结晶与 原位 使用哈威尔结晶设施和钻石光源 VMXi 光束线在室温下收集数据

摘要

我们介绍一种利用哈韦尔研究复合体（Research Complex at Harwell）中的结晶设施进行蛋白质结晶的实验方案，以及后续的 原位 在钻石光源同步辐射装置的多功能大分子晶体学线站对晶体板中的晶体进行X射线晶体学数据收集 原位 (VMXi) 光束线。我们介绍了样品要求、结晶方案以及数据收集指南。

摘要

使用哈威尔结晶设施进行机器人蛋白质结晶的实验方案 原位 在钻石光源VMXi光束线上从结晶板中进行室温数据采集的方法被描述。该方法能够以简便的方式从多个晶体中测定高质量的室温晶体结构，为结晶实验结果提供快速反馈，并支持序列晶体学研究。室温结构在解析蛋白质结构、配体结合及动力学行为方面的价值正日益受到结构生物学领域的重视。该实验流程向全球用户开放，并提供多种访问模式。所设置的结晶实验可通过远程成像并在线查看，晶体由机器学习工具自动识别。数据采集采用基于队列的系统，对用户选定的晶体进行最多60°旋转的数据收集。特定孔或样品组内所有晶体的数据由xia2.multiplex自动合并，结果可通过网页浏览器界面直接访问。

引言

X射线晶体学仍是理解蛋白质结构与功能的关键工具，可提供蛋白质或其与底物、药物候选分子等复合物的高分辨率结构。然而，在许多情况下，获得具有理想特性的晶体——即高衍射分辨率、适合浸泡实验且无孪晶等晶体缺陷的晶型——仍然是一个显著的技术瓶颈¹。由于通常无法预测获得蛋白质晶体的合适化学条件，因此常规做法是开展涵盖数千种潜在化学混合物的结晶筛选实验，通常借助自动化或机器人系统设置筛选条件，并利用晶体保存库对结晶液滴图像进行监测，且常常通过远程方式记录和观察。

当晶体出现后，通常需要用尼龙环或卡普顿环从结晶环境中取出，然后转移到含有冷冻保护剂的液滴中（冷冻保护剂的筛选是另一个变量），再浸入液氮中进行快速冷冻。从结晶到X射线数据收集之间的这些额外步骤可能会导致结晶液滴在密封环境被破坏后发生脱水，晶体在操作过程中受到机械应力，以及冷冻保护剂对晶格造成损伤（通常表现为镶嵌度增加）等因素的影响²。此外，晶体 harvesting 耗时且劳动密集，可能导致样品间的不均一性，尤其是在 harvesting 过程中液滴表面形成“皮肤”时更为明显。VMXi 光束线使得即使晶体粘附在培养板上，也能获得可用的数据，而这些晶体在常规情况下通常会被弃用而无法用于数据收集。

绝大多数X射线晶体结构均采用上述方法在100 K条件下测定，这使得晶体的运输和操作更为简便，并使晶体在X射线束中的寿命延长数个数量级。然而，目前人们日益关注在非低温条件下测定结构，即更接近与蛋白质功能相关的生理条件^2,3,4。这种方法能够更准确地反映蛋白质的动态结构，避免氨基酸构象或环区被冻结在无功能意义的状态⁵，并可在更接近蛋白质在细胞及生物体内自然环境的条件下研究配体结合过程⁶。

一种在多功能大分子晶体学中实施的替代方法 原位 位于英国 Diamond Light Source 同步辐射装置的 (VMXi) 光束线，旨在在常温常压条件下，无需扰动晶体，直接在晶体生长环境（即结晶板内）中测量其衍射数据^7,8这使得结晶筛选和优化能够快速提供反馈，指导用户获得满足其需求的最佳晶体形态。同时，该方法还能以自动化方式获得高质量的室温晶体结构。⁹.

本方案假设用户已准备好高纯度的蛋白质样品用于结晶。我们将介绍用户在哈威尔结晶设施进行蛋白质结晶，并利用VMXi光束线收集数据的全过程（图1）。

哈威尔结晶设施

位于哈威尔研究中心（RCaH）内的哈威尔结晶设施（CF）毗邻钻石光源（Diamond Light Source）。该设施为用户提供一个高通量的自动化大分子结晶实验室，利用机器人技术进行结晶筛选、晶体优化、晶体成像和表征。通过与高度自动化的 VMXi 光束线紧密整合，室温结构解析的速度已显著加快，能够在非低温条件下实现对新型蛋白质结构、蛋白质-配体和DNA-配体复合物的表征，以及自动化的片段筛选（图1）。

结晶筛选（CF）平台是一套集成了多种仪器的系统，包括纳升级结晶机器人⁹，用于可溶性蛋白和膜蛋白的结晶；液体处理机器人，用于制备商业化结晶筛选试剂盒以及复杂的定制优化筛选体系；以及四台成像仪器（其中一台位于4 °C，三台位于20 °C，用于结晶板的成像，参见材料表）。其中一台成像仪可用于脂质立方相（LCP）玻片的成像，另一台成像仪配备多通道荧光光学系统（均位于20 °C）。

目前，该设施已被广泛的学术和工业用户广泛使用，包括膜蛋白实验室（MPL；https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html）、XChem 片段筛选平台¹⁰、MX 光束线、XFEL 中心以及罗莎琳德·富兰克林研究所（RFI）。这一成熟且经过优化的流程使得结晶实验能够应用于广泛的结构生物学项目中。本文描述了旨在用于 VMXi 进行数据收集的晶体处理流程，尽管晶体也可被收获后进行低温冷冻，或送入 XChem 流程。

用户通过 Diamond MX 提案系统（https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html）申请使用权限，工业用户可获得 Diamond 工业联络组的支持。所有用户均可携带样品或样品板前往现场，样品板可手动运输。不建议通过快递寄送样品板，因为根据我们的经验，液滴可能会偏离其原始点样位置，或因结晶储液池的影响而受损。 Alternatively，经事先安排，用户也可将蛋白样品寄送至 CF，由工作人员代为设置结晶实验。用户可通过远程方式监控实验进展：对于 CF 实验，用户可登录 Rock Maker Web；对于 VMXi 实验，则可通过 ISPyB 系统进行监控。用户可根据在 Diamond 收集到的 X 射线衍射结果，以迭代方式申请 CF 的后续使用权限。

英国钻石光源的 VMXi 光束线

光束线VMXi（下文简称"该光束线"）是一种独特且新近开发的仪器，专用于室温下高度自动化的X射线晶体学研究，重点在于从适合的结晶板中的晶体采集数据。该光束线提供微聚焦（10 × 10 µm）、粉红光束（带宽 <5 × 10^-2ΔE/E），并在16 keV时具有约2 × 10¹³ 光子/秒的高通量⁷。这种高通量光束结合快速探测器，可实现极高的样品通量，并能采集尺寸大于10 µm的样品的数据。

结晶板通过存储在样品存储系统中进入光束线，并根据用户提供的日程安排进行成像，同时通过ISPyB¹¹界面SynchWeb¹²对板进行注册。通常建议用户选择斐波那契序列的时间点进行成像（从板进入系统开始计时：0、12、24、36、60……7,320小时）。当某块板完成成像后，用户将收到电子邮件通知。用户可根据需求选择可见光或紫外光成像。样品存储系统拍摄的图像由机器学习算法进行分析，该算法可自动识别并定义类似晶体的物体的兴趣点，并将这些兴趣点注册，供用户添加至数据采集队列。用户也可手动点击可见光图像以注册兴趣点，或通过点击并拖拽选定区域，由光栅扫描方式进行分析。这些兴趣点将与自动识别的兴趣点一同提供给用户，供其添加至队列中。

当所有样品均具备合适的数据采集参数后，该样品板将进入队列。当样品板排到队列首位时，会自动被送入光束线。结晶板由机器人手臂从晶体储存库自动装载至光束线，随后通过图像匹配，根据用户自定义的指令，对每个选定的晶体采集最多60°旋转范围的晶体学数据集。样品板中的所有液滴均可用于光束线上的这些实验。系统会自动合并来自多个晶体的数据，生成同晶型且经过最优合并的数据集^7,9。当所有队列中的数据集采集完成后，用户将收到一封电子邮件，其中包含一个链接，可点击查看ISPyB系统中的数据集，方式与其他Diamond MX光束线相同¹¹。用户也可访问光束线网页（https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html）获取更多信息。 

方案

1. 在内部生成晶体 原位 使用哈威尔结晶设施进行板上结晶

注意：晶体学设施（CF）的访问权限可通过多种不同途径获得，具体取决于项目应用类型和用户类型（学术或工业）。XChem 和 MPL 项目通过用户管理系统（UAS）拥有独立的提案申请系统，可通过标准访问途径（包括 iNEXT Discovery 和 EUbOPEN）或 BAG 访问方式提交申请。以下方案专为 VMXi 用户制定。

1. 提案提交与访问准备
   1. 向BAG提案申请提供项目信息，或将项目添加至正在进行的BAG提案中。通常会有一位BAG协调员负责组织相关文件工作。或者，可提交快速访问提案以申请使用光束线。
   2. 确保样本在通过快递或亲自送达现场之前，已根据某项提案在UAS上完成注册并经过安全验证。
   3. 确保用户已注册（使用 FedID 和密码）。
   4. 确保用户已由BAG协调员在UAS系统中作为附属人员添加至MX项目提案。
   5. 填写光束线结晶样品详细信息表，并将表格发送至 VMXi@diamond.ac.uk。
   6. 与线站工作人员沟通实验需求及线站使用时间安排。
   7. 若需寄送蛋白质样品，仅可事先协商后寄送。详情请参见第1.2节。
   8. 如果用户需进入站点在结晶设施（CF）中设置结晶板，请先与设施工作人员确认仪器使用时段的可用性，并遵循第1.2.1节的操作步骤。
   9. 如果用户将板带入现场，需确保将样品分配至正确类型的板中，并将结晶液滴放置在正确的位置且数量准确。请遵循第1.2.2节。该光束线仅接受特定 在 原位结晶板（Greiner CrystalQuickX） 以及MiTeGen In Situ-1）；确保液滴体积不超过200 nL。
2. 在CF中进行的结晶实验
   ​注意：该平台提供多种高通量大分子结晶方法，包括蒸汽扩散法、油下批量结晶法以及LCP（脂质立方相）结晶法。建议起始使用70–100 µL纯化蛋白，针对可溶性蛋白采用蒸汽扩散法，在20 °C条件下使用三种商业筛选试剂盒进行实验，每孔加入100 nL蛋白溶液与100 nL结晶储液。平台内提供多种商用结晶筛选试剂盒。环境控制方面可实现湿度与温度调控，常用温度为4 °C和20 °C。访问结晶平台（CF）的用户将接受标准化培训，并获得操作结晶仪器的技术支持，实验过程中需采用本文所述的设置参数。
   1. 将样本运送至CF进行设置
      注意：在样品到达现场之前，必须已在UAS系统内的某项提案中完成蛋白质样品的验证。一旦蛋白质样品到达现场，工作人员将根据此前与用户沟通的指示设置结晶实验。确认信息将通过电子邮件发送，包含实验用结晶板的条形码信息。用户需将这些结晶板作为容器添加至相应的提案中。完成此操作后，结晶板可存放在结晶设施或光束线的自动成像仪中。在光束线的操作将通过ISPyB系统进行交互。
      1. 以每份数量为25 µL的倍数，提供用于结晶的蛋白质样品溶液。明确标记含有蛋白质样品的试管。
      2. 如有需要，提供蛋白缓冲液、配体溶液或储液。
      3. 告知设施工作人员应使用哪些筛选条件和滴定比例。
   2. 结晶板设置
      注意：我们需要 Greiner CrystalQuickX 中的结晶液滴 和 MiTeGen In Situ-1 使平板位于特定位置；在其他地方设置的平板应使用以下蚊子¹³ 此处描述的设置
      1. 调整 MiTeGen In Situ-1 的板型定义时，打开 Mosquito SPT 软件，点击标准的 MiTeGen In Situ-1 点击进入平板定义页面 设置 | 96孔板 | MiTeGen In Situ-1 （96 × 2滴）图2A). 点击 编辑 按钮并修改其数值 亚孔2位置：X轴偏移量 至 - 1.2 和 Y轴偏移量 到 1.8 以及用于 亚孔3位置：X偏移量 到 1.3 和 Y轴偏移 到 1.8 (图2B，C）.
      2. 调整 Greiner CrystalQuickX 的板型定义时，打开 Mosquito SPT 软件并点击标准 Greiner CrystalQuickX 点击进入平板定义页面 设置 | 96孔板 | Greiner CrystalQuickX (图 2D). 单击 编辑 按钮并修改其数值 亚孔1位置：X偏移量 到 - 1.95 和 Y轴偏移 到 1.45 以及用于 亚孔2位置：X偏移 到 1.95 和 Y轴偏移 到 1.45 (图2E，F).

2. 使用 Diamond Light Source 的光束线

注意：用户与光束线的所有交互均通过 ISPyB¹¹ 界面远程完成。无需在光束线现场亲自操作，数据采集采用基于队列的系统，而非按特定时间安排。用户将拥有与其访问 Diamond Light Source 相关联的研究课题编号。在光束线上，每块结晶板均被分配一个唯一的访问编号，并在 ISPyB¹¹ 中定义为“容器”，类似于在 100 K 下存放样品的样品托盘。无法通过 SynchWeb 界面创建优化筛选条件，因此相关信息通常需添加至备注栏（见步骤 2.1.4）。注册结晶板的人员需确认电子邮件地址，因为结晶板负责人将收到有关成像以及结晶板完成状态的通知邮件。

1. 培养皿标记
   1. 使用适当的 Diamond FedID 登录 ISPyB 并选择 提案. 搜索 研究兴趣提案 通过滚动或在搜索栏中输入提案编号进行选择 运输 从下拉菜单中 项目编号 (图3A），这将打开 运输 该提案中包含货件的窗口。点击 +添加 运输 右上角（图3B）以打开 添加新发货单 窗口，给予货件一个 名称，点击 自动化/成像仪，然后单击 添加运输按钮 左下角（图3C).
   2. 在发货窗口（图 3D），点击 +添加容器，随后将显示 添加容器 页面浏览量（图3E）。在 容器类型 下拉菜单中选择相应的板类型之一。页面将根据所选的容器类型进行更新。输入一个 条形码 和 容器名称 根据光束线工作人员针对实验板的电子邮件指示进行操作。请注意，该操作区分大小写。
   3. 选择 VMXi 20 °C 成像仪 从 请求的成像仪 下拉菜单，该 斐波那契成像序列 来自 成像时间表 下拉菜单，结晶筛选板来自 结晶筛选 下拉菜单，以及 用户名 从 所有者 下拉菜单，单击 查看 按钮，并输入正确的联系人电子邮件地址 电子邮件 盒图3F).
   4. 在平板的进一步详细信息中输入 评论 盒中。选择相关的样品 蛋白质 下拉菜单，并在实验提案中使用在 UAS 中注册且经 Diamond 批准的缩写。在以下位置输入相同的名称 样本名称 盒子；其余盒子留空。
   5. 点击 +培养板 点击图标，将样本复制到整个培养板，使整个容器中充满绿色方块。点击 +添加容器 在页面底部注册该板。请同步辐射线站工作人员将板转移至相应的成像仪，板将在成像仪中保存并完成成像。当容器存入成像仪后，系统将生成一次访问记录，用户将收到一封电子邮件，其中包含指向该板及其图像的链接。
2. 查看成像结果
   1. 导航至 的 研究兴趣提案 （步骤 2.1.1），选择 容器 从提案编号下方的下拉菜单中，查看该提案可用的容器列表，并选择筛选条件 培养皿 如果存在其他类型的样品台，可进一步缩小搜索范围，请勾选 我的容器 仅显示与当前登录用户 ID 相关的最相关容器。通过将光标移至相应行并单击鼠标左键，选择合适的容器。
   2. 选择容器后，将显示一个新界面，展示该孔板的概览（图4A)。单击显示屏左侧板图中的液滴，以查看该液滴的最新图像。使用方向键在不同液滴间导航，或使用鼠标/光标选择特定液滴。
   3. 要查看液滴的历史图像，请点击 H 点击按钮，等待弹出窗口中的图像库覆盖当前液滴图像。将光标悬停在各个缩略图上，以更新主液滴图像。
   4. 按压以评分图像，指示每个液滴的状态 0 - 9 按钮。要查看各个类别，请打开下拉菜单 评分 位于液滴图像的左上角。在每张液滴图像中寻找蓝色十字，这些蓝色十字是算法（CHiMP）经过训练用于识别而产生的结果 "晶体" 在图像中。
   5. 单击名为第三个图标按钮 测量 在液滴图像的右上角点击以打开测量工具。使用该工具时，点击并拖动以 线，尺子将延伸并以 µm 为单位显示距离。
   6. 要申请额外的成像时段，请点击以下任意一项 可见 或 紫外光 从旁边的下拉框中 操作 向下滚动至页面底部，然后点击 请求板成像 按钮。
3. 晶体筛选/CHiMP
   1. 要手动添加数据采集点，请按下 +标记点 按钮。将光标悬停在目标兴趣点上并点击，等待红色十字标记出现。
      注意：每次滴加最多可生成 100 个对象。
   2. 当所有点标记完成后，单击 +完成 按钮。请记得同时点击 +完成 在尝试测量对象之前，请先点击按钮。要通过网格扫描添加数据采集区域，请点击 +标记区域 按钮。单击 左上角点 并向下向右拖动以创建将在光束线上进行光栅扫描的区域。与点设置相同，单击 +完成 当所有目标区域创建完毕后，点击按钮。
      注意：创建一个较大的区域比创建多个较小的区域更佳。
   3. 观察液滴图像上已有的蓝色十字标记，这些标记是自动识别晶体对象的算法（CHiMP）的分析结果。要查看 CHiMP 对结晶液滴的评估结果，请点击复选框 显示自动评分 然后更改下拉菜单以 类别通常，此处最有用的设置是 晶体 选项 (图4B).
      注意：此为新功能，不能保证找到所有晶体，且可能检测到非晶体的其他物体。
   4. 当所有点和区域均已在相应的液滴中标记后，单击 准备数据采集 页面底部的按钮。
4. 准备用于数据采集的样品
   1. 观察上一步中选定或自动定位的点或区域所对应的样本列表，图 4C）。通过按下 + 按钮，或通过点击添加所有显示的样本 将当前页面添加到队列 按钮。
   2. 可使用滤镜仅显示 点，区域，自动点， 或 手动 点。若要仅显示尚未拍摄的样本（即未暴露于X射线的样本），请点击 无数据 和 未完成 滤镜按钮上方的选项
   3. 通过单击相应的行来选择单个样品，并更新屏幕右侧的图像以显示正确的液滴和单个点。如果列表中样品较多，请增加 样本数量 通过选择下拉菜单按每页显示 10 默认情况下，最多 100 显示样本的最大数量。
   4. 当所有点和区域均已添加到队列后，确保将所有实验数据采集参数与每个实验相关联。
      1. 使用滤光片 点，区域，手动，以及 自动. 点击 点 过滤并点击 全选 在过滤按钮下方的复选框，可同时将参数应用于当前可见的所有样本 待测样本 列表
      2. 从屏幕右侧液滴照片下方的下拉菜单中选择实验参数图 4D）。对于 区域，选择该选项 网格扫描 DMM，10 微米步长，100% 透射率. 对于所有其他情况 点 实验时，请根据需要从下拉菜单中选择其他选项。
      3. 对于振荡数据采集，请点击 Omega Scan DMM 60度 5%透射率 从单个样品中收集最大量数据的选项。对于非常小的晶体或对辐射敏感的样品，应采用小角度旋转，并根据以往对特定晶型的经验调整透射率。当所有样品均正确设置实验参数后，点击 队列容器 页面底部的按钮。
   5. 当样品板排到队列首位时，将被送至光束线进行数据采集，完成后会再次返回光束线内的样品存储区。当某块样品板的数据采集结束后，请留意查收包含数据访问链接的电子邮件。
5. 创建样本组
   注意：可以创建样本组，以将多个液滴或培养板中的相似样本进行归类。这些样本组内的所有数据集将使用 xia2.multiplex 进行处理。¹⁴ 在通过DIALS处理后，该流程可适用于收集大量非常小的数据楔块，并可能有助于提高配体结合实验中的信噪比。
   1. 选择 样本组管理 从下拉菜单中 项目编号. 查看是否已有其他用户创建的组列表。要创建新组，请单击 +创建样本组 按钮。单击一个 运输 从下拉菜单中 创建样本组 页面以查看样本查看器（图5A). 从列表中点击包含相关样本的容器。
   2. 当点击一个容器后，查找显示平板概览的图形。
   3. 通过点击单个液滴来逐个点击液滴图5B）或通过点击相应的行字母或列数字来选择整行或整列的孔。当与某个分组相关联的所有孔均已选中后，在分组名称栏中输入该分组的名称 样本组名称 盒，并单击 保存样本组 按钮。单击 查看样本组 单击此页面上的按钮，返回与该提案相关联的已生成样本组列表图5C).
6. 编辑样本组
   1. 从组别列表中点击一个样本组 样本组管理 页
   2. 点击 +编辑样本组 位于组信息下方容器旁边的按钮图5C).
   3. 观察平板概览中已与样本组关联的液滴高亮显示。
   4. 通过点击滴加、孔或列，向样本组添加更多液滴。
      注意：无法从样本组中移除液滴。
   5. 添加额外液滴后，编辑 样本组名称 然后保存，或直接点击保存 保存样本组 按钮
7. 可视化与分析样本组的输出结果
   1. 点击样本组列表中的单个组，以显示与该组相关联的容器或多个容器的孔板概览。该组中包含的液滴将在显示中被高亮标出。图5D).
   2. 查找包含最近三次多重检测任务的列表（如果本组已收集数据）。
   3. 单击多重检测运行的行以更新下方的处理结果。
   4. 观察 快速链接 按钮，显示与该组关联的数据集数量。单击此按钮以打开一个新 数据收集 显示各个数据集集合的页面

3. 访问自动数据处理

注意：数据采集完成后，将通过多个自动数据处理流程进行处理。Diamond 同步辐射光源的 MX 光束线普遍采用四种标准流程，这些流程同样适用于本光束线采集的数据，分别为 'fast_dp'、'xia2 dials'、'xia2 3dii' 和 'autoPROC'¹⁵。'fast_dp' 可快速完成数据约减，用于初步评估数据质量。其余三种流程需要更长的计算时间，并运行多种不同的数据约减软件包以供比较，因此其输出结果通常优于 'fast_dp' 的结果。在本光束线上采集的数据集还将通过自动多晶体合并软件 'xia2.multiplex'¹⁴ 进行处理，该软件可将指定组内的所有数据集进行合并。需要注意的是，目前网格扫描数据尚无法自动处理，但可通过手动方式使用 'xia2.ssx' 流程进行处理。自动处理流程的结果可通过以下协议在 ISPyB¹¹ 系统中查询。

1. 查找数据集
   1. 按照上述方法登录 ISPyB，然后选择 提案（Proposals）。
   2. 通过滚动列表或在搜索栏中输入提案编号，查找感兴趣的提案。
   3. 从屏幕上显示的列表中点击目标实验访问记录，以进入该次访问的数据采集窗口。
   4. 应用任何所需的筛选条件。
      注意：一个常用的筛选条件是“自动积分（Auto Integrated）”，该筛选仅显示已成功通过一个或多个数据处理流程的数据集。网格扫描数据将不会被包含在内，因为目前 ISPyB 不会自动处理此类数据。
   5. 向下滚动页面以找到感兴趣的数据集。
      注意：每个数据集将显示样品编号、所用实验参数、衍射图像查看器、晶体图像查看器以及每帧图像的分析图，以便快速评估数据质量。
2. 访问自动处理结果
   1. 点击特定实验数据摘要下方的自动处理（Auto Processing）标签，以查看自动数据约简的结果（图6A）。
   2. 点击对应不同处理流程的各个标签页，查看每个输出的详细摘要。
      注意：如果已定义样品组，则会出现两个对应于多重处理任务的标签页。其中一个表示到目前为止该组内所有数据集的合并结果，另一个则表示仅在该液滴内数据集的合并结果。
   3. 点击日志与文件（Logs & Files）按钮，下载处理成功后生成的 .mtz 文件及相关日志文件。点击自动处理部分下方的下游处理（Downstream Processing）标签，查看 DIMPLE 的输出结果。
      注意：仅当样品提交时提供了 PDB 文件，DIMPLE 才会运行。
   4. 点击日志与文件（Logs & Files）按钮，下载 DIMPLE 生成的任何结果文件。
3. 访问组内多重处理结果，首先点击屏幕顶部显示提案编号的下拉菜单，然后选择样品组管理（Sample Group Management）。在正确的容器中，点击对应目标组的行。向下滚动，找到以微孔板示意图形式展示的该组对应的多重输出列表。
   1. 从列表中点击目标多重输出，然后点击xxx 数据集按钮，其中xxx为已合并的数据集数量（图6B）。
      注意：这将打开数据采集界面，但仅显示来自所选多重处理任务的数据集。
   2. 点击顶部实验的自动处理（Auto Processing）标签。
   3. 点击对应正确合并数据集数量的多重处理（Multiplex Processing）标签。
   4. 点击日志与文件（Logs & Files）按钮，下载 .mtz 文件及相应的日志文件（与步骤 3.2.3 相同）。
4. 访问网格扫描结果
   1. 导航至目标实验访问的数据采集界面。网格扫描数据结果将与任何旋转采集的数据一同显示。
      注意：此处将无自动处理结果。
   2. 晶体液滴图像上将叠加显示一个带有热图的网格，用以表示衍射信号的存在情况。点击网格中的某个方格，可查看该位置的衍射图像。点击晶体孔图像顶部的下拉菜单，可更改热图所表示的内容。默认为衍射的总强度，也可更改为斑点总数、估计分辨率或无冰帧数。

4. 数据重处理

注意：可使用 ISPyB¹¹ 界面通过与自动运行时相同的处理流程对选定的数据集进行重新处理，用户可自定义修改参数设置。可应用分辨率截断值；若已知晶体的对称性或晶胞参数，则也可指定这些参数，以确保处理流程在正确的设定下运行。还可利用现有的多晶体处理流程，对特定数据集中选定的图像范围进行合并。当系统性辐射损伤导致衍射图像的后半部分质量较差时，此方法可能具有优势。用户也可选择按照上述协议下载其数据集，并在本地运行所需的重新处理软件，相关教程在其他地方可免费获取（https://dials.github.io/documentation/tutorials/index.html# ）。

1. 对多个独立数据集进行重新处理
   1. 登录 ISPyB 并导航至感兴趣的数据集（步骤 3.1）。
   2. 点击一个 数据集，然后点击 数据集标题栏 中的 齿轮 图标（图6），以打开重新处理窗口。
   3. 配置所需的任何设置，并选择将包含在重新处理中的帧。
      注意：图像范围可通过在标签框中输入范围，或在逐帧分析图中点击并拖动所需区域来定义（图7A）。
   4. 可选：若要添加另一个数据集进行独立重新处理，点击其 齿轮 图标，该数据集将出现在第一个数据集下方的重新处理窗口中。勾选 独立处理 复选框。
   5. 点击 积分 按钮。
2. 对多晶体数据进行重新处理
   1. 从任意数据集打开重新处理窗口。
   2. 点击 多晶体 按钮以打开新界面。
   3. 向下滚动，查找本次实验访问期间各次实验的逐帧分析图。
   4. 从下拉菜单中选择一个 处理流程。
   5. 可选：定义任何 分辨率限制 或 已知晶胞参数。
   6. 点击并拖动以定义将包含在多晶体重新处理中的图像范围（图7）。
      注意：此操作应在多个不同的图上进行，以便合并来自多个不同晶体的数据集。
   7. 点击 积分 按钮（图7B）。
3. 访问重新处理后的数据
   1. 导航至特定实验访问的 数据采集 页面（步骤 3.1.1–3.1.3）。
   2. 点击屏幕顶部的 重新处理 按钮。
   3. 向下滚动以定位到 所需任务。
   4. 点击右侧列中的 文件路径，以打开重新处理数据的 数据采集 界面。
   5. 打开 自动处理 标签页，并按之前所述方式下载数据（步骤 3.2）。
      注意：所有重新处理的任务均可通过处理流程名称旁的 循环箭头 符号进行识别。

结果

结晶设施和 VMXi 光束线已被用于多种类型的项目和应用场景。以下是一些示例，用以说明用户可能希望开展的研究方向。

案例研究 1：标准数据采集

该光束线能够在结晶板中仅使用少量晶体快速测定室温下的晶体结构。所需晶体的最小数量取决于空间群和晶体取向，通常为1至4颗，但通过合并数十颗晶体的数据可获得更高质量的数据。最近的一个例子是光束线标准样品之一——甜蛋白（thaumatin）。如图8A所示，多个晶体按照方案第2.3节所述手动标记用于数据采集。这些晶体按照方案第2.4节所述添加至采集队列，并从下拉列表中选择实验参数。应用实验参数后，将整块结晶板排队进行数据采集。数据集的采集、自动缩放和合并均按照方案第3节所述，通过xia2.multiplex流程完成。SynchWeb的示例输出结果如图8A中部所示。五个合并后的数据集获得了分辨率为1.66 Å的数据。对于每个孔中约五颗晶体的标准数据采集，数据集可在2.5分钟内完成采集。

案例研究 2：配体结合——使用 Mac1 蛋白的片段实验

利用该光束线可直接在室温下获得蛋白质-配体复合物的结构。配体可通过手动或声波液滴注入方式加入结晶板上的液滴中，并在适当的孵育时间后进行数据采集。在本文描述的示例中，一系列片段化合物被分配至含有SARS-CoV-2蛋白nsp3第一个宏结构域（Mac-1）晶体的结晶板孔中。根据实验方案步骤2.5所述，将含有相同片段的两个孔指定为一组。按照实验方案步骤2.3和2.4所述，标记了42颗晶体用于数据收集，并使用标准参数（每颗晶体旋转60°，步长0.1°，曝光时间0.00178秒，透射率5%，能量16 keV）采集数据集（图8B）。来自这两个孔的数据集通过xia2.dials流程自动处理，随后启动xia2.multiplex流程，自动合并其中22个数据集。接着对这些流程的输出结果运行DIMPLE程序，获得的电子密度图清晰显示了结合片段的存在证据。片段模型被构建到未被占据的电子密度中，并进一步优化（图8B右侧）。通过这一系列步骤可轻松确定室温下配体结合的结构，为基于结构的药物设计过程提供宝贵的信息与反馈。在此涉及多个孔中42颗晶体的数据收集中，所有数据集在10分钟内完成采集。

案例研究3：低对称性空间群及择优取向下的结构解析 通过细胞色素c型气体结合蛋白的结晶实验，获得了一堆呈片状形貌的多晶聚集体（图8C）。通过选择该聚集体边缘多个仅有一个晶体处于X射线束中的位置，尽管其属于单斜晶系（C2）空间群，仍可通过合并来自四个晶体的数据楔形区域，获得分辨率达到1.75 Å的高质量数据集。这使得项目得以快速推进，无需进一步优化结晶条件。该结果此前已有报道⁹。在此实验中，对一个孔内四个晶体的数据采集在2分钟内完成。

案例研究 4：利用序列晶体学从平板中的微晶获取信息及室温结构

当液滴中出现微晶，或用户希望在同步辐射或XFEL光源上进行序列晶体学实验之前，以批量方式优化微结晶方案时，使用最少的样品快速获得不同实验条件下晶体的衍射特性和晶胞参数信息非常有帮助。在此应用案例中，将批量培养的溶菌酶微晶用移液法转移至结晶板中（每滴体积为200 nL），并通过步长为10 µm的网格扫描对八个液滴进行数据采集（图9）。共获得25,906张静态图像，采用序列晶体学软件处理，最终得到一个数据集，其中9,891张衍射图谱被指标化并合并，获得分辨率为2.0 Å的数据集，该数据集与已发表的室温结构（使用PDB 8A9D，R_work = 19.6%，R_free = 23.6%）拟合良好（表1）。这使得能够详细分析晶胞分布，并确定微晶在室温下的结构，从而为包括时间分辨研究在内的复杂序列晶体学实验提供支持。整个实验所需的微晶悬液总体积仅为1.6 µL。通过网格扫描对八个孔中的微晶进行数据采集，整个数据收集过程在40分钟内完成。

图1：整合了结晶筛选、结晶设施中的优化、在VMXi无需取样即可进行室温自动化数据采集与处理、XChem片段筛选以及其他MX光束线数据采集的“蛋白质到结构”流程示意图。 用户可通过提供样品或将板送至VMXi光束线来启动该流程。缩写：Versatile Macromolecular Crystallography in situ。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 2：用于设置结晶板的 Mosquito SPT Labtech 界面。（A）（1）MiTeGen In Situ-1 设置界面。通过选择（2）96孔板 类型并点击（3）MiTeGen 2滴标准板 来选定 MiTeGen 2滴标准板。为更改液滴1和液滴2的定义参数（VMXi 实验所必需），请点击（4）编辑 图标。这将打开一个新窗口（B），其中需按图示修改（5）X 和 Y 偏移量。分别选择（B）子孔2 和（C）子孔3，并相应地更改数值。（D）CrystalQuickX 设置界面。通过进入 96孔板 类型并选择 MiTeGen 2滴标准板，来选定 CrystalQuickX 2滴标准板。为更改液滴1和液滴2的定义参数（VMXi 实验所必需），请如同上述操作点击 编辑 图标。这将打开一个新窗口，在其中（E,F）需按图示修改 X 和 Y 偏移量。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：SynchWeb 界面展示如何创建 VMXi 运输批次、注册板卡以及核对联系人信息。 图中显示了将信息上传至 SynchWeb 界面各个阶段的截图，包括（A）下拉菜单，（B,C）注册新的运输批次，（D）注册新的容器，（E）输入板卡信息，（F）核对联系人信息，以及（G）在某一项目提案内已注册容器的列表。请点击此处查看此图的放大版本。

图4：使用SynchWeb选择和准备用于数据收集的样品。 一系列截图展示了通过SynchWeb界面准备样品进行数据收集的各个阶段。（A）从液滴概览中选择感兴趣的点和区域。该面板的下部为此液滴的一系列按时间顺序排列的照片。（B）一个微孔板的CHiMP输出示例，突出显示“晶体”类别的结果。（C）从选定的点和区域列表中将样品添加到队列中，以及（D）从光束线预设的实验设置下拉列表中为已排队的样品应用数据收集参数。注意未设置实验参数的样品（红色）与已正确应用参数的样品（顶部和底部）之间的区别。该面板底部为Queue Container按钮，用于将微孔板排队以在光束线上进行数据收集。请点击此处查看此图的放大版本。

图 5：在 SynchWeb 中创建样本组。 一系列截图展示了创建样本组的各个阶段。（A）从相关货件中选择包含样本的板；（B）选择板内的液滴，可选择单个液滴，也可按行和/或列进行选择。（C）已创建的样本组列表。（D）列出最近三次多重处理任务的输出结果，可选择以查看处理流程中的统计信息。请点击此处查看该图的放大版本。

图6：数据处理与数据约简。（A）ISPyB¹¹中已处理数据集的截图。用于访问再处理功能的按钮已高亮显示。左上角显示样品编号和实验参数，中间为衍射图像查看器。点击该图像将打开一个交互式窗口以查看不同图像。右侧为晶体图像查看器，点击该图像也将打开一个交互式窗口，用于比较光束线和Formulatrix存储的图像。最右侧显示每幅图像的分析图，点击该图像将打开此输出结果的放大版本。点击自动处理选项卡可显示自动处理结果，并便于比较不同处理流程的结果。点击各个选项卡可在不同处理流程之间切换，并查看所选流程的详细输出。用于数据下载的日志与文件按钮已高亮显示。点击下游处理选项卡将展开并显示适当情况下通过数据约简后流程运行的任何数据集的结果。（B）来自样品组管理界面的截图。用户定义的组名称位于顶部，下方可见所包含孔位的可视化描述。绿色孔位表示该液滴中测量的所有晶体将被纳入该组。可查看针对该组执行的不同多重化任务的摘要，其下方为多重化处理的详细输出结果。用于查看所包含实验的数据集按钮已高亮显示。请点击此处查看该图的放大版本。

图7：数据重新处理窗口。 （A）单晶数据集和（B）多晶数据集。图中显示了两个单晶数据集，其中已选择特定的数据区域。勾选单独处理复选框后，点击积分按钮即可对所选衍射图像进行单独处理。点击多晶按钮将打开各个数据集的显示界面。如需对来自多个数据集的衍射图像进行重新处理，可如图所示选择图像区域，并通过点击高亮显示的积分按钮启动重新处理过程。请点击此处查看该图的放大版本。

图8：VMXi 流程的代表性结果。（A）甜味蛋白（thaumatin）在结晶液滴中的标记晶体（左图）、数据处理结果（中图）以及电子密度图（右图）。（B）对多个晶体进行数据收集，以确定片段与 SARS-CoV-2 宏结构域（Macro domain）的结合情况。在 EU-OPENSCREEN 片段筛选中发现的一个片段存在条件下，使用标准实验设置对多个晶体进行了数据集采集。本图节选自 SynchWeb，展示了这些数据采集的示例。该片段被构建到相应的电子密度中，并进一步精修，最右侧图展示了该结果。（C）来自一次较难结晶命中结果的堆叠单斜晶系晶体的标记图。绿色十字和红色数字标示了使用 10 µm 光束和 60° 旋转角度进行数据测量的位置。最终获得的四个数据楔被合并，生成了分辨率为 1.75 Å 的数据集。右侧展示了血红素（Heme）基团周围的电子密度图。请点击此处查看该图的放大版本。

图9：在结晶板中进行的序列晶体学分析。（A）结晶液滴的光学图像，白色框表示感兴趣区域。（B）网格扫描点的定义。（C）显示衍射情况的热图。（D）由超过9,000张静态衍射图组成的序列晶体学数据集生成的电子密度图。请点击此处查看该图的放大版本。

分辨率 (Å)	完整度 (%)	多重性	I/σ(I)	Rsplit	CC1/2	唯一观测值
总体	100	95.5	20.8	0.063	0.998	8422
低分辨率 (55.55 - 5.43)	100	147.1	81.7	0.028	0.999	488
高分辨率 (2.03 - 2.00)	100	75.3	1.2	1.092	0.410	411

表1：VMXi RT序列数据集的数据统计。缩写说明：I = 标度观测值的平均强度；R_split = 测量强度差异性的度量；CC 1/2 = 数据集两个随机半集之间的相关系数。

讨论

我们已描述了从蛋白质样品送至中心实验室（CF）到用户下载最终数据以用于后续应用的完整流程。关键步骤包括制备高质量的蛋白质样品，以及采用商业化的稀疏矩阵筛选试剂盒或基于已有条件的优化筛选试剂盒进行适当的晶体筛选。该过程可在中心实验室内完成，用户也可在各自实验室中进行结晶实验，并将合适的结晶板送至同步辐射光束线。对于某些样品，特别是存在辐射损伤风险的样品，确定合适的数据收集参数可能至关重要。在大多数情况下，自动化数据处理已足以回答科学问题，但用户仍可使用光束线工具对数据重新处理，例如当空间群不明确，或仅使用收集数据的初始部分以最小化辐射损伤效应时。

如果初始结晶实验未能获得合适的晶体，可尝试改变蛋白质浓度、纯度或结晶筛选条件，也可采用晶体接种方法。若晶体在光束线上无法衍射至可用分辨率，可使用未衰减的光束进行网格扫描，以评估晶体的本征衍射极限和晶胞参数，从而指导后续优化工作。对于在板内过小而无法进行数据收集的晶体（例如，<10 µm），可考虑用于串行晶体学或纳米聚焦实验（例如，在Diamond同步辐射光源的VMXm光束线）。利用VMXi数据通过分子置换法求解结构通常较为直接，特别是随着AlphaFold¹⁶的出现，能够提供高效的搜索模型。若分子置换不成功，可将晶体从板中取出并进行冷冻处理，以开展常规的单波长反常散射、多波长反常散射或长波长相位实验。

该方法的优势包括能够直接从结晶板中快速获取高质量的数据集和反馈，而无需将晶体从其生长环境中取出。结构生物学领域所谓的“室温复兴”高度重视在非冷冻条件下获得的结构，以探索更具生理相关性的蛋白质动态²。通常，与优化后的冷冻晶体相比，分辨率略低，但这仅在已建立合适的冷冻条件，且晶体对机械操作及结晶液滴的开启具有足够稳定性时才成立³。该技术流程非常适用于一个即将广泛应用的场景：在药物发现中，对蛋白质-配体复合物或片段化合物在室温下进行大规模筛选。配体或片段分子可通过共结晶方式引入，也可在室温数据收集前通过移液器或声波液滴喷射技术添加。另一个应用是高效地对数百甚至数千个晶体快速采集数据，然后利用 DIALS¹⁷ multiplex¹⁴ 软件提取等形态簇，这些簇可能代表不同的生物实体，或用于确定经不同处理或暴露于不同配体或信号的晶体群体之间的统计学显著差异。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
配方器	Formulatrix	按需提供	液体处理机器人
Formulatrix 成像仪	Formulatrix	按需提供	结晶板成像仪
Greiner CrystalQuick X	Greiner	Z617644	结晶板
Gryphon	Art Robbins Instruments	620-1000-10	结晶机器人
MiTeGen Insitu-1	Mitegen	InSitu-01CL-40	结晶板
Mosquito LCP	(SPT Labtech)	按需提供	结晶机器人
Rock Imager & Maker	Formulatrix	按需提供	成像仪软件 [1] https://formulatrix.com/protein-crystallization-systems/rock-maker-crystallization-software/
Scorpion	Art Robbins Instruments	640-1000-10	液体处理机器人 https://www.artrobbins.com/scorpion