本方案提供了一个实验框架，用于记录细胞骨架对小鼠卵母细胞系统中细胞核形态以及内部无膜细胞器的物理影响。该框架可适用于其他细胞类型和研究背景。
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本文内容
摘要
摘要
理解女性不孕症成因的一个主要挑战在于阐明调控女性生殖细胞（称为卵母细胞）发育的机制。卵母细胞的发育以细胞生长和随后的分裂为标志，这两个关键阶段使卵母细胞为与精子融合并启动胚胎发生做好准备。在生长过程中，卵母细胞会重组其细胞质，将细胞核定位在细胞中央，这一事件可预测小鼠和人类卵母细胞的成功发育，因而也反映了其胚胎发生潜能。在小鼠卵母细胞中，这种细胞质重组已被证明由细胞骨架驱动，其活动产生机械力，从而搅动、移动并穿透细胞核。因此，这种从细胞质向核质的力传递调节了核内被称为生物分子凝聚体的RNA加工细胞器的动力学行为。本实验方案提供了一个高时间分辨率的实验框架，用于记录小鼠卵母细胞中细胞骨架在不同空间尺度上对细胞核的影响。方案详细说明了必要的成像及图像分析步骤与工具，以评估：i）卵母细胞细胞质中的细胞骨架活性；ii）基于细胞骨架的卵母细胞核搅动；iii）其对卵母细胞核内生物分子凝聚体动力学的影响。除卵母细胞生物学研究外，本文详述的方法亦可调整用于体细胞，以类似方式研究跨尺度的细胞骨架对核动力学的调控作用。
引言
细胞核定位对于多种细胞和发育功能至关重要1,2,3,4,5。哺乳动物的雌性生殖细胞——卵母细胞，会重塑其细胞质，将细胞核定位在细胞中央，尽管其分裂在大小上是不对称的，而这种不对称分裂依赖于后续染色体的偏心定位6（图1）。在小鼠和人类中，细胞核的中心定位可预测卵母细胞发育的成功与否7,8，从而反映其胚胎发育潜能（图1）。
小鼠卵母细胞中的细胞质重塑主要由肌动蛋白-肌球蛋白细胞骨架驱动9（图2）。其活动产生机械力，可搅动、移动并穿透细胞核10（图2）。因此，这种从细....
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方案
所有动物实验均遵循欧洲共同体的指导方针，并获得法国农业部（许可编号：75-1170）以及研究与创新总司（DGRI；转基因生物协议编号：DUO-5291）的批准。小鼠饲养在动物设施中，光照周期为12小时明/12小时暗，环境温度为22–24 °C，相对湿度为40%–50%。本研究所使用的小鼠包括雌性OF1（Oncins France 1，8至12周龄）和雌性C57BL/6（10至14周龄）。
1. 卵母细胞的收集与制备
- 按照文献18和19所述方法，从8至14周龄小鼠中收集卵母细胞。
- 简言之，首先如文献18所述，将小鼠卵巢取出并置于预热（37 °C）的M2+牛血清白蛋白（BSA）培养基中，该培养基添加有1 µM米力农19，以防止卵母细胞恢复减数分裂。
- 使用手术针穿刺卵巢卵泡，释放来自窦状卵泡的生长中卵母细胞（卵母细胞生长末期20）。
- 使用专用于卵母细胞收集的微量移液器收集实验所需大小的卵母细胞（生长中和/或完全成熟的卵母细胞），随后在矿物油覆盖下的新鲜培养基培养皿中进行洗涤和转移。
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结果
图3中的图像显示了典型完全成熟卵母细胞的示例（图3A），表达YFP-Rango的完全成熟卵母细胞中的核质（图3B），表达适量（左图；图3C）或过量（右图；图3C）SRSF2-GFP cRNA的完全成熟卵母细胞中的核质，以及使用SC35抗体对完全成熟卵母细胞核内小斑点进行的免疫染色结果（图3D）。显微注射SRSF2-GFP cRNA的合适剂量是通过将SRSF2-GFP的表达模式与核内小斑点的内源性分布模式进行视觉比较后确定的。
如本实验室先前利用STICS矢量图和图像相关性分析所显示的那样（见9和11），卵母细胞中的胞质搅拌力可通过细胞.......
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讨论
本方案的关键步骤包括在不影响卵母细胞存活或正常功能的前提下对其进行适当的显微注射9,10,11，以及注射预定量的cRNA，以实现对相关结构（如核斑点）的准确可视化。
在研究细胞骨架如何扰动细胞核或其内部结构时，建立细胞质与（细胞核内）核动态之间的关联至关重要。本实验方案经轻微修改后，可通过关联细胞质搅动强度与核内YFP-Rango或SRSF2-GFP液滴的动态（如11所述）实现这一目标。操作时，应首先以明场模式对卵母细胞进行120秒的录像，以记录细胞质搅动情况，随后立即使用491 nm激光进行120秒录像，以捕捉细胞核轮廓或液滴动态。若研究对象为核内SRSF2-GFP液滴，可通过将其有效扩散系数（见本方案步骤7）与通过图像相关分析获得的细胞质搅动最大强度值的倒数进行比较，从而简单评估二者之间的相关性（见本方案步骤4）。另一个重要考虑因素是用于液滴表面.......
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
A.A.J. 和 M.A. 共同撰写了论文，所有作者均对论文提出了修改意见。M. A. 由法国国家科学研究中心（CNRS）和 "ARC基金会项目"（PJA2022070005322）提供资助。A.A.J. 由特雷耶基金会、圣米歇尔基金和法国公学院基金会提供资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A3311 | |
| CSU-X1-M1 转盘 | 横河 | ||
| DMI6000B 显微镜 | Leica | ||
| Femtojet 微注射仪 | Eppendorf | ||
| Fiji | |||
| 滤光轮 | Sutter Instruments Roper Scientific | ||
| Fluorodish | 世界精密仪器公司 | FD35-100 | |
| Metamorph 软件 | 通用成像， | 版本 7.7.9.0 | |
| 矿物油 | Sigma Aldrich | M8410-1L | |
| NanoDrop 2000 | 赛默飞世尔科技 | ||
| OF1和C57BL/6小鼠 | 查尔斯河实验室 | ||
| Poly(A)加尾试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | AM1350 | |
| Retiga 3 CCD相机 | QImaging | ||
| RNAeasy 试剂盒 | Qiagen | 74104 | |
| SC35 抗体 | Abcam | ab11826 | 核斑点抗体；小鼠 IgG1 抗 SRSF2/SC35（1:400） |
| SRSF2-GFP 质粒 | OriGene Technologies | MG202528 | NM_011358 |
| 去污微移液管 | XLAB 解决方案 | 专用于卵母细胞采集 | |
| T3 mMessage mMachine | 赛默飞世尔科技 | AM1384 | |
| T7 mMessage mMachine | 赛默飞世尔科技 | AM13344 | |
| 恒温箱 | 生命成像服务 | ||
| Windows Excel | Windows |
参考文献
- Quinlan, M. E. Cytoplasmic Streaming in the Drosophila Oocyte. Annual Rev Cell Developl Biol. 32, 173-195 (2016).
- Goldstein, R. E., van de Meent, J. W. A physical perspective on cytoplasmic streaming. Interface Focus. 5 (4), 20150030(2015).
- Gundersen, G. G., Worman....
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重印与许可
