踏板已正确安装的梯子。
- 每只动物测试结束后，用清水彻底清洁目标箱、梯子及踏板；每天训练结束后，再使用清水和70%乙醇进行彻底清洁。
2. 行为学测试方案
- 创建一个实验并将实验方案输入软件中（补充图 S1).
- 打开软件。
- 创建实验，请选择 文件 | 新建实验 | 新建或设置 | 实验方案.
注意：本研究中使用的默认方案名为 EMC，由荷兰鹿特丹伊拉斯姆斯大学医学中心设计。 - 为实验命名并点击 好的.
- 检查所选的默认EMC协议是否包含 4 天不间断的实验阶段 (每天42次无干扰试验 和 4天的挑战阶段 (42 次每日混合试验：无干扰、仅条件刺激（声音）、仅非条件刺激（障碍物）、配对刺激（声音提示障碍物） （参见 图1B）。在右侧面板中，同时选中光线索（最长持续3秒）、气流线索（最长持续45秒）和顺风是 在所有试验类型中），用于鼓励小鼠穿越梯子，以及声音提示（250 毫秒， 是 仅在 仅CS 和 配对试验).
- 要创建不同的实验方案，请选择 设置 | 实验方案 | 新建 | 从零开始 或 从EMC方案中复制 并进行修改，编辑与之相关的表格行 实验天数（实验持续天数） 和 每日试验的次数和类型.
注意：静息时间、提示类型及激活方式、持续时间、强度和间隔也可根据实验问题进行调整。 - 要打开会话列表并命名受试者，请选择 设置 | 会话列表.
- 点击 添加受试者和变量.
- 输入每项具体内容 小鼠编号，出生日期，性别，基因型，以及与小鼠顺序列表相对应的相关类别。
- 开始实验补充图 S2).
- 开始之前，检查软件是否已打开，然后开启梯子。
- 检查空气压缩机是否已连接并打开。
- 打开 采集窗口, 打开已创建的实验。
- 选择 采集 | 开放采集.
- 将带有软件指示编号的小鼠放入起始目标箱（梯子右侧）。
- 选择 小鼠标识符 在第一次会话中获取。
- 点击 开始采集.
- 按压 红色梯形菜单旋钮 3x. 检查会话是否开始，并自动控制和记录小鼠的运动，直至该会话最后一次试验结束。
- 结束会话。
- 检查在42结束时nd 试验过程中，显示屏会显示消息 发送数据 和 获得性.
- 将小鼠放回其居住笼中。
- 清洁梯子和目标箱。
- 放置下一只小鼠，并从步骤 2.2.6 开始重复后续操作。
- 每天执行所选类型的实验 session，直至实验方案结束。根据所选方案，每天重复步骤 2.2 和 2.3。
- 导出数据（补充图 S2).
- 为了可视化记录的数据，可选择以下选项 分析 菜单， 试验统计学, 会话统计信息，以及 组统计量 & 图表.
注意：数据可下载为电子表格，包含单次试验的个体数据以及同类型试验在单个实验环节内的平均值。也可根据特定分析所选的变量对实验环节进行筛选。 - 点击 导出 右上角的按钮，选择文件格式（电子表格）和文件夹位置。
- 右键单击自动生成的图表，然后选择 保存到文件 作为 *.jpg.
- 为了可视化记录的数据，可选择以下选项 分析 菜单， 试验统计学, 会话统计信息，以及 组统计量 & 图表.
3. 数据分析
注意：Erasmus Ladder 会根据触敏传感器的实时记录自动测量一系列参数。在分析过程中，用户所选择的输出参数将在电子表格中进行整理和处理。除了软件生成的图表外，用户还可使用自己选定的绘图软件绘制图表，以可视化不同参数在各实验阶段中的特定变化。
- 在前4天内选择并分析特定参数，以评估基础动机或焦虑状态、感觉反应、运动表现以及精细运动学习。
- 选择并绘制对照参数，包括对光和气流线索的响应，如目标箱中的静止时间和静止期后离开目标箱所需的时间（图2A）。
注：野生型（WT）小鼠的静止时间或对线索的反应相对恒定。其他参数如离开频率在WT小鼠中基本可忽略——动物通常不会在无提示下离开休息箱，或一旦进入梯子后不会返回，导致每次试验的离开频率等于1。若动物在提示施加前离开，系统将自动启动气流迫使小鼠返回目标箱；此情况不被软件计为一次有效试验。 - 选择并绘制提示后在梯子上的时间，定义为小鼠离开目标箱后穿越梯子所花费的时间（图2B）。
注：幂函数非线性回归是评估学习效果的稳健方法。皮尔逊（Pearson）或斯皮尔曼（Spearman）相关系数（R）可用于判断数据拟合优度（当动物在多次试验中学习/表现提升时，R值接近1；R值接近0则表明数据恒定，小鼠未表现出学习）。 - 选择并绘制步态模式参数，例如含错误步态的试验百分比，作为敏感的学习指标（图2C）。
- 将正确步态定义为从一个高横杆到另一个高横杆（H-H）的移动，无论步长如何。将涉及低横杆的步态类型视为 错误步态。
- 根据压杆之间的步长和方向性，将正确步态和错误步态进一步划分为短步、长步、后退步和跳跃（见图1A）。
- 选择并绘制对照参数，包括对光和气流线索的响应，如目标箱中的静止时间和静止期后离开目标箱所需的时间（图2A）。
- 在最后4天内选择并绘制特定参数，以评估挑战性运动学习（仅US试验）和关联学习（配对试验）。
- 选择并绘制提示后在梯子上的时间（图3）。
- 选择并绘制含错误步态的试验百分比（图4A）。
- 选择并绘制障碍前与障碍后步态时间，定义为梯子同侧在障碍物出现前（对照步）和障碍物出现后（适应步）横杆激活时间的毫秒级差异（图4B）。
注：应进行障碍前后步态时间的比较分析，以评估每种试验类型内部的数据变化。该参数用于衡量小鼠在关联学习过程中预测并克服障碍的能力。
- 使用专用统计软件（例如 SigmaPlot）分析数据。对跨次试验中同类型试验收集的数据进行幂函数非线性回归分析，以更高效地描述学习过程，并采用双因素重复测量方差分析（Two-Way Repeated Measures ANOVA）比较不同试验类型之间的差异。
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结果
Erasmus Ladder 设备、设置及所采用的实验方案如图所示 图1该方案包括四个无干扰阶段和四个挑战阶段（每个阶段包含42次试验）。每次试验指小鼠从起始目标箱到终点目标箱在梯子上行走的一次完整运行。在每个阶段开始时，将一只小鼠放入其中一个起始箱中。经过15 ± 5 s的固定时间（“静息”状态）后，开启光源（提示1，最长3 s）。随后施加轻柔气流刺激（提示2，最长45 s），以促使小鼠离开箱体并走向梯子的另一端。小鼠对气流刺激的反应时间因个体和阶段而异，可作为评估不同组间动机或焦虑状态的参数。当小鼠到达终点目标箱后，立即开始下一次试验。
在第1至第4天期间，野生型小鼠的静止时间以及对光提示的反应时间未见差异，但对气流提示的反应时间在第1天到第2天之间略有减少（图2A）。小鼠穿越梯子所需时间的测量结果显示，从第1天到第4天呈现出显著的学习曲线，可用幂回归曲线拟合（R = 0.50，*p = 0.047，...
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讨论
与现有方法相比，Erasmus Ladder 在运动表型评估方面具有显著优势。该测试易于实施，具有自动化、可重复的特点，并允许研究人员利用同一批小鼠独立评估运动行为的多个方面。在本研究中，得益于设备特性、实验设计和分析方法的优势，可重复性使得仅用少量野生型小鼠即可获得可靠的数据。例如，与传统的横梁行走实验相比，Erasmus Ladder 通过添加诱导入梯路径的动机性提示（气流和光线）以及推动小鼠完成试验的尾随气流，提高了实验的一致性，并避免了实验人员干预——后者是导致变异性的主要来源。
需要使用空气压缩系统产生气流，该气流可调节方向和位置以对准小鼠。当小鼠在预定试验开始前试图离开目标箱时，气流会从相反方向产生30 km/h的迎面风，迫使小鼠返回目标箱。在试验过程中，气流还会产生持续的尾随风（1至16 km/h），直至小鼠完全通过梯子并进入对面的目标箱。若无加压气流作为穿越梯子的激励因素，小鼠常会在梯级上停留并缓慢地调头返回，从而引入不利于分析的探索性变量。
本文所述的标准方案可在8天的时间范围内，评估基本的精细运动协调能力与...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢音视频技术员兼视频制作人 Rebeca De las Heras Ponce，以及兽医主管 Gonzalo Moreno del Val 在小鼠实验过程中对良好操作规范的监督。 本工作由加泰罗尼亚自治区政府卓越计划（GVA Excellence Program，项目编号 2022/8）和西班牙研究署（Spanish Research Agency，项目编号 PID2022143237OB-I00）资助，资助对象为 Isabel Pérez-Otaño。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| C57BL/6J 小鼠（Mus musculus） | Charles Rivers | ||
| Erasmus Ladder 装置 | Noldus，荷兰瓦赫宁恩 | ||
| Erasmus Ladder 2.0 软件 | Noldus，荷兰瓦赫宁恩 | ||
| Excel 软件 | Microsoft | ||
| Sigmaplot 软件 | Systat Software, Inc. |
参考文献
- Brooks, S. P., Dunnett, S. B. Tests to assess motor phenotype in mice: a user's guide. Nat. Rev. Neurosci. 10 (7), 519-529 (2009).
- Noldus. , https://www.noldus.com/erasmusladder (2023).
- Cupido, A., et al. Detecting cerebellar phenotypes with the Erasmus ladder[dissertation]. , Erasmus University Rotterdam PhD dissertation. (2009).
- Van Der Giessen, R. S. Role of olivary electrical coupling in cerebellar motor learning. Neuron. 58 (4), 599-612 (2008).
- Vinueza Veloz, M. F. The effect of an mGluR5 inhibitor on procedural memory and avoidance discrimination impairments in Fmr1 KO mice. Genes Brain Behav. 11 (3), 325-331 (2012).
- Vinueza Veloz, M. F. Cerebellar control of gait and interlimb coordination. Brain Struct. Funct. 220 (6), 3513-3536 (2015).
- Sathyanesan, A., Kundu, S., Abbah, J., Gallo, V. Neonatal brain injury causes cerebellar learning deficits and Purkinje cell dysfunction. Nat. Commun. 9 (1), 3235(2018).
- Sathyanesan, A., Gallo, V. Cerebellar contribution to locomotor behavior: A neurodevelopmental perspective. Neurobiol. Learn Mem. 165, 106861(2019).
- McKenzie, I. A. Motor skill learning requires active central myelination. Science. 346 (6207), 318-322 (2014).
- Xiao, L. Rapid production of new oligodendrocytes is required in the earliest stages of motor-skill learning. Nat. Neurosci. 19 (9), 1210-1217 (2016).
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