小胶质细胞被认为是体内最具可塑性的细胞之一，能够进行形态和功能上的适应。其异质性和多功能性不仅有助于维持大脑稳态，也与多种神经系统疾病相关。本文介绍了一种纯化脊髓小胶质细胞的技术。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
脊柱是脊椎动物的特征性结构，并形成包裹和保护脊髓的椎管。哺乳动物中枢神经系统的正常发育与功能在很大程度上依赖于一类称为小胶质细胞的常驻巨噬细胞。小胶质细胞具有异质性和多功能性，使其在脊髓和大脑中表现出不同的基因表达模式和行为特征。已有大量研究探讨了脑内小胶质细胞的功能，并详细描述了其纯化方法。然而，从小鼠脊髓中纯化小胶质细胞的完整流程尚缺乏系统性报道。此外，在中枢神经系统组织中使用高纯度胶原酶（而非粗提物）的相关研究亦未见报道。本研究中，从小鼠（C57BL/6，8–10周龄）中分离出脊柱和脊髓组织，随后采用高纯度胶原酶进行消化，并利用密度梯度法纯化小胶质细胞。细胞经染色后进行流式细胞术分析，通过CD11b和CD45标记评估细胞活力和纯度。结果显示，平均细胞活力为80%，平均纯度达95%。综上所述，通过高纯度胶原酶消化结合密度梯度法，可有效实现小鼠脊髓小胶质细胞的分离与富集，获得大量高纯度的脊髓小胶质细胞群体。
引言
脊椎动物的显著特征是具有脊柱，即脊索被一系列分节的骨骼（称为椎骨）所取代，椎骨之间由椎间盘分隔。这种成串的骨性结构形成了椎管，椎管是一个包裹并保护脊髓的腔隙1。在啮齿目（Rodentia）中，脊柱通常由7块颈椎、13块胸椎、6块腰椎以及数量可变的尾椎组成2,3。脊髓的长度与脊柱相近，终丝是一种非神经性结构，将脊髓固定于骶骨。此外，神经纤维通过椎间孔穿出1。
哺乳动物中枢神经系统的发育和正常功能在很大程度上依赖于神经系统常驻巨噬细胞（即小胶质细胞）的活动4。尽管小胶质细胞最初被描述为脑内常驻的吞噬细胞，但近期研究发现这些细胞具有多种动态功能5,6。在稳态条件下，小胶质细胞的大小为7至10 µm；它们被认为是体内最具可塑性的细胞之一，能够根据不断变化的环境在形态和功能上进行适应7。这些细胞在胚胎期和成年期均表现出高度异质性8,9，而在成年阶段，其功能异质性还因时空环境的不同而更加复杂10。小胶质细胞的异质性和多种功能使其在脊髓和大脑中表现出差异化的基因表达和行为特征。已有研究表明，与大脑相比，脊髓中小胶质细胞的CD11b、CD45、CD86和CCR9表达水平更高8,9。
目前已有多种用于分离脑部小胶质细胞的实验方案11,12；然而，针对脊髓小胶质细胞的分离方案却寥寥无几13,14。优化从小鼠脊髓中纯化小胶质细胞的方法，有助于推动多项聚焦于小胶质细胞生理学研究的发展。本实验方案旨在描述一种简单且高度可重复的小鼠脊髓提取及小胶质细胞纯化方法（图1）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本研究遵循墨西哥官方标准NOM-062-ZOO-1999以及《实验动物护理与使用指南》。研究已获得墨西哥儿童医院研究、伦理与生物安全委员会（HIM/2023/006）以及墨西哥埃杜阿尔多·利塞加总医院研究与生物伦理委员会（DI/21/501/04/62）的批准。三只6至8周龄的C57BL/6小鼠来自墨西哥儿童医院，在符合机构实验动物护理与使用指南的通风笼架中隔离饲养。
1. 材料与试剂的准备
- 将不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 以及汉克斯平衡盐溶液（HBSS）预热至 37 °C。
- 在 HBSS 溶液中加入 100 µg/mL Liberase 和 4 µg/mL DNase（HBSS-LD），确保溶液维持生理 pH 值 7.4。
注意：每条脊髓需要 1 mL 工作液。 - 准备用于密度梯度离心的等渗 90% 溶液（可购买商品化产品，参见 材料表），并预热至 37 °C。
- 通过将 5% 热灭活胎牛血清（FBS）与 PBS 混合制备染色缓冲液，并将混合液置于冰上保存。
- 将高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（1 g/L）（DMEM）预热至 37 °C。
- 在 DMEM 培养基中添加 10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、200 U/mL 青霉素、200 µg/mL 链霉素和 500 pg/mL 两性霉素 B（参见 材料表），配制 DMEM-S 培养基。
2. 脊髓的解剖与制备
- 以150 mg/kg剂量的戊巴比妥腹腔注射过量处死小鼠，并使用70%乙醇对小鼠的胸部和背部进行消毒。
注意： 在进行小鼠解剖前，须确认动物已成功处死。 - 剃除胸腰段区域的毛发，并用胶带将四肢固定在解剖板上。
- 使用手术刀沿枕部至骶部的背侧中线小心切开（图2）。
- 在体视手术显微镜辅助下逐层解剖，直至暴露腰椎并识别最后一对肋弓。
注意：13对肋弓与胸椎相连；解剖时可见其位于L1椎体上方2。 - 确定最后一节颈椎和骶骨位置，然后切断以分离脊柱（图2）。
- 利用解剖镊对椎骨进行背侧椎板切除，以取出脊髓（图3A-D）。
注意：除前两节颈椎（寰椎和枢椎）外，所有可动椎骨在不同区域（颈椎、胸椎或腰椎）均具有相似的基本形态结构。每个典型的可动椎骨前端为圆柱形的椎体。椎体后方连接着一个骨性弓状结构，称为椎弓（神经弓），由椎板和棘突组成。这些结构之间围成的空间为椎孔15。 - 去除通过椎间孔穿出的神经（背根和腹根），这些神经构成周围神经系统，可能含有浸润的巨噬细胞（图3D）。
注意：无需去除软脑膜或脑膜，因为密度梯度介质可有效清除污染的星形胶质细胞。此外，保留脑膜可缩短纯化时间并提高细胞存活率。
3. 组织消化与小胶质细胞的分离
- 将脊髓置于解剖板上，使用Vannas剪刀将脊髓切成2 mm的片段，平均可得到10段。
- 将脊髓片段转移至一个2 mL平底微量离心管中（图3E，F）。
- 加入1 mL HBSS-LD工作液（步骤1.2）。在37 °C孵育25分钟，每5分钟剧烈涡旋振荡一次。
- 将每次消化的产物通过40 µm细胞筛过滤，然后加入7 mL含2% FBS的HBSS以终止消化反应。
- 使用1 mL注射器活塞碾压残留组织。将悬液转移至50 mL锥形离心管中，在220 × g、4 °C条件下离心5分钟。
- 用1 mL移液器弃去上清液，将沉淀重悬于15 mL锥形离心管中的2 mL含2% FBS的HBSS中。加入2 mL 90%等渗密度梯度介质。在160 × g、18 °C条件下离心25分钟。
注意：使用慢加速模式，并避免使用刹车。 - 使用移液管吸取界面层，并转移至另一个15 mL锥形离心管中。用10 mL PBS洗涤细胞，并在220 × g、4 °C条件下离心5分钟。
- 将细胞重悬于DMEM-S（步骤1.6）中，并置于冰上保存。
4. 确定纯度/活力
- 使用血细胞计数板对活细胞进行定量时，采用0.4%台盼蓝染色（参见 材料表).
注：平均每只小鼠可提供 400–600 万个细胞。 - 定量活细胞 通过 流式细胞仪，采用市售的胺反应性荧光染料染色（参见 材料表).
- 将100万个细胞转移至一个5 mL聚苯乙烯圆底（FACS）管中。用PBS按1:1000的比例稀释荧光染料（配制活力检测工作液）。
- 在4 °C避光孵育样品与活力检测液30分钟。用预冷的PBS洗涤细胞两次。将细胞重悬于400 µL染色缓冲液（步骤1.4）中。
- 用 2.4G2 抗 FcRIII/I 封闭细胞（参见 材料表在冰浴染色缓冲液中于 4 °C 孵育 15 分钟。
- 通过将荧光标记的单克隆抗体 CD45-PerCP 和 CD11b-eFluor 450 加入染色缓冲液中（稀释比例为 1:300），配制抗体染色混合液（参见 材料表).
注意：虽然两种技术均可使用，但应选择与后续实验方案最匹配的一种。 - 在4 °C避光孵育30分钟，使用抗体染色混合液处理样本。用预冷的染色缓冲液洗涤细胞两次。将细胞重悬于400 µL染色缓冲液中。
- 根据第6步中的设门策略，在流式细胞仪上获取250,000个事件图4).
5. 免疫荧光染色
- 将预处理的盖玻片放入6孔板的一个孔中。
注意：处理盖玻片时，将其置于培养皿中，加入500 µL L-多聚赖氨酸溶液（0.01 mg/mL，参见材料表），孵育1小时。随后用蒸馏水洗涤三次，并使其自然干燥。 - 用500 µL DMEM-S溶液将200,000个细胞接种到处理过的盖玻片上，孵育24小时。
- 取出盖玻片，用3.7%多聚甲醛（PFA）在室温下固定细胞20分钟。用冰浴PBS洗涤盖玻片三次。
- 用含0.2% Triton X-100的PBS在室温下对细胞进行透化处理，持续15 分钟。随后用冷PBS洗涤盖玻片三次。在室温下用含0.2% BSA的PBS封闭细胞1小时。
- 将荧光标记的单克隆抗体（按1:300稀释，参见材料表）加入封闭液中，室温孵育1小时。用冰浴PBS洗涤盖玻片三次。
- 在载玻片上滴加含DAPI的封片剂，然后用盖玻片封片。
注意：样品可立即使用荧光显微镜或共聚焦显微镜进行观察，也可在-20°C条件下保存长达3个月。
6. 脊髓小胶质细胞的设门策略
- 生成点图，并根据活力染色和一个空白荧光通道设置门控，以分离活细胞16。排除非活细胞。
- 利用前向散射和侧向散射参数生成另一张图，以去除碎片16。
- 建立另一张点图，分析 CD11b 和 CD45 的表达，以区分小胶质细胞。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
利用小鼠脊髓组织，使用富含胶原酶和嗜热菌蛋白酶的混合物进行酶消化。将消化后的组织通过40 µm滤膜过滤，以去除未消化的组织成分。收集的细胞通过Percoll密度梯度离心进行富集，其中90%位于下层，45%位于上层。位于两层界面处的富含小胶质细胞的组分随后用CD45和CD11b抗体染色，并进行流式细胞术分析（图1）。
从枕部区域延伸至骶骨的脊柱解剖，涉及椎旁肌群的暴露与分离。为释放脊柱，需暴露肋弓，并从第13胸椎（T13）至第1胸椎（T1）进行测量。随着与颅骨和骶骨相连接的脊柱显露出来，于两侧各进行一次切割，以完全游离脊柱（图2）。
通过在椎体上做侧向切口形成通道，从而实现脊髓的提取。在取出脊髓的过程中，切断周围神经以防止外周巨噬细胞的污染。随后，将获得的脊髓组织铺展在解剖台上，并切成2 mm的片段，加入消化液中（图3）。本研究首次报道使用Libera...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
由于小胶质细胞在脑内稳态中的重要作用，目前已开发出多种研究小胶质细胞的实验方案。在这些方法中，小胶质细胞通常来源于胚胎期或新生期大鼠和小鼠的大脑半球17。仅有少数研究报道了从成年小鼠脊髓中分离纯化小胶质细胞的方法13,14。这些技术通常包括使用胶原酶和/或木瓜蛋白酶联合DNA酶进行酶消化处理，并常结合Percoll或OptiPrep密度梯度离心分离。然而，若采用基于木瓜蛋白酶的脊髓消化方法而不进行梯度分离，则即使在去除软脑膜后，仍可能导致星形胶质细胞污染14,17。
本研究介绍了一种从成年小鼠脊髓中纯化小胶质细胞的实验方案。该方案采用胶原酶I与II的精确混合物，并联合使用嗜热菌蛋白酶，这种组合能够高效消化多种组织并实现可控降解18，同时由于其中中性蛋白酶含...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到了墨西哥国家科学技术委员会（CONACYT）提供的奖学金（702361）资助。作者感谢国家理工学院国家生物科学学院化学生物科学博士项目的支持。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 mL 收集管 | Corning, USA | 430790 | |
| 2 mL 微量离心管 | Axygen, USA | MCT-200-G | |
| 2.4G2 抗 FcR 抗体 | BioLegend, USA | 101302 | |
| 50 mL 收集管 | Corning, USA | 430829 | |
| 70% 乙醇 | |||
| 抗生素-抗真菌素（青霉素、链霉素、两性霉素 B） | Gibco, USA | 15240062 | |
| CD11b eFluor 450 抗小鼠抗体 | eBioscience, USA | 48-0112 | |
| CD45 PerCP 抗小鼠抗体 | BioLegend, USA | 103130 | |
| 无钙镁平衡盐溶液（PBS） | Corning, USA | 46-013-CM | |
| 蓝色细胞滤网 40 μm | Corning, USA | 352340 | |
| Costar 6 孔透明未处理培养板 | Corning, USA | CLS3736 | |
| 盖玻片 | |||
| 数字加热振荡干浴器 | Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA | 88870001 | |
| 显微外科用解剖镊 | FT by DUMONT | ||
| DNase | Roche, USA | 4536282001 | |
| Dulbecco´s 改良 Eagle´s 培养基-高糖（DMEM） | Merck, USA | D6429 | |
| 电动剃毛器 | |||
| FACS 管 | Thermo, USA | 352058 | |
| 胎牛血清（FBS） | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| Cytoflex 流式细胞仪 | Beckman Coulter | ||
| Hank’s 平衡盐溶液 | Merck, USA | H2387 | |
| L-谷氨酰胺 | Corning, USA | 15393631 | |
| Liberase TM | Roche, USA | 5401119001 | |
| Neubauer 计数板 | 中国 | 1103 | |
| 戊巴比妥 | |||
| Percoll | Merck, USA | 17089101 | 密度梯度离心 |
| 多聚-L-赖氨酸溶液 | Merck, USA | P8920 | |
| 25 号手术刀片 | HERGOM, 墨西哥 | H23 | |
| 2 mL 扣盖微量离心管 | Axygen, USA | 10011-680 | |
| 体视显微镜 | Velab, 墨西哥 | HG927831 | |
| 直型手术剪（10 cm） | HERGOM, 墨西哥 | ||
| 直型Vannas剪刀 | HERGOM, 墨西哥 | ||
| Triton X100 | Merck, USA | X100 | |
| 0.4% 台盼蓝染色液 | Merck, USA | 15250-061 | |
| 涡旋混合器 | DLAB, 中国 | 8031102000 | |
| Zombie Aqua 可固定活力检测试剂盒 | BioLegend, USA | 423102 | 胺反应性荧光染料染色 |
参考文献
- Schröder,, Moser,, Huggenberger, Neuroanatomy of the Mouse. , Springer, Switzerland. 59-78 (2020).
- Sengul, G., et al. Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse. Anat Rec. 295, 837-845 (2012).
- Bab, I., et al. Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, First ed, Springer. 205(2007).
- Nayak, D., et al. Microglia development and function. Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).
- Martinez, F. O., et al. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, 453-461 (2008).
- Masuda, T., et al. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Rep. 30 (5), 1271-1281 (2020).
- Prinz, M. Microglia biology: one century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
- de Haas, A. H., et al. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
- Xuan, F. L., et al. Differences of microglia in the brain and the spinal cord. Front Cell Neurosci. 13, 504(2019).
- Paolicelli, R. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
- Li, Q., et al. Spinal IL-36γ/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway. Glia. 67 (3), 438-451 (2019).
- Prinz, M., et al. Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation. Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).
- Yip, P. K., et al. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).
- Akhmetzyanova, E. R., et al. Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury. Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).
- Mahadevan, V. Anatomy of the vertebral column. Surgery. 36 (7), 327-332 (2018).
- Krukowski, K., et al. Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits. Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).
- Cardona, A., et al. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Schmidt, V. M., et al. Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex. Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-parkin effects in pancreatic α- and β-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk. Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
