方法文章

光片荧光显微镜在大规模人脑成像中的光学透明化和标记

DOI：

10.3791/65960

⸱

2024年1月26日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1European Laboratory for Non-linear Spectroscopy (LENS), University of Florence, 2Division of Physiology, Department of Experimental and Clinical Medicine, University of Florence, 3Department of Physics, University of Pisa, 4National Research Council - National Institute of Optics (CNR-INO), 5Department of Physics and Astronomy, University of Florence, 6Department of Biology, University of Florence

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案通过将 （SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-硫代二乙醇 [TDE]） SHORT 组织转化技术与常规高通量方案中的光片荧光显微镜成像相结合，为数十个死后人脑切片的快速和同时光学清除、多轮标记和 3D 体积重建提供了分步程序。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

尽管在过去十年中出现了许多清除技术，但由于其尺寸和复杂性，处理死后人类大脑仍然是一项具有挑战性的任务，这使得微米分辨率的成像特别困难。本文提出了一种方案，通过使用 SHORT （SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-硫代二乙醇 [TDE]） 组织转化方案同时处理数十个切片来执行人脑体积部分的重建，该协议能够使用光片荧光显微镜 （LSFM） 对样品进行透明、标记和顺序成像。SHORT提供快速的组织清除和具有多个神经元标记的厚切片的均质多标记，能够识别白质和灰质中的不同神经元亚群。清除后，通过LSFM以微米分辨率同时在多个通道中对切片进行成像，以进行快速的3D重建。通过在常规高通量方案中将SHORT与LSFM分析相结合，可以在短时间内以高分辨率获得大体积区域的3D细胞结构重建，从而实现人脑的全面结构表征。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

分析大量人脑的 3D 分子组织和细胞结构需要标本的光学透明度，这是通过具有大量处理时间的方案实现的。开发了光学清除技术以最大限度地减少组织内折射率 （RI） 的异质性，从而减少光散射并增加高分辨率成像的光穿透深度 1,2,3,4,5。目前清除和深层组织标记方法的进展允许通过利用尖端显微镜技术对完整的啮齿动物器官和胚胎进行体积成像 6,7,8,9,10,11,12。

然而，与模式生物相比，死后人脑大面积的体积3D重建仍然是一项具有挑战性的任务。复杂的生物组成和多变的死后固定和储存条件会影响组织清除效率、抗体渗透深度和表位识别13、14、15、16、17、18、19。此外，与模式生物相比，仍然需要机械组织切片和随后的每个切片的清除和标记，以实现大面积人脑区域的高效清除和均匀标记，导致处理时间长，并且需要复杂的定制设备15,20,21,22。

SWITCH - H2O2 - antigen Retrieval -TDE （SHORT） 组织转化技术是专门为分析大量人脑而开发的18,23。该方法采用SWITCH方案11的组织结构保存和高浓度的过氧化氢来减少组织自发荧光，并结合表位恢复。SHORT 允许使用不同神经元亚型、神经胶质细胞、脉管系统和有髓纤维的标记物对人脑切片进行均匀染色18,24。其结果与低密度和高密度蛋白质的分析兼容。由此产生的高透明度水平和均匀的标记使得用荧光显微镜对厚切片进行体积重建，特别是对于快速采集光片的设备，可以使用18,24,25,26,27。

在这项工作中，我们描述了如何使用 SHORT 组织转化技术同时清除和多轮标记数十个福尔马林固定的人脑切片。四种不同的荧光标记可以一起使用，从而鉴定不同的细胞亚群。清除后，可以使用荧光显微镜进行高分辨率体积成像。在这里，我们使用了定制的倒置 LSFM18、24、25、26、27，它可以对样品进行快速光学切片并并行快速采集多个通道。通过这种常规的高通量方案，可以获得全面的细胞和结构表征，并具有人脑大面积的亚细胞分辨率，正如在整个布罗卡区域23 的映射中已经证明的那样。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

福尔马林固定的人体组织样本由马萨诸塞州总医院 （MGH） 尸检服务（美国波士顿）的神经病理学部门提供。根据合作伙伴机构生物安全委员会（PIBC，协议 2003P001937）批准的组织收集方案，在死亡前获得健康参与者的书面同意。授权文件保存在美国马萨诸塞州波士顿的 MGH 尸检服务处，并可根据要求提供。

1. 琼脂糖包埋和样品切割

  1. 在烧杯中制备 4% w/v 琼脂糖溶液，在 1x 磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）中，并将组织块嵌入其中。等到达到室温（RT），然后在4°C下储存24小时。
  2. 为了获得高精度切片，将样品粘在振动切片机的样品盘上，并用冷的 1x PBS （pH 7.4） 填充托盘。根据要切片的组织类型调整振动切片机参数，例如频率、振幅和速度（使用的值:频率 = 5 （50 Hz）、振幅 = 0.4、速度 = 3 （0.15 mm/s）。
    注意:应根据样品量使用不同的振动器。对于最大体积为 70 x 40 x 15 mm 的样品，可以使用振动切片机（例如徕卡 VT1000 S）;对于较大的样品，可以使用压缩机（例如，VF-900-0Z 切片机18）或定制设备21。在这里，我们展示了厚度为 400 μm 或 500 μm 的切片。
  3. 切割后，将所有切片放入由1x PBS（pH 7.4）和0.01%w / v叠氮化钠（NaN3）组成的保存溶液中，并储存在4°C。
    注意:包埋前，等到琼脂糖溶液达到37°C。 较高的温度可能会损坏试样。建议不要将样品留在 PFA 中超过 48 小时，因为长时间固定可能会破坏抗原和增加组织自发荧光，从而干扰标记过程。对于人体组织的长期储存，含有 NaN3 的 PBS 用于防止微生物污染。由于 NaN3 的毒性，在化学罩下制备防腐剂溶液。

2.组织固定

注意:以下方案中使用的所有溶液均以大体积制备，足以处理同一组织块的所有切片，并最大限度地减少技术差异并减少单个步骤的时间。

  1. 用 50% v/v 1x PBS pH 3、25% v/v 0.1 M 盐酸 （HCl）、25% v/v 0.1 M 邻苯二甲酸氢钾 （KHP） 和新鲜的 4% v/v 戊二醛制备关闭溶液。将所有样品放入带螺旋盖（70 x 23 mm）的培养皿中，并用关闭溶液在4°C轻轻摇动孵育1天，用铝箔保护它们免受光照。
  2. 用 1x PBS（pH 7.4）和新鲜的 1% v/v 戊二醛制备 Switch-on 溶液。将所有样品放入新培养皿中，并用Switch-on溶液孵育，在4°C下轻轻摇动1天，用铝箔保护它们免受光线照射。
    注意: 由于戊二醛的高毒性和光敏性，关闭和打开溶液都必须始终新鲜制备并保存在冰上的化学罩下。始终用每种溶液 20 mL 填充培养皿，并用封口膜密封。

3. 灭活和清除

注意:样品中的反应性戊二醛必须通过与由 1x PBS pH 7.4、4% w/v 乙酰胺、4% w/v 甘氨酸、pH 9.0 组成的灭活溶液孵育来灭活。该溶液可在4°C下储存长达3个月。为了去除脂质并使组织透明，我们使用由 200 mM 十二烷基硫酸钠 （SDS）、20 mM 亚硫酸钠 （Na2SO3） 和 20 mM 硼酸 （H3BO3） 组成的透明溶液，pH 值为 9.0。溶液必须储存在室温下，因为SDS在4°C下沉淀。 以下所有步骤都将在充满溶液的试管中完成。

  1. 将样品从培养皿移至试管中，并在室温下用1x PBS pH 7.4轻轻摇动洗涤3×2小时。
    注意:对于步骤 3.1，由于戊二醛毒性，有必要在化学罩下工作。乙酰胺、SDS和硼酸也是有毒试剂，必须在化学罩下处理。始终用每种溶液 50 mL 填充试管。
  2. 将样品在37°C的灭活溶液中在水浴中孵育过夜（o / n）。
  3. 在室温下在1x PBS pH 7.4中轻轻摇动3 x 2小时。
  4. 将样品在55°C的透明溶液中在水浴中孵育3-7天。每 2 天更换一次溶液（表 1）。

4. 免疫标记

注意:在标记步骤之前，有必要去除残留的 SDS，减少自发荧光，并用由 10 mM Tris 碱基、1 mM EDTA 和 0.05% v/v 吐温 20、pH 9 组成的抗原修复溶液揭开表位。该溶液的 pH 值为 9，经过优化，可实现高效的检索过程;Tris碱作为缓冲剂，以维持稳定的pH环境;EDTA是一种螯合剂，可增强抗原的可及性。非离子洗涤剂 Tween 20 有助于改善组织的通透性。该溶液可以储存在4°C。 需要注意的是，过氧化氢与抗原修复步骤相结合，通过分解和/或修饰负责非特异性背景信号的内源性荧光团（如脂褐素），在降低自发荧光信号方面具有协同作用。

  1. 用0.1%v / v Triton X-100（PBST）制备1x PBS，将其预热至37°C，并在培养箱中在37°C下轻轻摇动中洗涤样品3×3小时。保持最后一次洗涤 o/n。
    注意:将PBST储备溶液储存在4°C。 从组织中去除SDS至关重要，因为它会在低温下形成不溶性沉淀物，这可能会干扰后续的采集过程。
  2. 第二天，向每个样品中加入 10 mL 30% v/v 过氧化氢 （H2O2），并在室温下轻轻摇动 45 分钟。
  3. 用 1x PBS（pH 7.4）洗涤 3 x 10 分钟，并在室温下轻轻摇动。
  4. 在水浴中将抗原修复溶液预热至95°C;将样品转移到加热的溶液中，并在95°C下放置10分钟。
  5. 让试样在轻轻摇晃中冷却至室温40分钟。
  6. 用去离子水轻轻摇晃洗涤 3 x 5 分钟。
  7. 在4°C下在PBS中平衡样品15分钟。
  8. 用0.01%w / v NaN3 制备由PBST制成的新鲜抗体溶液（参见步骤1.3的注释）并加入一抗。将样品与溶液一起在带螺旋盖的培养皿中在37°C下孵育n天（1-7），在培养箱中轻轻摇晃并避光（表2）。
    注:孵育时间取决于大小和厚度（表 1 和表 2）。
  9. n天后，将样品移入试管中，并在培养箱中用37°C预热的PBST洗涤3×2小时，轻轻摇动。
  10. 在PBST中加入0.01%w / v NaN3 的二抗，并将样品在37°C的螺旋盖新培养皿中孵育n天（1-6），在培养箱中轻轻摇晃并避光（表1和表2）。
  11. n天后，将样品转移到试管中，并在37°C下用预热的PBST在温和的摇动培养箱中洗涤3 x 3小时。保持最后一次洗涤 o/n。
    注意: 由于 Triton X-100 和 Tween 20 是粘性的，请缓慢移液以使吸头充满。始终用每种溶液 50 mL 填充试管。每个样品使用 10 mL 抗体溶液，并用封口膜密封培养皿以防止溶液蒸发。由于抗体溶液含有NaN3， 因此它们可以储存在4°C下，并在2周内重复用于标记新标本。

5.折射率匹配

注意:为了达到高水平的透明度，有必要使组织折射率均匀化。在这里，我们使用在 1x PBS 中稀释的 2,2'-硫代二乙醇 （TDE）。TDE 溶液必须储存在室温下。

  1. 将样品转移到新培养皿中，加入30%v / v TDE，并在室温下轻轻摇动4小时。
  2. 取出 30% v/v TDE 溶液，向样品中加入 68% v/v TDE，并在室温下轻轻摇动。
    注意: 由于 TDE 是粘性的，请缓慢移液以使吸头充满。吸入TDE蒸气或雾气会刺激呼吸系统。因此，建议在通风良好的地方工作或使用通风橱以尽量减少暴露。TDE 溶液必须在室温下储存，每个样品使用 10 mL TDE 溶液。

6. 样品安装

注:为了便于样品安装和 LSFM 图像采集，我们使用定制的密封样品架（称为"三明治"），它由三部分组成:显微镜载玻片、垫片和盖玻片。

  1. 将钢垫片（56×56×0.5mm3）放在显微镜载玻片（60×60×1mm3）上，并将样品放在显微镜载玻片上。
  2. 小心地放入石英盖玻片（60 x 60 x 0.5 mm3），将所有东西夹在一起，并以 1:1 的比例准备双组分硅胶。使用石英盖玻片来匹配折射率并减少采集过程中的光学像差。
  3. 使用1mL注射器，用双组分硅胶填充垫片和盖玻片之间的空间，并使其干燥10分钟。
  4. 取下夹子，用一根小针慢慢用 68% v/v TDE 填充整个三明治。
  5. 制作新鲜的胶水并密封三明治。
    注意: 如果 TDE 在步骤 6.1 中意外到达垫片，则胶水将无法固化。确保在步骤 6.2 期间没有形成气泡。

7. 剥离

注:SHORT的结构保留和增强的表位可及性允许通过去除抗体并用其他标记物重新染色样品来对切片进行多轮标记。

  1. 用刀片打开三明治，将标本放入装有30%v / v TDE的螺旋盖的新培养皿中，并放置3小时。
  2. 将样品转移到试管中，在室温下在1x PBS（pH 7.4）中轻轻摇动洗涤3 x 2小时，并保留最后一次洗涤o/n。
  3. 将样品置于80°C水浴中的透明溶液中4小时。
  4. 在37°C下在1x PBST（pH 7.4）中轻轻摇晃洗涤3×2小时，并保留最后一次洗涤o/n。现在，从步骤4.8开始，样品已准备好再次标记。
    注意:始终用每种溶液 50 mL 填充试管。每个样品使用 10 mL TDE 溶液。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这里描述的方案允许使用SHORT方法同时处理多个切片，厚度范围从100μm到500μm。这种方法大大缩短了整个过程的整体处理时间。在这项工作中，我们提供了整个管道（图1）的全面描述，用于同时处理多个死后人脑厚切片，并一次演示了24个切片的协议（图2A）。考虑到样品的大小和厚度（表1），清除和共标记的持续时间从11天到30天不等，不包括成像和成像后处理。在TDE中进行脱脂和折射率匹配后，在灰质和白质中实现了所有组织切片的最佳和均匀透明度（图2B）。

可以使用不同的高级荧光显微镜进行图像采集，包括共聚焦显微镜25 和双光子显微镜14。在这里，我们使用了定制的倒置 LSFM18,23，配备了四条激发激光线:405 nm、488 nm、561 nm 和 638 nm，能够获得四种不同的生物学特征用荧光团偶联抗体标记。图 3A 显示了来自人类 Broca 区域的 400 μm 厚切片的代表性图像，该切片共标记了 NeuN、泛神经元标记物、生长抑素 （SST） 和钙视网膜蛋白 （CR），它们标记了两个不同的中间神经元亚群和核标记物 DAPI（图 3A，B）。在400μm厚的平板中，我们观察到沿Z的全局荧光不仅限于表面，而是在整个组织深度几乎均匀，尽管信号强度在中间略有下降（图3C）。

为了实现对人脑组织的更全面的细胞表征，可以通过剥离抗体并重新标记样品来对相同的标本进行多轮标记，如SHORT原始论文所示。 图 4 （改编自 Pesce 等人 18）展示了在连续三轮免疫染色中用 SHORT 处理的 500 μm 厚组织切片上七种不同抗体的潜在应用。使用的抗体包括 NeuN、SST、CR、PARVALBUMIN （PV） 和血管活性肠肽 （VIP） 作为抑制性神经元标志物，神经胶质纤维酸性蛋白 （GFAP） 用于神经胶质细胞，波形蛋白 （VIM） 用于脉管系统 （表 2）。结果表明，SHORT在各种剥离过程中保存组织信息、有效减少自发荧光信号并实现高效的标本清除方面具有非凡的能力。

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图 1:SHORT 的时间线。 表示使用 SHORT 协议处理样品所需步骤的方案。在每一步中，数十个人脑组织板一起处理。包埋琼脂糖并切片后，将样品分别置于开启和关闭溶液中1天;灭活步骤在一夜之间进行，而通过在透明溶液中孵育的脱脂需要 3-7 天。之后，将样品与一抗和二抗溶液分别孵育最多 7 天和 6 天。折射率匹配后，将样品安装在样品架（夹层）中，用于LSFM成像和储存。在三明治组装后的任何时间，样品都可以被剥离并重新标记，以检测不同的标记物。简称:TDE=2,2'-硫代二乙醇;SHORT = SWITCH - H2O2 - 抗原 Retrieval -TDE;o/n = 隔夜;RI = 折射率;LSFM = 光片荧光显微镜。 请点击这里查看此图的较大版本.

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图 2:同时处理来自 Broca 区域块的人脑切片。 （A） 在用 SHORT 方法处理之前，从 PBS 中 4 x 4 x 0.04 cm3 的 Broca 区域连续切片 24 个。（B） SHORT处理后 A 所示的相同试样。比例尺 = 1 厘米。简称:TDE=2,2'-硫代二乙醇;SHORT = SWITCH - H2O2 - 抗原 Retrieval -TDE;PBS = 磷酸盐缓冲盐水。 请点击这里查看此图的较大版本.

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图3.用四种不同标记标记的澄清切片的代表性 LSFM 图像。 （A） 最大强度投影图像（分辨率为 3.3 x 3.3 x 3.3 μm3），显示了标记 NeuN、生长抑素、钙视网膜和核标志物 DAPI 的 Broca 区域的 SHORT 处理切片的介观重建。右侧显示了合并后的图像 （NeuN-SST-CR-DAPI）。比例尺 = 0.5 厘米。 （B） 在 A 中放大插入合并图像。比例尺 = 100 μm。 （C） 来自 （B） 的高分辨率 （0.55 x 0.55 x 3.3 μm） yz 图像。比例尺 = 100 μm。简称:TDE=2,2'-硫代二乙醇;SHORT = SWITCH - H2O2 - 抗原 Retrieval -TDE;LSFM = 光片荧光显微镜;NeuN = 神经元核抗原;SST = 生长抑素;CR = 钙视网膜蛋白;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。 请点击这里查看此图的较大版本.

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图 4:SHORT 处理切片中多轮染色的代表性 LSFM 图像。 （A） 人脑切片预清除（PBS）和折射率匹配（68% TDE）多轮标记后的图像。比例尺 = 1 厘米。 （B） 合并在随后的三轮多轮中获得的各种通道。该图像显示了用血管活性肠肽、生长抑素、小白蛋白、钙视网膜蛋白、神经元核抗原、神经胶质原纤维酸性蛋白和波形蛋白标记的白质和灰质。高分辨率（分辨率为 0.55 x 0.55 x 3.3 μm），单通道图像显示在图像的右侧和下方。比例尺 = 100 μm，除 GFAP 外的所有图像（比例尺 10 = μm）。（C） 500 μm 厚切片的最大强度投影图像，显示了来自三轮连续免疫染色中使用的七种不同抗体的信号。第 1 轮:PV-SST-VIP;第二轮:CR-SST-NeuN;第 3 轮:VIM-SST-GFAP。比例尺 = 1 毫米。该图是从Pesce等人18修改的。简称:TDE=2,2'-硫代二乙醇;SHORT = SWITCH - H2O2 - 抗原 Retrieval -TDE;LSFM = 光片荧光显微镜;NeuN = 神经元核抗原;SST = 生长抑素;CR = 钙视网膜蛋白;PV = 小白蛋白;GFAP = 神经胶质纤维酸性蛋白;VIM = 波形蛋白;VIP = 血管活性肠肽。 请点击这里查看此图的较大版本.

表 1:具有不同面积和厚度范围的样品的 SHORT 代表性时间长度。 具有不同面积和厚度的标本在透明化和抗体溶液中需要不同的孵育时间，导致整个 SHORT 管道的时间长度不同。 请按此下载此表格。

表 2:与 SHORT 相容的抗体。 该表列出了所有用SHORT方案测试的抗体，并在400-500μm厚的人脑标本中显示出特异性染色。P/M 列表示多克隆抗体和单克隆抗体。 请按此下载此表格。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

大面积人脑的高分辨率成像和 3D 重建需要机械组织切片，然后对单个切片进行光学透明化和免疫标记。这里介绍的协议描述了如何使用 SHORT 组织转化方法快速同时处理多个人脑厚切片，以便使用 LSFM 进行亚细胞分辨率的 3D 脑重建。

与其他方法不同，使用SHORT方法，清算和多重标签步骤不需要复杂的定制设备。可以完全处理大量标本，从而减少大型人脑组织块的处理时间，并最大限度地减少技术差异。

在处理老化的福尔马林固定人体组织时，脱色和表位揭开处理至关重要。过氧化氢和碱性抗原修复溶液也可与其他清除方法结合使用，例如 iDISCO6、28、CLARITY、SWITCH 和 SHIELD24。

为了保证表位信息的保存并实现灰质和白质的均匀清除，有必要将样品转化为耐热和耐化学试剂的凝胶/组织混合物。选择戊二醛是因为它具有出色的交联能力，并且能够在低pH值（pH = 3）下穿透组织板。戊二醛的浓度是决定组织强度和透明度的关键因素。浓度越高，组织结构越好，但清除所需的时间也越长。这种选择可以在表位保存和均质清除方面实现预期的结果。在关闭溶液（方案步骤2.1）的情况下，戊二醛的浓度经过精心选择和优化，以在有效交联和快速清除之间取得平衡18,25。SHORT 专门用于处理来自 Broca 区域、海马体和皮质皮层 18,23,25 的福尔马林固定人脑切片。然而，当使用其他生物模型或不同的大脑区域时，由于灰质和白质组成的变化，可能需要进行一些修改。

该协议的一项关键任务也是优化透明化（方案步骤3.4）和抗体溶液（方案步骤4.8和4.10）中的孵育时间，主要与标本大小和组织生物组成有关。我们估计 500 μm 代表组织厚度极限，以实现白质和灰质的最佳透明度，并在整个组织深度均匀标记几种抗体染色（表 2）。这些过程的详细描述可以在 Pesce 等人 18 和 Scardigli 等人 24 中找到。不同的大脑区域可能具有不同的脂质和蛋白质组成，衰老的大脑会产生高含量的脂褐素型色素和神经黑色素，这些色素和神经黑色素会产生强烈的自发荧光信号并改变探针在整个组织中的扩散。例如，来自人类布罗卡区域的 400 μm 厚、16 cm2 的切片需要用透明溶液处理 7 天才能达到高水平的脱脂。为确保整个组织深度的均匀染色，需要分别与一抗和二抗溶液一起孵育 7 天和 6 天（图 3）。因此，在应用本文所述的高通量方案之前，需要对清除和标记步骤进行精细优化。

SHORT可以将样品存储在定制的成像支架中，因为已经证明荧光信号可以保存至少一年。因此，研究人员可以提前准备好所有的三明治，并将它们储存起来，以便随后进行成像步骤。值得注意的是，用于制备三明治的显微镜载玻片、垫片和盖玻片可以根据标本的大小进行定制。

使用此处描述的 SHORT 协议处理的样品使用定制的倒置 LSFM18,23 进行分析。该装置包括两个臂，配备 12 个定制物镜和折射率 （RI） 校正环。每个物镜同时充当照明和检测臂，允许以 0.16 cm3/h 的体积速度同时采集两个通道。由于标本架一次可以容纳两个三明治，因此我们能够在 10 小时内连续对两个切片中的四个通道进行成像。由于 TDE 蒸气对呼吸系统的毒性较轻，为避免球面像差，样品架中填充了 91% v/v 甘油/水溶液，该溶液与石英盖玻片和 TDE 溶液的 RI （1.46） 相匹配。91% v/v 甘油/水溶液必须每 3 天更换一次，以避免灰尘污染。因此，我们的LSFM在后处理18,23,29后，能够以3.6 μm的各向同性分辨率快速采集具有低光漂白的样品。使用定义的管道处理产生的大量数据，以便使用自主开发的软件ZetaStitcher（https://github.com/lens-biophotonics/ZetaStitcher）23,29对图像堆栈进行重新切片和拼接。

虽然我们将SHORT与光片荧光显微镜结合使用，但根据实验室的可用性和具体应用，可以采用不同类型的荧光成像技术进行采集。例如，共聚焦显微镜25或双光子显微镜14可用于分析清除的标本。对于体积相对较小的样品，建议进行这种类型的分析，因为它们是基于扫描的系统，并且大组织区域的采集时间非常长30。通过实现更快的成像和横向和轴向分辨率解耦，光片荧光显微镜是成像大量透明样品的首选方法3,4,18,31,32,33。

总之，我们描述了一种快速的高通量方案，用于同时清除、均匀共标记和数十个死后人脑切片的 3D 体积重建。通过将SHORT与LSFM成像和计算分析相结合，可以获得三维数据，用于人脑的全面细胞普查和蛋白质组学分析。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢马萨诸塞州总医院放射科 AA Martinos 生物医学成像中心的 Bruce Fischl 提供本研究中分析的人脑标本。该项目获得了欧盟地平线2020研究与创新框架计划（Laserlab-Europe）第654148号赠款协议的资助，欧盟地平线2020研究与创新框架计划根据第785907号（人脑项目SGA2）和第945539号（人脑项目SGA3）获得资助，来自美国国立卫生研究院综合医院公司中心，奖励编号为U01 MH117023， 以及意大利教育部在欧洲生物成像意大利节点（ESFRI研究基础设施）框架内。最后，这项研究是在"Fondazione CR Firenze"的贡献下进行的。本文内容完全由作者负责，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。 图 1 是使用 BioRender.com 创建的。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2,2'-硫代二乙醇Merck Life Science S.R.L.
乙酰胺 >= 99.0% （GC）Merck Life Science S.R.L.160
琼脂糖高 EEOMerck Life Science S.R.L.A9793
硼酸Merck Life Science S.R.L.B7901
压缩型 VF-900-0Z 切片机精密/
盖玻片LaserOptex/定制
乙二胺四乙酸二钠盐 二水合Merck Life Science S.R.L.E5134
戊二醛Merck Life Science S.R.L.G7651
甘氨酸Santa Cruz 生物技术SC_29096
过氧化氢 30%Merck Life Science S.R.L.
培养箱 ISS-4075实验室伴侣 /
光片荧光显微镜 （LSFM）//定制
Loctite AttakHenkel Italia srl/
显微镜载玻片Laborchimica/定制
磷酸盐缓冲片Merck Life Science S.R.L.P4417
Picodent TwinsilPicodent13005002已停产
邻苯二甲酸氢钾Merck Life Science S.R.L.P1088
叠氮化钠默克生命科学有限公司S2002
十二烷基硫酸钠Merck Life Science S.R.L.L3771
亚硫酸钠Merck Life Science S.R.L.S0505
垫片微激光 srl定制
痰液容器（带螺旋盖的培养皿）Paul Boettger GmbH & Co. KG07.061.2000
Tris BasePanReac AppliChem （ITW 试剂）A4577,0500
Triton X-100Merck Life Science S.R.L.T8787
管Sarstedt62 547254
Tween 20Merck Life Science S.R.L.P9416
振动切片机 VT1000SLeica Biosystem/
水浴 MemmertWNB 7-45
抗体和染料
Alexa Fluor 488 AffiniPure 羊驼抗兔 IgG （H+L）Jackson Immuno 研究611-545-215稀释度，1：200
Alexa Fluor 488 AffiniPure 牛抗山羊 IgG （H+L）Jackson Immuno 研究805-545-180稀释度，1：200
Alexa Fluor 647 AffiniPure 羊驼抗兔 IgG （H+L）Jackson Immuno 研究611-605-215稀释度，1：200
抗 NeuN 抗体Merck Life Science S.R.L.ABN91稀释度，1：100
抗细小清蛋白抗体 （PV）Abcamab32895稀释度，1：200
抗波形蛋白抗体 [V9] - 细胞骨架标志物 （VIM）Abcamab8069稀释度，1：200
钙调蛋白多克隆抗体ProteinTech12278_1_AP稀释度，1：200
DAPIThermoFisherD3571稀释度二手，1：100
驴抗小鼠 IgG H&L （Alexa Fluor 568）Abcamab175700稀释度，1：200
驴抗小鼠 IgG H&L （Alexa Fluor 647）Abcamab150107稀释度，1：200
驴抗兔 IgG H&L （Alexa Fluor 568）Abcamab175470稀释度使用，1：200
驴抗大鼠 IgG H&L （Alexa Fluor 568） 吸附Abcamab175475稀释液，1：200
山羊抗鸡 IgY H&L （Alexa Fluor 488）Abcamab150169稀释液，1：500
山羊抗鸡 IgY H&L （Alexa Fluor 568）Abcamab175711稀释液，1：500
山羊抗鸡 IgY H&L （Alexa Fluor 647）Abcamab150171稀释度，1：500
山羊抗兔 IgG H&L （Alexa Fluor 488）Abcamab150077稀释度，1：200
重组 Alexa Fluor 488 抗 GFAP 抗体Abcamab194324稀释度，1：200
生长抑素抗体 YC7Santa Cruz Biotechnologysc-47706稀释度，1：200
血管活性肠肽 （VIP）ProteinTech16233-1-AP稀释度，1：200
166782物 剂

参考文献

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