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方法文章

大规模人脑成像中用于光片荧光显微镜的光学透明化与标记技术

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DOI：

10.3791/65960

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2024年1月26日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1European Laboratory for Non-linear Spectroscopy (LENS), University of Florence, 2Division of Physiology, Department of Experimental and Clinical Medicine, University of Florence, 3Department of Physics, University of Pisa, 4National Research Council - National Institute of Optics (CNR-INO), 5Department of Physics and Astronomy, University of Florence, 6Department of Biology, University of Florence

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案提供了一种结合（的逐步操作流程，用于对数十个死后人类脑切片进行快速且同步的光学透明化、多轮标记及三维体积重建SWITCH - H2O2 - 抗原 R2,2'-硫代二乙醇的提取TDE]) 短时组织转化技术结合光片荧光显微成像的常规高通量实验方案

摘要

尽管过去十年中出现了多种组织透明化技术，但由于人脑的体积和结构复杂性，对死后人脑进行处理仍是一项具有挑战性的任务，这使得微米级分辨率的成像尤为困难。本文介绍了一种通过同时处理数十个脑片来重建人脑体积区域的方案，该方案采用SHORT（SWITCH - H2O2 - 抗原 R2,2'-硫代二乙醇的提取TDE]) 组织转化方案，可实现样本的透明化、标记及使用光片荧光显微镜（LSFM）进行连续成像。SHORT 方法可快速透明化厚切片并实现多种神经元标记物的均一多标，从而在白质和灰质中均可识别不同的神经元亚群。透明化后，切片可通过 LSFM 以微米级分辨率进行多通道同步成像，实现快速三维重建。将 SHORT 与 LSFM 分析结合于常规高通量流程中，可在短时间内实现大体积区域的高分辨率三维细胞构筑重建，从而实现对人脑结构的全面表征。

引言

分析人脑大体积样本的三维分子结构和细胞架构需要实现组织的光学透明，这通常通过耗时较长的处理流程来完成。光学透明化技术旨在最大限度地减少组织内部折射率（RI）的不均匀性，从而降低光散射，提高光穿透深度，以实现高分辨率成像1,2,3,4,5。近年来在透明化和深层组织标记方法上的进展，结合前沿显微成像技术，已可对完整的啮齿类动物器官和胚胎进行三维成像6,7,8,9,10,11,12。

然而，与模式生物相比，对死后人脑大范围区域进行容积式三维重建仍是一项具有挑战性的任务。复杂的生物组成以及多变的死后固定和储存条件可能会影响组织透明化效率、抗体渗透深度以及表位识别13,14,15,16,17,18,19。此外，为了实现对人大脑大范围区域的有效透明化和均匀标记，仍需进行机械切片，并对每一片组织进行后续的透明化和标记处理，这导致处理时间较长，并需要复杂的定制设备 ，相比之下，模式生物则无需如此15,20,21,22。

的 SWITCH - H2O2 抗原 R检索 -TDE（短时）组织转化技术已专门开发用于分析大量的人脑组织18,23该方法采用 SWITCH 试剂盒的组织结构保存技术11 并利用高浓度的过氧化氢降低组织自发荧光，结合表位修复技术。该方法可实现对人脑切片中不同神经元亚型、胶质细胞、血管以及髓鞘纤维标记物的均匀染色。18,24其结果适用于低密度和高密度蛋白质的分析。. 由此产生的高透明度和均匀标记可实现厚切片的荧光显微镜三维重建，特别是可使用快速成像的光片显微装置进行数据采集18,24,25,26,27.

在本研究中，我们描述了如何利用 SHORT 组织转化技术，对数十片福尔马林固定的成人脑组织切片进行同步透明化和多轮标记。可同时使用四种不同的荧光标记物，从而鉴定不同的细胞亚群。透明化后，可通过荧光显微镜进行高分辨率的三维成像。本文中我们使用了一台定制的倒置 LSFM18,24,25,26,27，该系统能够实现样本的快速光学切片，并行快速获取多个通道的图像。通过这一常规高通量实验流程，可对人脑大范围区域进行亚细胞分辨率水平的全面细胞与结构表征，此前已在全布罗卡区的图谱绘制中得到验证23。

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方案

福尔马林固定的人体组织样本由美国马萨诸塞州波士顿市麻省总医院（MGH）尸检服务部神经病理学系提供。在死亡前，已从健康参与者处获得书面知情同意，该组织采集方案经合作伙伴机构生物安全委员会（PIBC，方案编号2003P001937）批准的机构审查委员会（IRB）审核通过。授权文件保存于美国马萨诸塞州波士顿市麻省总医院尸检服务部，可根据要求提供。

1. 琼脂糖包埋与样品切片

  1. 在烧杯中用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）配制 4% w/v 琼脂糖溶液，并将组织块包埋其中。待其冷却至室温（RT）后，于 4 °C 保存 24 小时。
  2. 为获得高精度切片，将样品粘附至振动切片机的样品盘上，并在切片槽中加入冷的 1× PBS（pH 7.4）。根据待切组织类型调整振动切片机的参数，如频率、振幅和速度（本实验所用参数：频率 = 5（50 Hz）；振幅 = 0.4；速度 = 3（0.15 mm/s））。
    注意：应根据样品体积选择不同的振动切片机。对于最大体积为 70 × 40 × 15 mm 的样品，可使用振动切片机（例如 Leica VT1000 S）；对于更大体积的样品，可使用压缩切片机（例如 VF-900-0Z Microtome18）或定制装置21。本文所展示的切片厚度为 400 µm 或 500 µm。
  3. 切片完成后，将所有切片置于保存液中，保存液成分为含 0.01% w/v 叠氮化钠（NaN3）的 1× PBS（pH 7.4），并于 4 °C 保存。
    ​注意：在包埋前，需等待琼脂糖溶液冷却至 37 °C。温度过高可能损伤组织样本。建议固定时间不超过 48 小时，因长时间固定可能破坏抗原并增强组织自发荧光，从而干扰标记过程。对于人源组织的长期保存，使用含 NaN3 的 PBS 可防止微生物污染。由于叠氮化钠（NaN3）具有毒性，应在化学通风橱内配制保存液。

2. 组织固定

注意：以下方案中使用的所有溶液均需大量配制，足以处理同一组织块的所有切片，以尽量减少技术差异并缩短各步骤所需时间。

  1. 配制关闭溶液：含50% v/v 1× PBS（pH 3）、25% v/v 0.1 M 盐酸（HCl）、25% v/v 0.1 M 邻苯二甲酸氢钾（KHP）以及新鲜的4% v/v 戊二醛。将所有样品置于带螺口盖的培养皿（70 × 23 mm）中，加入关闭溶液，在4 °C条件下避光（用铝箔包裹）轻轻振荡孵育1天。
  2. 配制开启溶液：含1× PBS（pH 7.4）和新鲜的1% v/v 戊二醛。将所有样品转移至新的培养皿中，加入开启溶液，在4 °C条件下避光（用铝箔包裹）轻轻振荡孵育1天。
    ​注意：由于戊二醛具有高毒性和光敏感性，关闭溶液和开启溶液必须现配现用，并置于冰上、在通风橱内保存。每次均应向培养皿中加入20 mL溶液，并用封口膜密封。

3. 灭活与透明化

注意：必须通过孵育灭活溶液来灭活样品中具有反应活性的戊二醛，灭活溶液组成为 1× PBS（pH 7.4）、4%（w/v）乙酰胺、4%（w/v）甘氨酸，pH 9.0。该溶液可在 4 °C 下保存长达 3 个月。为去除脂质并使组织透明，我们使用透明溶液，其组成为 200 mM 十二烷基硫酸钠（SDS）、20 mM 亚硫酸钠（Na2SO3）和 20 mM 硼酸（H3BO3），pH 9.0。该溶液必须在室温下保存，因为 SDS 在 4 °C 时会发生沉淀。后续所有步骤均在装有该溶液的离心管中进行。

  1. 将样品从培养皿转移至离心管中，用 1× PBS（pH 7.4）在室温下轻轻振荡洗涤，每次 2 小时，共洗涤 3 次。
    注意：步骤 3.1 必须在通风橱内操作，因为戊二醛具有毒性。乙酰胺、SDS 和硼酸也属于有毒试剂，均需在通风橱中操作。每次务必用 50 mL 溶液充满离心管。
  2. 将样品置于灭活溶液中，在 37 °C 水浴中孵育过夜（o/n）。
  3. 用 1× PBS（pH 7.4）在室温下轻轻振荡洗涤，每次 2 小时，共洗涤 3 次。
  4. 将样品置于透明化溶液中，在 55 °C 水浴中孵育 3–7 天。每 2 天更换一次溶液（表 1）。

4. 免疫标记

注意：在标记步骤之前，必须去除残留的十二烷基硫酸钠（SDS），降低自发荧光，并使用抗原修复液（含10 mM Tris碱、1 mM EDTA和0.05% v/v Tween 20，pH 9）进行表位暴露。pH 9的条件可优化抗原修复效率；Tris碱作为缓冲剂，维持稳定的pH环境；EDTA是一种螯合剂，可增强抗原的可及性；非离子型去垢剂Tween 20有助于提高组织通透性。该溶液可在4 °C保存。需要注意的是，过氧化氢与抗原修复步骤联用时，可通过分解或修饰内源性荧光物质（如脂褐素）来降低自发荧光信号，从而在减少非特异性背景信号方面产生协同效应。

  1. 配制含0.1% v/v Triton X-100的1×PBS（PBST），预热至37 °C，在培养箱中于37 °C轻柔振荡条件下，每日分3次、每次3小时清洗样本。最后一次清洗过夜。
    注意：PBST储存液应保存于4 °C。必须彻底去除组织中的SDS，因其在低温下可能形成不溶性沉淀，干扰后续成像过程。
  2. 次日，向每个样本中加入10 mL 30% v/v过氧化氢（H2O2），在室温下轻柔振荡孵育45分钟。
  3. 用1×PBS（pH 7.4）在室温下轻柔振荡清洗3次，每次10分钟。
  4. 将抗原修复液在95 °C水浴中预热；将样本转移至预热的修复液中，在95 °C下孵育10分钟。
  5. 在轻柔振荡条件下，使样本在修复液中自然冷却至室温，约40分钟。
  6. 用去离子水在轻柔振荡条件下清洗3次，每次5分钟。
  7. 将样本在4 °C的PBS中平衡15分钟。
  8. 现配含0.01% w/v NaN3的PBST抗体稀释液（参见步骤1.3的注意项 ），加入一抗。将样本置于带螺旋盖的培养皿中，于37 °C孵育箱内轻柔振荡、避光孵育n天（1–7天）（表2）。
    注意：孵育时间取决于样本大小和厚度（表1和表2）。
  9. 孵育n天后，将样本转移至离心管中，在孵育箱内用预热的PBST于37 °C轻柔振荡清洗3次，每次2小时。
  10. 在含0.01% w/v NaN3的PBST中加入二抗，将样本转移至新的带螺旋盖培养皿中，于37 °C孵育箱内轻柔振荡、避光孵育n天（1–6天）（表1和表2）。
  11. 孵育n天后，将样本转移至离心管中，在37 °C孵育箱内用预热的PBST轻柔振荡清洗3次，每次3小时，当日完成；最后一次清洗过夜。
    ​注意：由于Triton X-100和Tween 20具有黏性，移液时应缓慢操作，确保吸头充分充满。每次均需向离心管中加入50 mL溶液。每个样本使用10 mL抗体溶液，并用封口膜密封培养皿以防止溶液蒸发。由于抗体溶液含有NaN3，可在4 °C保存，并在2周内重复用于新样本的标记。

5. 折射率匹配

注意：为了实现高透明度，有必要使组织的折射率均一化。此处我们使用溶于1× PBS中的2,2'-二乙硫醇（TDE）。TDE溶液必须在室温下保存。

  1. 将样品转移至新的培养皿中，加入30% v/v TDE，在室温下轻轻振荡孵育4小时。
  2. 去除30% v/v TDE溶液，向样品中加入68% v/v TDE，在室温下轻轻振荡孵育。
    ​注意：由于TDE具有黏性，移液时应缓慢操作，以确保吸头充分充满。吸入TDE蒸气或雾滴可能刺激呼吸道，因此建议在通风良好的环境中操作，或使用通风橱以减少暴露风险。TDE溶液应于室温下保存。每个样品使用10 mL TDE溶液。

6. 样品安装

注意：为了便于样品安装和光片显微镜成像，我们使用一种自制的密封样品 holder（称为“"三明治"”），它由三个部分组成：载玻片、间隔垫片和盖玻片。

  1. 将钢制垫片（56 × 56 × 0.5 mm3）置于显微镜载玻片（60 × 60 × 1 mm3）上，并将样品放置在载玻片上。
  2. 小心地盖上石英盖玻片（60 × 60 × 0.5 mm3），用夹具固定所有组件，并按1:1比例配制双组分硅胶。使用石英盖玻片可匹配折射率，减少成像过程中的光学像差。
  3. 使用1 mL注射器将双组分硅胶注入垫片与盖玻片之间的空隙中，静置干燥10分钟。
  4. 取下夹具，用细针缓慢将68%（v/v）TDE注入整个样品夹心结构中。
  5. 重新配制新鲜胶液并密封夹心结构。
    ​注意：如果在步骤6.1中TDE意外接触垫片，胶体将无法固化。确保在步骤6.2中不产生气泡。

7. 剥离

注意：SHORT 技术在保持组织结构完整的同时增强了表位的可及性，因此可通过去除抗体并用其他标记物对样本重新染色，实现切片的多轮标记。

  1. 用刀片打开三明治结构，将样本放入带有螺旋盖的新培养皿中，加入30% v/v TDE溶液，室温孵育3小时。
  2. 将样本转移至离心管中，用1× PBS（pH 7.4）在室温下轻轻振荡清洗3次，每次2小时，最后一次清洗过夜。
  3. 将样本置于水浴中，80 °C条件下在透明化溶液中孵育4小时。
  4. 用1× PBST（pH 7.4）在37 °C下轻轻振荡清洗3次，每次2小时，最后一次清洗过夜。此时样本已准备好，可从步骤4.8开始重新进行标记。
    注意：每次操作均需向离心管中加入50 mL相应溶液。每份样本使用10 mL TDE溶液。

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结果

本方案采用SHORT方法，可同时处理厚度在100 µm至500 µm范围内的多个脑片，显著缩短了整个实验流程的处理时间。本文全面描述了同时处理多张死后人脑厚切片的完整流程（图1），并展示了同时处理24张切片的实验操作（图2A）。根据样本的大小和厚度，透明化与共标记所需时间在11至30天之间（表1），此时间不包括成像及成像后处理。在TDE中完成脱脂和折射率匹配后，所有组织切片的灰质和白质均达到理想且均匀的透明效果（图2B）。

图像采集可使用多种先进的荧光显微镜完成，包括共聚焦显微镜25和双光子显微镜14。本研究中采用了一台定制的倒置光片荧光显微镜（LSFM）18,23

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讨论

对大面积人脑组织进行高分辨率成像和三维重建，需要先进行机械切片，随后对单个切片进行光学透明化处理和免疫标记。本文所述方案介绍了如何利用SHORT组织转化方法，快速、同步地处理多个人脑厚切片，以实现亚细胞分辨率的全脑三维重建，适用于光片显微镜（LSFM）成像。

与其他方法不同，SHORT 方法的透明化和多重标记步骤无需复杂的定制设备。大量样本可同时处理，从而缩短大尺寸人脑组织块的处理时间，并最大限度地减少技术变异性。

在处理陈旧的甲醛固定人体组织时，脱色和表位暴露处理至关重要。过氧化氢和碱性抗原修复溶液还可与其他透明化方法联合使用，例如 iDISCO6,28、CLARITY、SWITCH 和 SHIELD24。

为了确保表位信息的完整保留并实现灰质和白质的均匀透明化，有必要将样本转化为一种耐热且耐化学试剂的凝胶...

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披露

作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

致谢

感谢马萨诸塞州总医院A.A. Martinos生物医学成像中心放射科的Bruce Fischl提供了本研究中分析的人脑标本。本项目获得了欧盟“地平线2020”研究与创新框架计划资助协议编号654148（Laserlab-Europe）、欧盟“地平线2020”研究与创新框架计划特定资助协议编号785907（人脑计划SGA2）和编号945539（人脑计划SGA3）、美国国立卫生研究院下属综合医院中心资助号U01 MH117023，以及意大利教育部门在Euro-Bioimaging意大利节点（ESFRI研究基础设施）框架内的资助。最后，本研究还得到了"Fondazione CR Firenze."的支持。本研究内容的全部责任由作者承担，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。图1使用BioRender.com制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2,2'-硫代二乙醇Merck Life Science S.R.L.166782
乙酰胺 >= 99.0% (GC)Merck Life Science S.R.L.160
高电渗流琼脂糖Merck Life Science S.R.L.A9793
硼酸Merck Life Science S.R.L.B7901
Compressome VF-900-0Z 切片机Precisionary/
盖玻片LaserOptex/定制
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物Merck Life Science S.R.L.E5134
戊二醛Merck Life Science S.R.L.G7651
甘氨酸Santa Cruz BiotechnologySC_29096
30% 过氧化氢Merck Life Science S.R.L.
培养箱 ISS-4075Lab companion /
光片荧光显微镜 (LSFM)//自制
Loctite AttakHenkel Italia srl/
显微镜载玻片Laborchimica/定制
磷酸盐缓冲液片剂Merck Life Science S.R.L.P4417
Picodent TwinsilPicodent13005002已停产
邻苯二甲酸氢钾Merck Life Science S.R.L.P1088
叠氮化钠Merck Life Science S.R.L.S2002
十二烷基硫酸钠Merck Life Science S.R.L.L3771
亚硫酸钠Merck Life Science S.R.L.S0505
间隔片Microlaser srl定制
痰液收集容器（带螺旋盖的培养皿）Paul Boettger GmbH & Co. KG07.061.2000
Tris 碱PanReac AppliChem (ITW reagents)A4577,0500
Triton X-100Merck Life Science S.R.L.T8787
离心管Sarstedt62 547254
Tween 20Merck Life Science S.R.L.P9416
振动切片机 VT1000SLeica Biosystem/
水浴锅 MemmertWNB 7-45
抗体与染料
Alexa Fluor 488 AffiniPure 羊驼抗兔 IgG (H+L)Jackson Immuno Research611-545-215使用稀释度 1:200
Alexa Fluor 488 AffiniPure 牛抗山羊 IgG (H+L)Jackson Immuno Research805-545-180使用稀释度 1:200
Alexa Fluor 647 AffiniPure 羊驼抗兔 IgG (H+L)Jackson Immuno Research611-605-215使用稀释度 1:200
抗 NeuN 抗体Merck Life Science S.R.L.ABN91使用稀释度 1:100
抗钙结合蛋白抗体 (PV)Abcamab32895使用稀释度 1:200
抗波形蛋白抗体 [V9] - 细胞骨架标记物 (VIM)Abcamab8069使用稀释度 1:200
钙视网膜蛋白多克隆抗体ProteinTech12278_1_AP使用稀释度 1:200
DAPIThermoFisherD3571使用稀释度 1:100
驴抗小鼠 IgG H&L (Alexa Fluor 568)Abcamab175700使用稀释度 1:200
驴抗小鼠 IgG H&L (Alexa Fluor 647)Abcamab150107使用稀释度 1:200
驴抗兔 IgG H&L (Alexa Fluor 568)Abcamab175470使用稀释度 1:200
驴抗大鼠 IgG H&L (Alexa Fluor 568) 预吸附Abcamab175475使用稀释度 1:200
山羊抗鸡 IgY H&L (Alexa Fluor 488)Abcamab150169使用稀释度 1:500
山羊抗鸡 IgY H&L (Alexa Fluor 568)Abcamab175711使用稀释度 1:500
山羊抗鸡 IgY H&L (Alexa Fluor 647)Abcamab150171使用稀释度 1:500
山羊抗兔 IgG H&L (Alexa Fluor 488)Abcamab150077使用稀释度 1:200
重组 Alexa Fluor 488 抗 GFAP 抗体Abcamab194324使用稀释度 1:200
生长抑素抗体 YC7Santa Cruz Biotechnologysc-47706使用稀释度 1:200
血管活性肠肽 (VIP)ProteinTech16233-1-AP使用稀释度 1:200

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