本方案提供了一种结合（的逐步操作流程，用于对数十个死后人类脑切片进行快速且同步的光学透明化、多轮标记及三维体积重建SWITCH - H2O2 - 抗原 R2,2'-硫代二乙醇的提取TDE]) 短时组织转化技术结合光片荧光显微成像的常规高通量实验方案
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方法文章
大规模人脑成像中用于光片荧光显微镜的光学透明化与标记技术
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
尽管过去十年中出现了多种组织透明化技术，但由于人脑的体积和结构复杂性，对死后人脑进行处理仍是一项具有挑战性的任务，这使得微米级分辨率的成像尤为困难。本文介绍了一种通过同时处理数十个脑片来重建人脑体积区域的方案，该方案采用SHORT（SWITCH - H2O2 - 抗原 R2,2'-硫代二乙醇的提取TDE]) 组织转化方案，可实现样本的透明化、标记及使用光片荧光显微镜（LSFM）进行连续成像。SHORT 方法可快速透明化厚切片并实现多种神经元标记物的均一多标，从而在白质和灰质中均可识别不同的神经元亚群。透明化后，切片可通过 LSFM 以微米级分辨率进行多通道同步成像，实现快速三维重建。将 SHORT 与 LSFM 分析结合于常规高通量流程中，可在短时间内实现大体积区域的高分辨率三维细胞构筑重建，从而实现对人脑结构的全面表征。
引言
分析人脑大体积样本的三维分子结构和细胞架构需要实现组织的光学透明，这通常通过耗时较长的处理流程来完成。光学透明化技术旨在最大限度地减少组织内部折射率（RI）的不均匀性，从而降低光散射，提高光穿透深度，以实现高分辨率成像1,2,3,4,5。近年来在透明化和深层组织标记方法上的进展，结合前沿显微成像技术，已可对完整的啮齿类动物器官和胚胎进行三维成像6,7,8,9,10,11,12。
然而，与模式生物相比，对死后人脑大范围区域进行容积式三维重建仍是一项具有挑战性的任务。复杂的生物组成以及多变的死后固定....
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方案
福尔马林固定的人体组织样本由美国马萨诸塞州波士顿市麻省总医院（MGH）尸检服务部神经病理学系提供。在死亡前，已从健康参与者处获得书面知情同意，该组织采集方案经合作伙伴机构生物安全委员会（PIBC，方案编号2003P001937）批准的机构审查委员会（IRB）审核通过。授权文件保存于美国马萨诸塞州波士顿市麻省总医院尸检服务部，可根据要求提供。
1. 琼脂糖包埋与样品切片
- 在烧杯中用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）配制 4% w/v 琼脂糖溶液，并将组织块包埋其中。待其冷却至室温（RT）后，于 4 °C 保存 24 小时。
- 为获得高精度切片，将样品粘附至振动切片机的样品盘上，并在切片槽中加入冷的 1× PBS（pH 7.4）。根据待切组织类型调整振动切片机的参数，如频率、振幅和速度（本实验所用参数：频率 = 5（50 Hz）；振幅 = 0.4；速度 = 3（0.15 mm/s））。
注意：应根据样品体积选择不同的振动切片机。对于最大体积为 70 × 40 × 15 mm 的样品，可使用振动切片机（例如 Leica VT1000 S）；对于更大体积的样品，可使用压缩切片机（例如 VF-900-0Z Microtome18）或定制装置21。本文所展示的切片厚度为 400 µm 或 500....
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结果
本方案采用SHORT方法，可同时处理厚度在100 µm至500 µm范围内的多个脑片，显著缩短了整个实验流程的处理时间。本文全面描述了同时处理多张死后人脑厚切片的完整流程（图1），并展示了同时处理24张切片的实验操作（图2A）。根据样本的大小和厚度，透明化与共标记所需时间在11至30天之间（表1），此时间不包括成像及成像后处理。在TDE中完成脱脂和折射率匹配后，所有组织切片的灰质和白质均达到理想且均匀的透明效果（图2B）。
图像采集可使用多种先进的荧光显微镜完成，包括共聚焦显微镜25和双光子显微镜14。本研究中采用了一台定制的倒置光片荧光显微镜（LSFM）18,23
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讨论
对大面积人脑组织进行高分辨率成像和三维重建，需要先进行机械切片，随后对单个切片进行光学透明化处理和免疫标记。本文所述方案介绍了如何利用SHORT组织转化方法，快速、同步地处理多个人脑厚切片，以实现亚细胞分辨率的全脑三维重建，适用于光片显微镜（LSFM）成像。
与其他方法不同，SHORT 方法的透明化和多重标记步骤无需复杂的定制设备。大量样本可同时处理，从而缩短大尺寸人脑组织块的处理时间，并最大限度地减少技术变异性。
在处理陈旧的甲醛固定人体组织时，脱色和表位暴露处理至关重要。过氧化氢和碱性抗原修复溶液还可与其他透明化方法联合使用，例如 iDISCO6,28、CLARITY、SWITCH 和 SHIELD24。
为了确保表位信息的完整保留并实现灰质和白质的均匀透明化，有必要将样本转化为一种耐热且耐化学试剂的凝胶.......
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披露
作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
致谢
感谢马萨诸塞州总医院A.A. Martinos生物医学成像中心放射科的Bruce Fischl提供了本研究中分析的人脑标本。本项目获得了欧盟“地平线2020”研究与创新框架计划资助协议编号654148（Laserlab-Europe）、欧盟“地平线2020”研究与创新框架计划特定资助协议编号785907（人脑计划SGA2）和编号945539（人脑计划SGA3）、美国国立卫生研究院下属综合医院中心资助号U01 MH117023，以及意大利教育部门在Euro-Bioimaging意大利节点（ESFRI研究基础设施）框架内的资助。最后，本研究还得到了"Fondazione CR Firenze."的支持。本研究内容的全部责任由作者承担，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。图1使用BioRender.com制作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2,2'-硫代二乙醇 | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
| 乙酰胺 >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| 高电渗流琼脂糖 | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
| 硼酸 | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z 切片机 | Precisionary | / | |
| 盖玻片 | LaserOptex | / | 定制 |
| 乙二胺四乙酸二钠盐二水合物 | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| 戊二醛 | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
| 甘氨酸 | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
| 30% 过氧化氢 | Merck Life Science S.R.L. | ||
| 培养箱 ISS-4075 | Lab companion | / | |
| 光片荧光显微镜 (LSFM) | / | / | 自制 |
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| 显微镜载玻片 | Laborchimica | / | 定制 |
| 磷酸盐缓冲液片剂 | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | 已停产 |
| 邻苯二甲酸氢钾 | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| 叠氮化钠 | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
| 十二烷基硫酸钠 | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
| 亚硫酸钠 | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
| 间隔片 | Microlaser srl | 定制 | |
| 痰液收集容器（带螺旋盖的培养皿） | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| Tris 碱 | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
| Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
| 离心管 | Sarstedt | 62 547254 | |
| Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| 振动切片机 VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| 水浴锅 | Memmert | WNB 7-45 | |
| 抗体与染料 | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure 羊驼抗兔 IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 611-545-215 | 使用稀释度 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure 牛抗山羊 IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 805-545-180 | 使用稀释度 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure 羊驼抗兔 IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 611-605-215 | 使用稀释度 1:200 |
| 抗 NeuN 抗体 | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | 使用稀释度 1:100 |
| 抗钙结合蛋白抗体 (PV) | Abcam | ab32895 | 使用稀释度 1:200 |
| 抗波形蛋白抗体 [V9] - 细胞骨架标记物 (VIM) | Abcam | ab8069 | 使用稀释度 1:200 |
| 钙视网膜蛋白多克隆抗体 | ProteinTech | 12278_1_AP | 使用稀释度 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | 使用稀释度 1:100 |
| 驴抗小鼠 IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | 使用稀释度 1:200 |
| 驴抗小鼠 IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | 使用稀释度 1:200 |
| 驴抗兔 IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | 使用稀释度 1:200 |
| 驴抗大鼠 IgG H&L (Alexa Fluor 568) 预吸附 | Abcam | ab175475 | 使用稀释度 1:200 |
| 山羊抗鸡 IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | 使用稀释度 1:500 |
| 山羊抗鸡 IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | 使用稀释度 1:500 |
| 山羊抗鸡 IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | 使用稀释度 1:500 |
| 山羊抗兔 IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | 使用稀释度 1:200 |
| 重组 Alexa Fluor 488 抗 GFAP 抗体 | Abcam | ab194324 | 使用稀释度 1:200 |
| 生长抑素抗体 YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | 使用稀释度 1:200 |
| 血管活性肠肽 (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | 使用稀释度 1:200 |
参考文献
- Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251(2019).
- Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews Methods Primers.
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