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方法文章

一种通过持续输注油酸建立的急性呼吸衰竭猪模型

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DOI：

10.3791/65963

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2024年3月8日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 3Department of Surgery, Vanderbilt University Medical Center

本文内容

摘要

持续将油酸注入麻醉成年猪的肺动脉可诱导急性呼吸衰竭，从而在急性呼吸失代偿期间实现可控的实验研究。

摘要

本方案描述了一种利用中央给药方式输注油酸在约克夏猪中建立急性呼吸窘迫模型的方法。实验前，每头猪均接受全身麻醉、气管插管和机械通气，并置入双侧 颈静脉中心血管通路导管。通过专用的肺动脉导管以0.2 mL/kg/h的速率输注油酸，持续时间为60至120分钟，以诱导呼吸窘迫。在整个实验过程中，持续监测包括心率、呼吸频率、动脉血压、中心静脉压、肺动脉压、肺毛细血管楔压、呼气末二氧化碳、气道峰压和平台压在内的多项参数。大约在第60分钟时，观察到动脉血氧分压（PaO2）和氧合血红蛋白饱和度（SpO2）下降。输注期间出现周期性的血流动力学不稳定，并伴随肺动脉压的急性升高。输注结束后，对肺实质进行的组织学分析显示存在提示实质损伤和急性病变过程的改变，证实该模型在模拟急性呼吸失代偿方面具有有效性。

引言

在转化医学研究中，猪模型的应用对于增进人类医学的理解具有重要意义1。由于猪在生理学和解剖学上与人类具有高度相似性，因此为研究复杂疾病及治疗干预措施提供了有价值的平台1。在急性呼吸衰竭的研究背景下，猪模型为探讨其病理生理机制、评估治疗策略以及检验潜在干预手段提供了独特的机会1,2,3。猪模型能够模拟人类呼吸生理的关键特征以及对各种刺激的反应，从而可在进入人体试验前对治疗方法进行全面评估1,2,3。这一研究范式有助于研究人员弥合临床前研究与临床应用之间的差距，推动新型疗法的开发并改善患者预后1。因此，建立一种高效、有效且可重复的急性呼吸衰竭猪模型，是推动呼吸系统疾病认知、指导人类医学中有效干预措施开发的关键工具1。

呼吸窘迫是一种严重的医学状况，在过去三十年中，其诊断和管理方面的进展十分有限4。目前常用的评估和分诊指标，包括主观症状、体格检查结果、SpO2和呼吸频率，往往在早期检测急性肺部疾病方面存在局限性5,6,7。这种不足不仅阻碍了高效的分诊和资源分配，也无法为慢性肺部疾病患者的病情进展及治疗反应提供有效、定量的监测。随着诸如长新冠等慢性呼吸系统疾病的出现，以及急性呼吸功能不全对医院资源造成的负担日益加重，迫切需要拓展转化研究，并推动呼吸系统疾病管理领域的创新。

将油酸直接注入猪的血液已被公认为诱导急性呼吸窘迫的一种可靠方法8。油酸是一种单不饱和脂肪酸，当其进入肺循环时，已被证实可引发显著的肺损伤并损害呼吸功能8。输注后，油酸可引起血管收缩，导致肺动脉压和肺血管阻力升高，进而造成气体交换障碍和氧合功能下降9。此外，油酸还可促进炎症通路的激活，包括促炎介质的释放和免疫细胞的募集，这些因素共同参与肺损伤和呼吸窘迫的发生发展10。上述变化最终导致严重的低氧血症、肺动脉压升高以及肺血管外水分积聚11。对肺实质组织进行的组织学评估显示，其损伤表现与人类急性呼吸窘迫难以区分9。

本文详细介绍了一种通过将油酸直接注入肺动脉以诱导急性呼吸窘迫的方法，该方法可避免出现无法治疗的严重血流动力学紊乱。所述方法预计将成为未来研究人员探索急性呼吸衰竭潜在病理生理机制以及评估潜在治疗干预措施和创新手段的重要工具。

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方案

本方案已获得范德堡大学机构动物护理和使用委员会的批准（方案编号 M1800176-00），并严格遵守美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》。实验使用了体重约为 40–45 kg 的雄性和雌性约克夏猪，动物来源于商业供应商（见材料表）。目前的做法不包括对获取的猪进行任何既往疾病的筛查。尽管承认这种做法可能潜在地干扰或掩盖预期结果，但根据供应商的说法，这种情况发生的可能性较低，该局限性已被接受。

1. 动物准备

  1. 麻醉与通气
    1. 使用氯胺酮（2.2 mg/kg）、赛拉嗪（2.2 mg/kg）和替拉唑（4.4 mg/kg）进行肌肉注射，对猪实施麻醉，并将动物置于手术台上，保持仰卧位（平躺姿势）。
    2. 通过给予吸入性麻醉剂1%异氟烷维持全身麻醉。
    3. 使用喉镜经口暴露声带并进行插管12 使用6.5 mm的气管插管（参见 材料表用无针头的注射器向导管气囊内注入3-5 mL空气。
      注意：立即进行二氧化碳（CO₂）2) 气管插管后进行二氧化碳图监测以确认导管位置正确，并测量CO₂2 通气良好，表明通气适当。
    4. 使用18 G至24 G的静脉留置针，经耳廓后侧的中央耳静脉或边缘耳静脉，为猪给予术中（按需）及安乐死用药。  用1英寸胶带固定静脉导管。
    5. 将机械通气设置为容量控制通气模式，潮气量为 8 mL/kg。
      注意：整个实验过程中持续进行麻醉监测。监测指标包括生命体征、对刺激的反应、有无运动、下颌张力松弛程度、心率变化、呼气末二氧化碳（end-tidal CO₂）水平、血氧饱和度及呼吸频率。2，以及呼吸频率的变化由独立的动物实验技术人员进行监测。根据这些评估结果调整吸入麻醉剂的剂量。给予镇痛剂布托啡诺 通过 进行团注。调整机械呼吸机的呼吸频率，以维持呼气末二氧化碳分压在目标水平。2 在整个实验过程中保持35-40 mmHg。
  2. 插管与监测
    1. 用2%氯己定消毒液彻底消毒整个前颈部，随后喷洒5%聚维酮碘溶液。
    2. 手术暴露双侧颈内静脉和颈外静脉（IJ 和 EJ） 在气管两侧紧邻处，使用23号刀片做长约7-8 cm的垂直切口，暴露颈总动脉（CA）至胸骨处13.
      注意：由于经皮超声引导下塞丁格技术存在操作困难，因此选择手术切开法进行血管通路建立14 在猪中，由于皮肤坚韧且血管较粗，采用切开暴露血管的方法更为可行。对于双侧肺动脉导管（PAC）置入，首选颈部血管，但股动脉途径也可作为选择。颈静脉的选择（内颈静脉或外颈静脉）由操作者自行决定， whichever 直径较大者可用于导管插入并进行心脏导管术。
    3. 根据需要使用Kelly组织剪和Lahey拉钩解剖带状肌及疏松组织13 （参见 材料表).
    4. 暴露后，放置两根8.5 Fr 采用塞丁格技术置入导管和两个肺动脉导管（PACs）14.
      注：右侧颈静脉 导管和肺动脉导管用于容量输注和血流动力学监测。左侧颈静脉 导管及相应的肺动脉导管用于给予油酸。通过荧光透视确认双肺动脉导管的放置位置。
    5. 采用Seldinger技术，将动脉导管置入右侧颈动脉（CA），用于实验全程的有创血压监测。
    6. 连接所有所需的监测设备。使用遥测导联监测心率（HR）。通过将压力传感器连接至颈动脉导管，监测收缩压（SBP）、舒张压（DBP）和平均动脉压（MAP）。使用独立的压力传感器/放大器系统监测平均肺动脉压（MPAP）和中心静脉压（CVP）。
      ​注意：将脉压计算为收缩压（SBP）与舒张压（DBP）之间的差值，并通过计算呼吸周期中吸气和呼气时峰值脉压的差异来计算脉压变异率（PPV）。使用设备特定的温度/容积校准进行热稀释法心输出量（CO）测定。为获得肺毛细血管楔压（PCWP），用1.5 mL空气充盈肺动脉导管（PAC）气囊，推进导管直至同时观察到 "v" 和 "a" 波形，代表受限的右向左血流，记录肺毛细血管楔压（PCWP）为该压力波形的数值 "a" 呼气末波动16.
    7. 为监测尿量，放置 Foley 导尿管（参见 材料表在猪的尿道中。对于雄性猪，需要进行经皮膀胱造瘘导尿术17.
    8. 输注晶体液（PlasmaLyte，参见 材料表以100 mL/10 min的速度输注，使肺毛细血管楔压（PCWP）达到8–12 mmHg（正常血容量状态），然后开始给予油酸。每输注100 mL后检测一次PCWP，直至达到10 mmHg。

2. 油酸输注

  1. 油酸制备
    1. 通过将16 mL油酸与84 mL生理盐水混合，配制16%油酸溶液。
      注意：操作油酸时需谨慎，确保人员佩戴防护手套、安全护目镜和口罩，以防止皮肤直接接触、吸入或眼睛暴露。需频繁振荡以防止分层，若出现分层，可添加二甲基亚砜。
    2. 将油酸溶液预充至静脉输液管路中，并连接至左侧远端端口 颈静脉肺动脉导管（参见 材料表).
  2. 油酸诱导
    1. 以0.2 mL/kg/h的速率开始油酸输注，标记为正式开始时间18,19,20(图1).
      注意：在开始油酸输注前，须确认血流动力学监测和导管位置正确。可采用透视检查或经胸超声心动图等技术以确保导管位置恰当21,22.
    2. 开始油酸处理后，立即调整呼吸机参数以模拟室内空气条件（FiO₂）2 = 21%，PEEP = 0 cm H2O
  3. 油酸输注期间的血流动力学和呼吸监测
    1. 持续监测心率（HR）、氧合血红蛋白饱和度（SpO₂）2）、呼吸频率（RR）、呼气末二氧化碳（ETCO₂）2中心静脉压（CVP）、收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、平均动脉压（MAP）、脉压变异度（PPV）和平均肺动脉压（MPAP）。
      1. 测量动脉血氧分压（PaO₂）2），pH、乳酸、碱剩余、心输出量（CO）和肺毛细血管楔压（PCWP），在前60-90分钟内每30分钟检测一次，之后每15分钟检测一次，直至处死动物图1）。同时记录气道峰压和平台压 PaO2 被测量。
        注意：连续监测变量的典型起始值分别为 95%-100%、15-20 次/分钟、25-35 mmHg、70-80 mmHg、40-50 mmHg、55-65 mmHg、1%-4% 和 10-20 mmHg。间歇性变量的起始值分别为 10 mmHg、7.4、0-2 mg/dL、-2 至 +2 mEq/L。 >5 L/min，以及8–10 mmHg。
    2. 当动脉血氧分压（PaO₂）达到预定终点值时，视为实验结束2吸入氧分数2 (P/F) 小于 <10023.
      ​注意：此时可对动物实施安乐死（见下文），并根据需要获取肺部病理学样本（图2).

3. 静脉波形分析与呼吸机管理流程

  1. 呼吸无创静脉波形分析
     - 呼吸指数（RIVA-RI）
    注意：本研究团队采用该模型研究呼吸窘迫期间静脉波形的变化。使用压电传感器在猪的上臂非侵入性地采集外周静脉波形（参见材料表）。这些低幅波形需经过信号处理和放大后方可进行分析。随后应用傅里叶变换将数据呈现在频域中，显示出约0.2 Hz的低幅波形（称为"fR0"），对应于呼吸频率。该假说认为，此波形源于吸气期间右心房/下腔静脉处负胸内压向整个静脉系统的逆行传播。通过对呼吸信号（fR0）振幅的加权贡献进行比值归一化，可在统一尺度上比较数据以提高性能，并进一步与脉率频率（f0）的振幅进行比值计算，从而得到RIVA-RI7。
    1. 将压电电极放置于肘部近端前方上肢静脉丛处。
      注意：确保压电电极设备具备记录和上传功能。先前记录原型的示例可在参考文献7,24,25,26,27中找到。
    2. 在实验过程中需要采集静脉波形时，使用LabChart软件（参见材料表）开始记录。
  2. 安乐死
    1. 确认异氟烷维持在1%。
    2. 通过静脉注射戊巴比妥钠（125 mg/kg）诱导心脏骤停（遵循机构批准的方案）。
    3. 注射后确认生命体征消失，以验证动物死亡。

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结果

早期单只猪的初步数据显示，在呼吸频率（RR）和血氧饱和度（SpO₂）等其他呼吸监测指标发生变化之前，RIVA-RI 已出现上升2)，与 PaO 的变化一致2 (图3）。PaO₂ 的下降2 是该模型旨在实现的“阳性”结果。初步数据还显示，RIVA-RI 增加且 PaO2 从30分钟时间点开始，随着疾病进展而减少（图3；红色箭头）。PaO2 是监测呼吸状况时最受关注的血流动力学参数，因为无论患者处于何种临床状态，该参数均能反映氧输送与氧消耗之间的平衡。28,29它还推动了急性呼吸窘迫的诊断及治疗措施的实施30. 这两个值的变化均明显早于SpO₂的下降2 在猪模型中，该现象延迟至第60分钟31

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讨论

本方案的关键在于，在给予油酸以诱导呼吸窘迫的过程中，需密切监测猪的血流动力学状况15。研究人员必须投入必要的时间，正确放置血流动力学监测设备，这一点至关重要。该模型的一个具体缺点是，由于呼吸系统血管的炎症和损伤，可能引发血流动力学不稳定8,10,18。尽管将油酸直接注入肺动脉所引起的不稳定性低于在颈静脉/心房交界处给药，但仍应认识到这种不稳定性的可能性。通常，在操作开始后约45-60分钟，平均肺动脉压（MPAP）会显著升高。因此，可能需要提供血流动力学支持，以实现猪的呼吸衰竭。一般情况下，当收缩压（SBP）低于60 mmHg 和/或心率（HR）低于50 bpm 时，给予50-70 mcg 去甲肾上腺素和/或10-30 mcg 肾上腺素，可纠正血流动力学恶化，从而允许实验继续进行。血流动力学不稳定的出现已被确定为该模型的主要局限性。

该模型的另一个局限...

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披露

作者（BA、CB 和 KH）已就与呼吸无创静脉波形分析相关的知识产权提交了临时专利申请。

致谢

作者谨此感谢范德堡大学医学中心 S.R. Light 实验室的 José A. Diaz 博士、Jamie Adcock 和 Mary Susan Fultz 提供的帮助与支持。本研究由美国国立卫生研究院下属国家心肺血液研究所的资助项目（BA；R01HL148244）支持。本内容由作者全权负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1% 异氟烷Primal, Boston, MA, USA26675-46-7https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/792632?gclid=Cj0KCQjw9fqnBhDSARIsAHl
cQYS_W-q6tS2s6LQw2Qn7Roa3T
GIpTLPf52351vrhgp44foEcRozPqt
YaAtvfEALw_wcB
动脉导管Merit Medical, South Jordan, UT, USAMAK401MAK Mini Access Kit 4F
血压放大器AD Instruments, Colorado Springs, CO, USAFE117https://www.adinstruments.com/products/bp-blood-pressure-amp
中心静脉导管Arrow International, Cleveland, OH, USAAK-098008.5 Fr. x 4" (10 cm) Arrow-Flex
一次性压力传感器AD Instruments, Colorado Springs, CO, USAMLT0670https://www.adinstruments.com/products/disposable-bp-transducers
Edwards Lifesciences 三阶段静脉插管Edwards Life Sciences, Irvine, CATF293702https://www.graylinemedical.com/products/edwards-lifesciences-triple-stage-venous-cannulas-venous-dual-stage-cannula-tf293702?variant=31851942576185&gad=1&
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TM4aAufGEALw_wcB
Kelly 剪刀MPM Medical Supply, Freehold, NJ 07728104-5516https://www.mpmmedicalsupply.com/products/kelly-scissors
Kendall 930 泡沫电极Covidien, Mansfield, MA, USA22935https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/patient-monitoring/electrocardiography/monitoring-ecg-electrodes/radiolucent-electrodes/kendall-930-series-radiolucent-foam-electrodes.html
盐酸氯胺酮注射液 100 mg/mL，10 mLPatterson Veterinary, Loveland, CO 8053807-894-8462https://www.pattersonvet.com/ProductItem/078948462?omni=ketamine
LabChart 8 软件AD Instruments, Colorado Springs, CO, USAN/Ahttps://www.adinstruments.com/products/labchart
Lahey 牵开器BOSS Instruments LTD, Gordonsville, VA 2294218-1210https://bossinstruments.com/product/7-3-4-lahey-thyroid-retractor-6mmx28mm/
油酸Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyO1008https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/o1008?gclid=CjwKCAjwzJmlBhBBEiwAEJy
Lu2047wRpXqF_Z2BegUyhgZJ
_WygsWfErhgrGCIyMp8PxwNH
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src=aw.ds
外周静脉留置针 Angiocath 18-24 G 1.16 英寸McKesson, Irving, TX, USA329830https://mms.mckesson.com/product/329830/Becton-Dickinson-381144
压电电极MuRata Manuractoring Co, Ltd., Nagaokakyo, Kyoto, Japan7BB-12-9https://www.murata.com/en-us/products/productdetail?partno=7BB-12-9
PlasmaLyteBaxter International, Deerfield, IL, USA2B2544Xhttps://www.ciamedical.com/baxter-2b2544x-each-solution-plasma-lyte-a-inj-ph-7-4-1000ml
肺动脉导管Edwards Life Sciences, Irvine, CA131F7Swan Ganz 7F x 110cm 
标准气管插管Teleflex, Morrisville, NC 275605-10313https://www.teleflex.com/usa/en/product-areas/anesthesia/airway-management/endotracheal-tubes/standard-tubes/index.html
SurgiVet Clearview 导尿管，8 Fr，55 cm 硅胶材质Penn Veterinary Supply, Inc, West Rendering, PN 13971SVCFC1030https://www.pennvet.com/customer/portal/catalog/home?urile=wcm:path%3APennVet+Catalog/Super+Sku+Catalog/SS0672/Surgivet+Clearview+Silicone+Foley+Catheters
Telazol（盐酸替来他明和盐酸唑拉西泮）注射液，5 mLPatterson Veterinary, Loveland, CO 8053807-801-4969https://www.pattersonvet.com/ProductItem/078014969?omni=telazol
Welch Allyn E-MacIntosh 标准喉镜片MFIMedical, San Diego, CA 92131WLA-69242https://mfimedical.com/products/welch-allyn-e-macintosh-standard-laryngoscope-blade?variant=12965771870285¤cy
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=sag_organic&utm_campaign=sag
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盐酸赛拉嗪注射液 100 mg/mL，50 mLPatterson Veterinary, Loveland, CO 8053807-894-5244https://www.pattersonvet.com/ProductItem/078945244
约克夏猪Oak Hill Genetics, Ewing, IL, USA138274雌性/雄性猪 - 约克夏/长白 81-100磅

参考文献

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猪呼吸模型油酸输注肺动脉导管机械通气颈静脉导管置入血流动力学监测肺毛细血管楔压静脉波形分析肺组织学
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