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方法文章

利用两种基于阻抗的生物传感器测量癌细胞和细胞因子刺激下脑血管内皮屏障完整性的变化

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DOI：

10.3791/65959

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2023年9月22日

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Medicine and Pathology, School of Medical Sciences, University of Auckland, 2Centre for Brain Research, University of Auckland, 3School of Biological Sciences, University of Auckland

本文内容

摘要

在此，我们演示了使用基于阻抗的生物传感器（ECIS 和 cellZscope）测量脑血管内皮屏障强度的技术。我们详细介绍了制备过程以及向系统中添加各种刺激物的方法和技术。 体外 脑血管内皮模型。我们对结果进行测量、记录，并提供代表性分析。

摘要

血脑屏障（BBB）可保护脑实质免受血液中有害病原体的侵害。血脑屏障由包括周细胞、星形胶质细胞足突以及紧密连接的内皮细胞在内的神经血管单元组成。其中，脑内皮细胞构成了抵御血源性病原体的第一道屏障。在癌症和神经炎症等病理状态下，血液中的循环因子可破坏这一屏障。屏障破坏后，病原体得以进入或损伤脑部区域，导致疾病进展显著恶化。由于针对脑部病变的治疗手段有限，这会显著加重患者的预后。因此，新兴研究致力于探索潜在的治疗方法，以阻止血液中的有害因子与脑内皮细胞相互作用。

市售的细胞电阻-基底阻抗传感（ECIS）和cellZscope仪器可通过测量血脑屏障（BBB）内皮等细胞单层的阻抗来评估其屏障强度。本文详细介绍了这两种生物传感器在加入不同刺激因素后，用于评估脑内皮屏障完整性的方法。尤为重要的是，我们强调了这些仪器具备高通量能力，可同时研究多个变量和生物学处理条件。

引言

本文讨论了微血管细胞评估领域的当前发展趋势。我们重点介绍了两种 commercially available 平台在测量脑微血管内皮细胞屏障特性方面的应用。内皮细胞是面向血液、衬于血管壁内表面的细胞。然而，脑微血管具有独特性，因其参与构成具有保护作用的血脑屏障（BBB）1,2,3。血脑屏障的功能是调控分子从血液向脑组织的转运。影响中枢神经系统（CNS）的外周疾病通常与血脑屏障功能障碍相关4,5。构成血脑屏障的解剖结构并不存在于体内其他部位的血液-组织交界处6。这些解剖结构包括位于脑内皮细胞附近的周细胞，其可调控内皮细胞的增殖和通透性；参与营养物质转运和结构支持的星形胶质细胞足突7,8；作为脑内常驻巨噬细胞的小胶质细胞，常与神经炎症和缺血相关9,10,11,12；以及形成无窗孔、紧密连接的单层细胞结构的脑内皮13,14。脑内皮通常被称为“脑内皮屏障”，通过五种不同的机制形成结构和功能上的屏障。第一，细胞旁屏障由侧向细胞-细胞连接处的黏附作用形成；第二，跨细胞屏障通过调控内吞作用得以维持；第三，特化的基底膜通过富含胶原蛋白的细胞外基质为内皮提供锚定和支持15,16；最后两种机制则分别依赖于酶和转运蛋白，用以调控药物代谢和大分子物质的摄取17。

细胞旁相互作用构成了脑血管内皮屏障的主要部分，该屏障由紧密连接（TJs）介导，紧密连接包含膜蛋白claudins、occludin以及连接黏附分子（JAMs）18。这些膜蛋白之间强烈的同型结合形成了第一道结构屏障，而JAMs还可与闭锁小带蛋白（zonula occludens）等辅助蛋白连接，从而将紧密连接与肌动蛋白细胞骨架相连19,20。肌动蛋白的连接使紧密连接定位于内皮细胞的顶端区域21，从而在功能上使内皮细胞极化，在顶端即"朝向血液"的一侧形成结构屏障。在内皮细胞的基底外侧区域，高度特化的黏附连接（AJs）在维持细胞形态方面发挥调节作用。黏附连接包含钙依赖性钙黏蛋白（cadherins），后者通过连环蛋白（catenin）家族复合物将相邻内皮细胞的细胞骨架连接起来20,22。血管内皮钙黏蛋白（VE-Cadherin）是一种此类钙黏蛋白，可调控紧密连接蛋白的表达及整体内皮屏障功能，以维持内皮单层的完整性23,24,25,26,27。炎症调节因子如肿瘤坏死因子-α（TNFα）可促使VE-钙黏蛋白从细胞连接处内化，导致内皮屏障稳定性下降28,29,30。血小板内皮细胞黏附分子（PECAM）31是另一种黏附连接中的钙黏蛋白，可稳定并重塑内皮连接32,33。这些连接蛋白的密度限制了电子在内皮细胞间细胞旁间隙中的流动。这一特性被用于测量内皮屏障的强度，即跨内皮电阻（TER），适用于脑内皮等融合的细胞单层模型。

由于脑血管内皮在血脑屏障界面具有关键作用，治疗学研究主要集中于脑血管内皮。多种疾病会对脑血管内皮产生负面影响，包括多发性硬化等神经炎症性疾病、脑卒中、神经退行性疾病以及癌症34,35,36,37。一旦脑血管内皮屏障遭到破坏，大脑将直接暴露于血液中的有害刺激物，导致疾病进展显著恶化38。我们先前已证实，利用两种可测量血管内皮屏障强度的技术，发现炎症介质和转移性黑色素瘤细胞可破坏脑血管内皮屏障39,40,41。

电阻式细胞-基底阻抗传感（electric cell-substrate impedance sensing, ECIS）是一种基于阻抗的生物传感器，可实现 实时 内皮细胞屏障完整性的无标记评估。在此方法中，检测孔内壁衬有镀金电极，可向检测系统引入交流电（AC）。将脑源性内皮细胞接种至这些孔中，使得交流电能够穿过细胞。图1A-孔；侧视图）。这建立了用于计算阻抗的电路。图1A-电路图）。当脑微血管内皮细胞贴附于培养板并开始形成细胞间紧密连接时，阻抗增加。当内皮细胞生长至融合状态，形成单层细胞并限制电流通过时，阻抗趋于平稳。在不同频率下施加交流电会影响电流通过内皮细胞的路径。当施加较高频率的交流电时，电流主要流经内皮细胞本体。>104 赫兹）。这提供了关于细胞单层电容的信息，用于评估细胞的贴附和铺展情况。在低频（102-104 Hz）时，膜阻抗较高，限制了电流流动 通过 细胞。在这种情况下，大部分电流通过 之间 细胞。在约4,000 Hz时，电流流动的阻力主要来自内皮细胞间的连接结构，通过 细胞间 因此，该频率下电阻的任何变化均可提供有关内皮屏障完整性的信息。

尽管原始的阻抗测量可提供有关屏障特性的信息，但ECIS软件能够通过数学模型对多个交流频率下测得的总电阻进行分析，并更精确地将其分解为反映屏障完整性的两个关键参数。这两个参数分别是相邻细胞侧膜之间的细胞旁电阻（电阻beta-Rb；细胞旁屏障；图1A-绿色箭头），以及细胞基底侧膜层与电极之间的基底侧电阻（电阻alpha-Alpha；基底侧屏障；图1A-蓝色箭头）。此外，模型还测量第三个参数，即细胞膜电容（Cm；图1A-红色箭头）。Cm反映电流通过细胞的电容性流动，可指示细胞膜的组成特性。在此，Rb或细胞旁屏障的变化表明紧密连接（TJs）和粘附连接（AJs）发生改变，而这些结构在维持内皮屏障完整性中至关重要。为了可靠地解读Rb，需基于Giaever和Keese42提出并由Stolwijk等人43深入讨论的四个关键假设。尽管这些假设对于确保ECIS建模的有效性非常重要，但在融合的内皮单层细胞中通常能够满足这些条件。

与ECIS类似，cellZscope也可用于测量内皮屏障电阻的变化；然而，细胞培养在多孔膜插件上。在此系统中，电路位于膜插件两侧的两个电极之间。内皮单层细胞培养在该膜插件的上方，从而可测量跨内皮电阻（TER）（图1B-孔；侧视图）。与ECIS相同，在此系统中，总阻抗可归因于多个屏障组分，具体取决于所施加电流的频率44。在低频时，电极电容（CEl）主导系统的总阻抗。而在高频时，培养基的电阻（Rmedium）主导总阻抗。因此，最有用的测量值落在中频范围（102-104 Hz），该范围可提供有关内皮屏障两个关键组分的信息（图1B-电路图）。首先，在103-104 Hz时，细胞层电容（CCl）主导总阻抗，因为膜电阻（Rmembrane）足够高，可忽略不计，电流主要流经电容器。因此，CCl反映了通过细胞膜的电阻变化。相反，在102-103 Hz时，跨内皮电阻（TER）主要贡献总阻抗，此时电流通过由连接蛋白连接的相邻细胞之间的连接间隙流动。因此，这提供了有关内皮屏障旁细胞组分的信息，与之前在ECIS上观察到的Rb结果一致。

图1C 阐述了脑内皮特定区域如何受到破坏 处理 黑色素瘤细胞。这种破坏会通过细胞旁隙（以 Rb 或 TER 表示）、基底外侧区（以 Alpha 表示）和细胞膜（以 C 表示）的电流变化被生物传感器检测到m 或 CCl）。我们使用了本引言中详细介绍的两种生物传感器，以测量在细胞因子或侵袭性黑色素瘤细胞等不同刺激处理后脑血管内皮屏障的变化。当某种刺激破坏内皮屏障时，测得的电阻会下降，从而形成电流通过的最低阻力通路。因此，电阻的降低表明 "屏障电阻" 提示屏障完整性丧失或脑血管内皮屏障受损。在这些检测中，我们通过实时解读电阻及建模参数来研究这种屏障破坏。ECIS 和 cellZscope 在回答此类科研问题中的应用详见其他文献。39,41,45,46.

体外研究通过揭示推动疾病进展的分子和功能通路，有助于发现关键的疾病机制。然而，这需要在体外可靠地模拟疾病状态，而这种模拟与真实机体的功能存在显著差异。理想情况下，体外研究应具备可重复性、非侵入性、无需标记、可定量，并能模拟体内存在的结构影响。本文详细阐述了利用这两种竞争性技术来测量治疗诱导的脑血管内皮屏障完整性的变化的方法。我们讨论了整合这两种技术结果的优势，以更全面地揭示屏障功能障碍的情况，同时也指出了目前仍需克服的局限性。

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方案

1. 使用 ECIS 监测不同处理条件下脑血管内皮屏障完整性的变化

  1. 软件、阵列工作站和仪器的设置
    1. 将96孔阵列工作站连接到仪器上。将阵列工作站放入塑料袋中，并至少在实验开始前1小时将其置于培养箱中预热。实验开始前立即取出塑料袋。
    2. 准备就绪后，打开仪器并启动计算机上的相应软件。点击采集数据选项卡下的设置按钮。软件将执行连接检查，识别所连接的适配器类型（例如96孔阵列工作站），并在显示的板图中以红色显示各孔，表示软件已检测到适配器但未感应到已连接的检测板。此时系统已准备好用于96孔检测板。
  2. 准备96孔生物传感器板
    注意：采用96孔板排列方式。每个孔的底部均设有镀金电极的叉指状电极结构。这些板以无菌包装提供，仅可在无菌操作台或生物安全柜中打开。必须首先通过添加10 mM半胱氨酸对金电极进行化学稳定化处理，以维持电极电容。
    1. 在无菌槽中配制10 mM半胱氨酸溶液，使用多通道移液器小心地向每孔加入100 µL。室温孵育15分钟后，小心吸除液体，仅在孔边缘进行移液操作，避免划伤电极。使用相同的移液技术，用无菌去离子水（非PBS）至少清洗2次。
      注意：根据制造商的操作说明，也可使用ECIS仪器中的温热培养基对板电极进行电学稳定化处理，替代半胱氨酸包被。
    2. 准备细胞外基质（ECM）底物，作为孔底部的基底膜。
      注意：可根据脑微血管内皮细胞系的具体需求选择合适的ECM底物，如胶原蛋白或层粘连蛋白。本实验中使用胶原蛋白处理人脑微血管内皮细胞系（hCMVEC）。
    3. 在新鲜无菌槽中，用0.02 M乙酸溶解大鼠尾部I型胶原蛋白，配制成1 µg/cm2的溶液（每孔100 µL）。在无菌操作台中避光孵育1小时，然后用去离子水小心清洗2次，并小心移液。
      注意：最后一次清洗后，应尽可能小心地去除所有去离子水，并让板在操作台中自然干燥。建议包被后尽快使用；若需临时保存，可置于4 °C水中短期存放（不超过一周）。此时板已准备就绪，可供使用。
  3. 准备用于接种至96孔生物传感器板的脑微血管内皮细胞
    注意：建议首先优化所用内皮细胞系的生长阶段和接种密度。本方案中使用的hCMVEC细胞系，在96孔板中以每孔20,000个细胞接种后，约需48小时达到汇合状态。
    1. 在无菌操作台中使用温和解离试剂收获脑微血管内皮细胞，并进行准确的细胞计数。每孔加入100 µL培养基，含20,000个hCMVEC细胞，以确保细胞在48小时内处于稳定生长阶段。准备过量的脑微血管内皮细胞，以确保所有96个孔均能实现最佳移液操作。
      注意：因此，对于一块96孔板，共需约2,000,000个细胞，悬浮于10 mL预热的培养基中。
    2. 将脑微血管内皮细胞转移至新的无菌槽中，使用多通道移液器小心地向每孔加入100 µL细胞悬液（含20,000个细胞）。在操作过程中应定期轻柔重悬槽中的细胞，防止细胞沉降。确保留出1个孔仅加入培养基而不接种细胞，用于后续数学建模（无细胞孔），并确保整个板的接种过程在30秒内完成。
  4. 开始实验
    1. 通过将板适配器两侧的红色卡扣向外拨动，小心地将检测板安装至培养箱内的适配器上。将板的A1孔与适配器的A1区域对齐。一只手轻轻按住板，另一只手将红色卡扣复位并卡紧。
      注意：确保板在适配器中安装稳固。
    2. 关闭培养箱门，再次点击设置按钮。观察板图中是否出现绿色孔，表示连接正常。若仍有红色孔，则表示存在连接错误。此时应迅速重新安装板以排除故障。
      注意：若花费过多时间处理连接不良的孔，可能会影响细胞健康。
    3. 点击检查按钮，重新检测连接状态并获取绝对阻抗读数。此过程需数分钟。
    4. 点击板图下方的箭头按钮，确保已选择正确的板型号。本实验中应选择96w20idf。
    5. 点击多频按钮，确保在多个交流频率下测量阻抗，以便后续进行数学建模。
    6. 点击开始按钮以启动实验。让细胞增殖约48小时，形成典型的高电阻单层结构，该过程可通过欧姆值的升高进行监测。
  5. 在96孔板上对脑微血管内皮细胞施加癌细胞或细胞因子处理
    注意：由于96孔板可同时测试多种刺激条件，建议预先绘制清晰的板图以规划处理方案（补充图S1-底部）。每种处理必须且至少进行三重重复（三个重复孔），以满足统计分析要求；但本方案中以四重重复为例（见补充图S1）。
    1. 在48小时时检查脑微血管内皮细胞的生长情况。确保细胞已进入平台期后再进行处理溶液的配制。
      注意：不同内皮细胞系达到平台期所需时间可能不同，因此在正式实验前必须优化其生长阶段和接种密度。各孔通常应在同一小时内达到平台期。若未同步，则可能存在污染或移液误差，不应纳入分析。
    2. 对于细胞因子处理，使用预热的完全培养基配制适当浓度的细胞因子溶液，并设置相应的溶剂对照和培养基对照。
      1. 将细胞因子配制成最终目标浓度的2倍浓度，因为加入含脑微血管内皮细胞的孔中时会以1:1比例稀释。
      2. 为确保每种处理可进行三重重复，所有细胞因子溶液的总体积应超过300 µL（建议至少350 µL），以便每孔加入100 µL处理液。
    3. 对于细胞处理，使用温和解离试剂收获细胞（本方案中使用三种不同患者来源的黑色素瘤细胞系），并进行准确细胞计数。进行细胞处理时采用最高效应细胞与靶细胞比例（E:T比）为1:1，其中处理细胞为效应细胞（如黑色素瘤细胞），脑微血管内皮细胞为靶细胞，即每孔加入20,000个黑色素瘤细胞至20,000个脑微血管内皮细胞中。
      1. 根据需要，可进行系列稀释以获得更低的E:T比（如1:10或1:100）。为实现三重重复处理，应计数细胞并将细胞悬浮于总体积超过300 µL（建议至少350 µL）的培养基中，以便每孔加入100 µL处理液。
    4. 根据96孔板图（补充图S1-顶部），标记1.1 mL聚丙烯排管（8管条带式，即1 mL条带管）。将排管插入条带管板中，并在实验前进行高压灭菌。将处理用的细胞因子或细胞悬液的总体积（即 完整的350 µL处理液）加入无菌排管中，并置于培养箱中保温。
    5. 在软件中点击暂停按钮以暂停实验。此过程可能需要数秒完成。暂停后，打开培养箱门，一只手稳定板的位置，另一只手小心地同时松开两个红色卡扣。保持实验暂停状态，将板转移至无菌操作台。
    6. 从培养箱中取出处理用排管。使用多通道移液器小心重悬排管中的内容物，然后将100 µL处理液从排管加入96孔板的相应孔中，注意避免触碰孔底。小心地向所有孔加入处理液，并向无细胞孔中仅加入培养基，整个操作应在5分钟内完成（针对整块96孔板），因为过度降温会影响内皮单层的电阻值。
    7. 将处理后的板重新放回仪器，按前述方法安装固定，并再次点击设置 | 检查按钮确认电极与适配器的连接状态。
    8. 确认已选择正确的板型号及多频采集参数，点击继续按钮恢复实验。继续运行实验直至达到预定终点。
    9. 点击完成按钮结束实验，系统将自动保存记录的abp文件。通过点击文件 | 导出数据，可将该文件导出为xls或csv格式，用于后续分析。

2. 使用 cellZscope 监测不同处理条件下脑血管内皮屏障完整性的变化

  1. 准备仪器的金属部件、接头和多孔膜插件
    1. 依次使用去离子水、70%乙醇，再用去离子水清洗金属部件。
    2. 高压灭菌底部电极或 "盆" 顶部浸入式电极及其他所有细胞模块组件用70%乙醇灭菌。
    3. 在无菌操作台中，安装全部24个底部电极。"盆" 通过将它们旋入细胞模块中，并在整个过程中注意保持无菌。
    4. 向孔中加入 900 µL 基础培养基。
      注意：基础培养基应加入下室，作为内皮细胞的基底区室。建议在此区室中不使用血清，以更可靠地模拟脑内皮细胞的基底环境。
    5. 将浸入式电极通过磁力连接至细胞模块盖上，并合上盖子，使浸入式电极插入底部电极槽中。
    6. 将细胞模块连接至培养箱中的适配器，并静置至少1小时以达到平衡。在此阶段，打开软件以加载实验板图 布局 标签，从而将处理板图嵌入文件中，这些文件最终将包含数据。
    7. 如需包被，应在无菌操作台内使用无菌的24孔培养板固定膜插件，并按照1.2.3节所述，将细胞外基质底物（如胶原蛋白）加入孔的内侧区域。使用单通道移液器小心地将细胞外基质底物逐孔加入。
  2. 准备脑微血管内皮细胞以接种至膜插件上并启动实验
    1. 按照第1.3节收获并计数脑微血管内皮细胞，但进行如下准备 在50 mL离心管中进行最终所需的细胞滴定。确保收获的细胞置于含有所有必需生长因子和血清的温热完全培养基中。
    2. 使用单通道移液器，将脑微血管内皮细胞（本方案中为80,000个）小心接种至插件小室的顶侧腔室中，加入350 µL完全培养基。
    3. 在其中一个插件中仅加入完全培养基，作为空白对照孔。
    4. 从培养箱中取出细胞模块，放入无菌操作台。使用镊子夹住插入物的上部支撑结构，将制备好的插入物转移至底部电极槽中。注意避免膜下产生气泡。
    5. 将细胞模块放回培养箱中，置于适配器上方。
    6. 在软件中，在 实验 标签，位于下方 光谱 切片，选择 从 1 Hz 开始 和 停止于 100 kHz 在整个频率范围内采集数据；选择 精细 步骤。
    7. 下 等待时间，选择 15 分钟 以允许软件以最快速度进行连续测量。
    8. 按压 开始 开始实验，使脑微血管内皮细胞增殖并形成高电阻的单层细胞。此步骤约需48小时。
  3. 在膜插件中用癌细胞和细胞因子处理脑内皮细胞
    1. 在48小时时，按照第1.5节准备处理用细胞因子或细胞（例如黑色素瘤细胞），如适用，进行细胞计数，并收集于1 mL排管或等效容器中。
    2. 将处理液配制为正确浓度，以便向每个孔（插入式培养小室）中加入70 µL。将处理液置于培养箱中保温。
    3. 由于本仪器每15分钟进行一次测量，应选择在一次测量完成后立即开始处理。此时，将细胞模块从培养箱中取出，使用无绒布蘸取70%乙醇轻轻擦拭。
    4. 在无菌操作台中，打开细胞模块，使用单通道移液器将70 µL处理液小心加入相应插入式培养插件的顶室中，以环形方式加样，避免产生气泡。此步骤需在10分钟内完成，以便在下一次测量开始前将细胞模块重新放回适配器中。
    5. 按压 停止 结束实验。将数据直接导出至 xls. 文件。 文件 | 导出 标签。打开文件后，应正确命名并保存。

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结果

解读ECIS阻抗数据

理解最佳实验条件
此处数据可直接通过软件查看（图2A），或导出用于分析和绘图（图2B）。图2A展示了在实际软件界面上显示数据的示例。左侧图像显示由于将96孔生物传感器板错误装载至适配器（称为阵列站）而导致连接异常的示例。通常，电极刮伤或板与阵列站位置未对齐会导致信号异常。右侧图像显示正确装载的板所记录的数据，其中各孔均实现正常连接。在图2A右侧图中，从0小时到30小时电阻的上升反映了内皮细胞的生长阶段，细胞逐渐形成单层结构，并在48小时时形成稳定的屏障，电阻达到平台期。绿色垂直线表示添加不同生物处理的时间点，这些处理均会影响屏障功能，并以不同方式改变电阻值。

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讨论

影响血脑屏障的疾病的治疗研究必须考虑脑血管内皮屏障完整性和调控的重要性。例如，其他解剖部位的癌症向脑部转移时，脑血管内皮屏障的破坏是研究的关键问题。这是因为脑血管内皮构成了抵御循环肿瘤细胞的第一道屏障。如前言中所述， 体外 关于内皮屏障完整性的研究需要具备可重复性、非侵入性、无需标记、定量且能模拟生理环境的特点 体内 尽可能接近。本文讨论了两种用于评估脑血管内皮屏障完整性的关键生物传感器的使用方法。我们重点介绍了实验方案中的主要步骤及改进之处，以帮助获得最佳且可重复的实验结果。

提高使用 ECIS 生成数据的可重复性

实验方案中的关键步骤
本方案的第一个关键步骤是确保正确的板处理。 图2A 显示了电极连接不当的证据，导致96孔板中部分孔的数据丢失。为避免此问题，我们采用小心移液的方式，避免直接接触底部电极。在板的处理过程中，建议一只手压住板的顶部以固定板，同时将板“夹紧”到阵列工作站上。...

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披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

Akshata Anchan 获得了新西兰神经病学基金会 Gillespie 奖学金（资助编号：1628-GS）和首届研究员项目（资助编号：2021 FFE）的资助。本研究的部分经费还来自新西兰神经病学基金会研究员项目-2021 FFE 以及奥克兰大学学院研究发展基金。James Hucklesby 获得了奥克兰医学研究基金会奖学金的资助。感谢 Baguley 团队和奥克兰癌症协会研究中心提供源自患者的新西兰黑色素瘤 NZM 细胞系。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
aMEMGibco12561072黑色素瘤细胞基础培养基
cellZscope 阵列nanoAnalyticscellZscope2; 软件 v4.3.1跨上皮/内皮电阻（TER）测量用生物传感器阵列
胶原蛋白 I—大鼠尾来源GibcoA1048301用于包被的细胞外基质（ECM）基质
二丁酰-cAMPSigma-AldrichD0627脑微血管内皮细胞培养基添加剂
ECIS 阵列 Applied BiophysicsECIS ZΘ; 软件 v1.2.163.0Rb/Alpha 测量用生物传感器阵列
ECIS 板 Applied Biophysics96W20idf 96 孔生物传感器板
FBSSigma-Aldrich12203C-500ML
GlutaMAXGibco305050-061脑微血管内皮细胞培养基添加剂
hCMVECApplied Biological MaterialsT0259脑微血管内皮细胞系
hEGFPeproTechPTAF10015100脑微血管内皮细胞培养基添加剂
肝素Sigma-AldrichH-3393脑微血管内皮细胞培养基添加剂
hFGFPeproTechPTAF10018B50脑微血管内皮细胞培养基添加剂
氢化可的松Sigma-AldrichH0888脑微血管内皮细胞培养基添加剂
IL-1βPeproTech200-01B细胞因子
胰岛素-转铁蛋白-硒酸钠Sigma-Aldrich11074547001黑色素瘤细胞培养基添加剂
M199Gibco11150-067脑微血管内皮细胞基础培养基
MilliQ 水去离子水
PBS 1xGibco10010-023
TNFαPeproTech300-01A细胞因子
Transwell 小室CorningCLS3464多孔膜插入式小室
TrypLE Express 酶Gibco12604021细胞解离试剂

参考文献

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