跨空间尺度捕捉小鼠卵母细胞核由细胞骨架介导的扰动

摘要

本方案提供了一个实验框架，用于记录细胞骨架对小鼠卵母细胞系统中细胞核形态以及内部无膜细胞器的物理影响。该框架可适用于其他细胞类型和研究背景。

摘要

理解女性不孕症成因的一个主要挑战在于阐明调控女性生殖细胞（称为卵母细胞）发育的机制。卵母细胞的发育以细胞生长和随后的分裂为标志，这两个关键阶段使卵母细胞为与精子融合并启动胚胎发生做好准备。在生长过程中，卵母细胞会重组其细胞质，将细胞核定位在细胞中央，这一事件可预测小鼠和人类卵母细胞的成功发育，因而也反映了其胚胎发生潜能。在小鼠卵母细胞中，这种细胞质重组已被证明由细胞骨架驱动，其活动产生机械力，从而搅动、移动并穿透细胞核。因此，这种从细胞质向核质的力传递调节了核内被称为生物分子凝聚体的RNA加工细胞器的动力学行为。本实验方案提供了一个高时间分辨率的实验框架，用于记录小鼠卵母细胞中细胞骨架在不同空间尺度上对细胞核的影响。方案详细说明了必要的成像及图像分析步骤与工具，以评估：i）卵母细胞细胞质中的细胞骨架活性；ii）基于细胞骨架的卵母细胞核搅动；iii）其对卵母细胞核内生物分子凝聚体动力学的影响。除卵母细胞生物学研究外，本文详述的方法亦可调整用于体细胞，以类似方式研究跨尺度的细胞骨架对核动力学的调控作用。

引言

细胞核定位对于多种细胞和发育功能至关重要^1,2,3,4,5。哺乳动物的雌性生殖细胞——卵母细胞，会重塑其细胞质，将细胞核定位在细胞中央，尽管其分裂在大小上是不对称的，而这种不对称分裂依赖于后续染色体的偏心定位⁶（图1）。在小鼠和人类中，细胞核的中心定位可预测卵母细胞发育的成功与否^7,8，从而反映其胚胎发育潜能（图1）。

小鼠卵母细胞中的细胞质重塑主要由肌动蛋白-肌球蛋白细胞骨架驱动⁹（图2）。其活动产生机械力，可搅动、移动并穿透细胞核¹⁰（图2）。因此，这种从细胞质向核质传递的力学信号调控了核内信使RNA加工细胞器——核斑点的动态行为¹¹，核斑点是细胞核内多种无膜细胞器之一，被称为生物分子凝聚体^{12,13,14,15,16}（图2）。

活体成像在解析核振荡功能意义方面起到了决定性作用。数小时内的核迁移动态影像，以及肌动蛋白网和细胞质整体的高时间分辨率影像，极大地推动了核定位理论模型的建立，将不同时间尺度联系起来⁹。此外，细胞质、核轮廓以及染色质和核内凝聚体等核组分的高时间分辨率影像，揭示了细胞骨架驱动的核振荡在小鼠卵母细胞中对RNA加工和基因表达的调控作用，从而连接了细胞内不同的时空尺度^10,11。总体而言，这种基于活体成像的跨尺度研究方法首次为细胞骨架对核的振荡作用与卵母细胞发育成功之间的关联提供了理论依据。

本方案提供了用于研究细胞质内力（主要由F-actin产生，部分由微管产生）在小鼠卵母细胞中向细胞核及其内部组分传递的成像与图像分析流程。这些实验的目标是通过高时间分辨率的动态影像，捕捉从细胞质骨架到细胞核内部跨空间尺度的力的连续传递过程，如近期两项研究所示^10,11，这些研究建立了细胞质主动运动、核轮廓波动以及一种特定类型的核内生物分子凝聚体——核斑点（nuclear speckles）的运动和表面波动之间的关联。该方法同样可应用于其他预期细胞质内力发生变化的模型系统，例如恶性癌细胞的研究背景中¹⁷。

方案

所有动物实验均遵循欧洲共同体的指导方针，并获得法国农业部（许可编号：75-1170）以及研究与创新总司（DGRI；转基因生物协议编号：DUO-5291）的批准。小鼠饲养在动物设施中，光照周期为12小时明/12小时暗，环境温度为22–24 °C，相对湿度为40%–50%。本研究所使用的小鼠包括雌性OF1（Oncins France 1，8至12周龄）和雌性C57BL/6（10至14周龄）。

1. 卵母细胞的收集与制备

1. 按照文献¹⁸和¹⁹所述方法，从8至14周龄小鼠中收集卵母细胞。
   1. 简言之，首先如文献¹⁸所述，将小鼠卵巢取出并置于预热（37 °C）的M2+牛血清白蛋白（BSA）培养基中，该培养基添加有1 µM米力农¹⁹，以防止卵母细胞恢复减数分裂。
   2. 使用手术针穿刺卵巢卵泡，释放来自窦状卵泡的生长中卵母细胞（卵母细胞生长末期²⁰）。
   3. 使用专用于卵母细胞收集的微量移液器收集实验所需大小的卵母细胞（生长中和/或完全成熟的卵母细胞），随后在矿物油覆盖下的新鲜培养基培养皿中进行洗涤和转移。
2. 通过反复吹打将卵母细胞与窦状卵泡细胞机械分离，并在37 °C培养箱中静置稳定1小时，再进行后续实验步骤。
   ​注意：所有实验步骤中均需将卵母细胞保持在37 °C。本实验方案中收集的是最大尺寸的卵母细胞，即完全成熟的卵母细胞。

2. 卵母细胞显微注射

注意：为捕获细胞质中基于细胞骨架的活动，采用明场活细胞成像。因此无需进行荧光标记物的显微注射，本方案可从第3步继续进行。为成像细胞核轮廓，使用了Rango探针，该探针在其N端带有YFP标签，C端带有CFP标签^21,22。在卵母细胞中以488 nm波长成像时，它可标记整个细胞核（核仁除外²³），并呈现出非常清晰的核轮廓。为可视化核斑点，使用了SRSF2-GFP（NM_011358），这是一种核斑点的标记物¹¹。卵母细胞的采集、显微注射、互补RNA翻译及活细胞成像均使用相同的培养基。

1. 用SfiI限制性内切酶线性化Rango质粒，或用AgeI限制性内切酶线性化SRSF2-GFP质粒。
2. 合成带有帽结构的互补RNA（cRNA） 体外 根据启动子类型（Rango 使用 T3，SRSF2-GFP 使用 T7）选择相应的转录试剂盒，并按照先前所述方法使用柱纯化试剂盒进行纯化²⁴.
   注意：使用多聚腺苷酸化试剂盒对SRSF2-GFP RNA进行多聚腺苷酸化处理，以提高cRNA的稳定性。由于质粒骨架不同，使用了两种不同的启动子。
3. 使用微量分光光度计测定cRNA浓度。
4. 将 Rango cRNA 用 dH₂O 稀释至 1000 ng/µL，将 SRSF2-GFP cRNA 稀释至 600 ng/µL₂O.
5. 在 4 °C 下以 25,000 x g 离心 cRNA 分装液，时间不少于 60 分钟 g 显微注射前
6. 注射编码YFP-Rango或SRSF2-GFP的cRNA，具体方法如前所述。^11,25 使用显微注射仪将物质注入37 °C的M2+ BSA+Milrinone培养基中的卵母细胞胞质内。
7. 在37 °C培养基中孵育卵母细胞至少2小时，以进行cRNA翻译。
8. 将卵母细胞置于35 mm带玻璃底盖玻片的组织培养皿中，每个小滴培养液（5 µL）内 用矿物油覆盖。每个液滴中放置一个卵母细胞，以避免邻近卵母细胞的荧光漂白。

3. 活细胞成像

注意：使用配备 Plan-APO 40x/1.25 NA 油浸物镜、电动扫描载物台、培养箱（37 °C）、与滤光轮耦合的CCD相机以及转盘共聚焦系统的倒置共聚焦显微镜观察活体小鼠卵母细胞。采用Metamorph软件（下文简称成像软件）的流式采集模式获取高时间分辨率图像。

1. 打开 获取 成像软件的窗口。
2. 设置曝光时间为 500 ms，相机区域在 全芯片 并进行分箱处理 1.
3. 在 获取 选项卡，为所需通道设置照明。为观察细胞质活动，使用透射光照射卵母细胞。为观察标记有YFP-Rango或SRSF2-GFP的细胞核，使用491 nm激发波长照射卵母细胞。
4. 对于细胞质搅拌或YFP-Rango实验，应以卵母细胞核仁为焦点，该结构在透射光下易于观察（图3A）。将获取单个平面图像。对于核斑点实验，需聚焦于SRSF2-GFP液滴（图3C).
5. 在 特殊 选项卡，按以下顺序设置参数以优化采集速度。
   相机快门 开放以进行暴露
   透明模式： 清除预序列
6. 打开 流数据采集 成像软件的窗口中。根据实验设置流式参数。针对这两项研究^10,11，使用下述参数。
   1. 在 获取 选项卡，设置以下参数。
      采集模式： 流式传输至内存
      帧数： 480 （可减少至240帧以缩短成像时间）
      相机参数： 以指定帧率采集图像
      跳过的帧数（Nb）： 0
   2. 在 数码相机控制器参数 选项卡，设置以下参数。
      相机状态： 停止
      快门模式： 永不打开
      透明模式： 清除预序列
      平均帧数： 1
      注意1：在流模式下，曝光时间设定后，视频时长由帧数决定。例如，500 ms曝光时间与480帧将生成一段4分钟的视频。在图像采集过程中可显示预览。
7. 在目标周围调整感兴趣区域（ROI）。缩小ROI的面积可减少采集时间。
8. 点击 获取 在 图像采集 启动电影的窗口。
9. 采集结束时将视频保存为 .tif 文件。
   注意：为了在高时间分辨率的成像视频中追踪核结构，核探针（YFP-Rango 和 SRSF2-GFP）应具有较高的信噪比，以便在后续图像分析步骤中便于对目标进行分割。外源表达的 SRSF2-GFP 信号分布应与内源性核斑点免疫染色结果相当。图3C- DSRSF2-GFP 表达谱相对于内源性染色的变化可能反映了cRNA注射和翻译的剂量较高²⁶ (图3C- D).

4. 图像分析：细胞质搅拌

注意：卵母细胞中反映肌动蛋白细胞骨架活动强度的胞质流动，通过本实验室先前发表文献中描述的软件进行图像相关性分析来确定⁹，该软件可在²⁷获取。该软件用于测量连续图像间像素强度的保留程度。输出结果为图像间随时间推移的相关性下降值，起始值为1，并随时间呈指数下降，如文献⁹所示。

1. 使用 Fiji 的 StackReg 插件（Plugins>StackReg）对原始延时图像（Δt=0.5 s）进行图像配准。要安装 StackReg 插件²⁸，需启用 BIG-EPFL 更新站点²⁹以获取该插件。
2. 按照以下步骤，在约 300 µm² 的 3 至 4 个细胞质区域中计算明场图像的相关性。
   1. 裁剪出相应区域并将其保存为独立的视频文件。打开终端窗口。
   2. 输入 oocyte，按下 空格键，然后按下 回车键。此时将弹出一个名为“Signal and Slot”的窗口。选择需要分析的已裁剪视频文件。
      注意：可同时选择多个视频文件。
3. 应用程序会将生成的文件保存至与原始视频相同的文件夹中。将生成三个不同扩展名的文件，分别为 .csv、.eps 和 .xls。其中 .xls 文件包含用于绘制某一区域相关性曲线的数据。需对同一细胞内不同区域的相关性数值取平均值。
4. 为便于可视化，可通过将每个时间点的数值从 1 中减去，对最终的相关性数值进行转换，从而获得类似指数衰减的倒置曲线，如文献¹¹所示。

5. 图像分析：细胞质载体图谱

注意：小鼠卵母细胞胞质流速矢量图是通过Fiji软件中的时空图像相关光谱（Spatiotemporal Image Correlation Spectroscopy, STICS）插件生成的³⁰，该插件此前已用于检测小鼠卵母细胞中的胞质流动³¹³²，并可在³³获取。这些矢量图显示了胞质流动的速度大小和方向，如文献⁹和¹¹所示。

1. 将明场延时图像（Δt=0.5 s）转换为32位格式。
2. 使用 Fiji 的 StackReg 插件重新对齐图像 插件 > StackReg 并选择 刚体 转化
3. 使用 STICS 插件套件中去趋势工具（Detrend tools）的插件“stack subtract moving average jru v2”，通过减去图像序列的时间平均图像来消除视频中的静态结构。勾选复选框 减去静态平均值 和 输出子堆栈，选择 保持空间平均 并设置周期 5.
4. 在卵母细胞周围绘制一个感兴趣区域（ROI），排除皮层部分，以避免插件的边界效应。
5. 启动 STICS map jru V2 插件（位于 ICS 工具中），设置子区域大小为 32 像素，步长为 16 像素，STICS 时间偏移为 3，X 和 Y 偏移为 0，速度倍增系数为 8，幅值阈值为 0，并勾选以下复选框： 归一化向量长度、中心化向量、输出速度 和 使用电影蒙版.
   ​注意：该插件会生成一个以 .tif 格式存储的卵母细胞图谱，以矢量形式显示细胞质流动，颜色表示流动幅度，如⁹ 和¹¹以及包含测量流速的 Excel 文件。

6. 图像分析：细胞核轮廓波动

注意：细胞核轮廓的波动（反映核膜的扰动）可从用 YFP-Rango 标记的细胞核动态影像中确定（图 4A、C）。分析细胞核轮廓波动需要使用 Fiji 软件，并安装插件 StackReg（启用 BIG-EPFL 更新站点²⁹ 可获取 StackReg 插件）、PureDenoise³⁴ 和 Ovocyte_nucleus。StackReg 插件用于图像配准，以校正可能存在的整体运动；PureDenoise 插件用于去除受泊松-高斯混合噪声污染的多维图像噪声，并平滑细胞核轮廓；Ovocyte_nucleus 插件对信号进行阈值分割，并填充核仁对应的空洞，以生成二值化的细胞核掩膜，随后使用 StackReg 重新对齐，并计算从细胞核掩膜质心到掩膜边缘在所有 θ 角度（θ 从 0° 到 360°，以 1° 为增量）的距离 r，如 图 4 所示。这些插件的全部代码可在 ³⁵ 处获取。

1. 在 Fiji 软件中，进入 插件 > CIRB > Verlhac 菜单，选择 卵母细胞核形态分析（Ovocyte Nucleus Shape）。
2. 在弹出的对话框中执行以下选择：
   1. 选择包含待分析影片的文件夹。
   2. 选择 θ 角度（可选范围为 1° 至 360°，为获得最佳轮廓分辨率，建议使用 1°），以及裁剪边距（建议设置为 5 µm，以确保完整保留细胞核）。
   3. 选择 XY 标定参数和时间间隔，然后点击 确定（OK）。
      注意：结果将以 .xls 文件形式保存在原始影片所在文件夹内的“out”子文件夹中。该文件显示了在每个时间点 t 和每个角度 θ 下测得的所有半径 r。输出文件示例见 补充表 1（Supplementary Table 1）。“out”文件夹中还包含一个细胞核掩膜的影片。
3. 使用电子表格软件，针对每个设定的 θ 角度，计算所有时间点 t 上的平均半径 R。由此可绘制随时间变化的平均形态图（图 4B）。示例见 补充表 2（Supplementary Table 2）。
4. 对每个时间点 t 和角度 θ，将半径 r 减去时间平均半径 R。其偏差平方 (r-R)² 可用于衡量核膜的波动程度。
5. 计算每个细胞核在所有时间点 t 和所有角度 θ 上的波动均值，并可进一步计算某一实验条件下所有细胞核的平均波动值。
   注意：当细胞核形态发生显著改变（例如细胞骨架被破坏）时，需先在 Fiji 中将标记有 YFP-Rango 的细胞核进行旋转，使其平滑部分朝上、凹陷部分朝下，再进行核轮廓波动分析，方法如文献¹⁰ 所述。

7. 图像分析：核斑点运动（扩散动力学）

注意：核斑点运动分析能够通过其轨迹推断这些细胞器的运动类型（驱动型、扩散型或受限型）。

1. 选择表达 SRSF2-GFP 液滴且主要在 X-Y 轴方向移动的卵母细胞的流模式图像。
2. 使用 Fiji 中的直方图匹配法对表达 SRSF2-GFP 的卵母细胞时间序列图像进行漂白校正（图像 > 调整 > 漂白校正）。
3. 使用 Fiji 的 StackReg 插件对图像进行重新对齐。
4. 使用 Fiji 的手动追踪插件（插件 > 追踪 > 手动追踪）追踪 SRSF2-GFP 液滴中心。按下 添加轨迹 开始追踪，完成时按下 结束轨迹。请勿启用中心校正功能。
5. 将轨迹复制到电子表格文件中，按照 ¹¹ 中的方法进行时间平均均方位移（MSD）计算，并根据每条 20 秒的液滴轨迹计算时间 MSD。
6. 使用 R 软件中的 Nelder-Mead 方法拟合曲线（msd(t) = beta × t^α），以估算扩散指数 alpha（α）。
7. 测量有效扩散系数，以便比较不同条件下的扩散情况，因为预期扩散为反常扩散（α < 1）。
8. 通过对时间 MSD 曲线前 40 个点（20 秒）进行线性拟合（alpha=1）计算有效扩散系数 D_eff，并以液滴尺寸进行归一化处理（D_eff 单位为 µm²/s × 3/2 πr，其中 r 单位为 µm）。

8. 图像分析：核斑点表面波动

注意：使用为 Fiji 开发的自定义插件 Radioak³⁶ 并可在³⁷获取，测量了核斑点轮廓随时间的演变，这是一种反映作用于这些细胞器上的活性力传递的读数。该插件可提取围绕选定区域中心在各个角度上的半径值。通过比较每个角度下半径值与其平均值的相对变化，来测量形状随时间的变化。该插件可用于量化形状波动，并提供可视化这些动态过程的选项。安装方法为：下载 Radioak_.jar 文件并将其放入 Fiji 的插件文件夹中，然后重启 Fiji。此插件是此前用于分析核轮廓波动的插件的更新版本，并实现了类似的分析流程。

1. 在 SRSF2-GFP 液滴的动态成像视频中，选择尺寸相近且较大的液滴（半径约 2.5 µm）。
   注意：若液滴过小，分辨率不足将导致液滴表面波动测量出现异常。
2. 围绕液滴绘制矩形区域，裁剪时间序列图像（时长 15 秒，Δt = 0.5 秒），并选择 图像 > 裁剪（图 5）。
3. 使用 Fiji 的 StackReg 插件，在 插件 > StackReg 中选择刚体变换模式对图像进行重新对齐。
4. 使用 Fiji 中 处理 菜单下的 平滑 功能对图像进行平滑处理，以去除液滴周围的噪声。
5. 在 Fiji 的 处理 > 二值化 菜单下，使用 转换为掩膜 功能生成液滴的二值掩膜。采用 默认 方法，并设置 暗色为背景（图 5）。
6. 在 Fiji 的 分析 菜单下，使用 分析颗粒 功能对生成的二值液滴掩膜进行分析，勾选 清除结果 和 添加至管理器 选项，并将感兴趣区域（ROIs）以 zip 格式保存至 RoiManager（更多 > 保存），以便 Radioak 读取。这些 ROIs 必须保存在与原始视频相同的文件夹下的一个名为 contours 的子文件夹中，每个视频对应的文件应命名为 imagename_UnetCortex.zip，以便 Radioak 能够识别。
7. 在 Fiji 的 插件 > CIRB > Radioak 菜单中，选择 获取半径 以处理单个视频，或选择 处理整个文件夹 以分析同一文件夹中的所有视频。
   注意：程序将弹出窗口要求选择角度数量和标尺参数。Radioak 以 1° 为增量从 0° 到 360° 进行分析（输入值为 360），并提取各角度下的半径值。
8. 选择待分析的视频文件或包含多个视频的文件夹。结果将以 .xls 文件形式输出（每个视频对应一个文件），保存在原始视频所在文件夹内的 radioakres 目录中。每个文件包含在各个时间点 t（以帧编号表示）和各个角度（以弧度表示）下测得的所有半径 r 值（若已输入标尺参数，则单位为 µm；图 5；.xls 输出示例见 补充表 3）。
9. 在电子表格中，针对每个设定角度，计算所有时间点 t 上的平均半径 R（示例见 补充表 4）。该计算可用于绘制随时间变化的平均形状曲线。
10. 绘制 (r-R)² 的方差（单位为 µm²），该值表征液滴表面波动的程度。

结果

图像面板在 图3 展示一个典型成熟卵母细胞的示例（图3A)，在表达YFP-Rango的完全成熟卵母细胞中的核质图3B），在表达正确的完全成熟卵母细胞中的核质（左图； 图3C）或过量（右侧面板； 图3CSRSF2-GFP cRNA 的剂量，以及使用 SC35 抗体对完全生长期卵母细胞中核斑点进行的免疫染色图3D通过将SRSF2-GFP的表达模式与核斑点内源性表达模式进行肉眼比对，确定了显微注射SRSF2-GFP cRNA的合适剂量。

如本实验室先前利用STICS矢量图和图像相关性分析所展示的（见⁹和¹¹），卵母细胞中的胞质搅拌力可通过细胞骨架的扰动而降低，无论是遗传性扰动（例如FMN2突变型小鼠）还是化学性扰动（例如细胞松弛素D）。对照组卵母细胞的STICS图显示大量矢量，颜色表明较高的流动速度；而细胞骨架作用力被破坏的卵母细胞图中矢量较少，颜色表明流动速度较低。类似地，与细胞骨架作用力被破坏的卵母细胞相比，对照组卵母细胞的图像相关性迅速丧失。这一点在相关性曲线上可以观察到：对照组卵母细胞的相关性曲线下降更快⁹，或当曲线反转时上升更快¹¹。

细胞骨架力会扰动细胞核及其内部细胞器，特别是核内凝聚体（如核斑点）^10,11。在图4A中，对照组卵母细胞的细胞核表现出显著的周边波动，通过核探针YFP-Rango可以观察到这一现象。而在细胞骨架力被破坏的卵母细胞中，细胞核形态在时间进程中保持稳定（图4C）。分析细胞核轮廓的波动对于精确量化这种扰动至关重要。通过计算从细胞核质心到其边缘距离的方差（r-R）²（图4B），可实现对波动程度的量化，结果显示，对照组卵母细胞中的核扰动比细胞骨架力被破坏的卵母细胞高出6倍¹⁰。在图5A-B中，以高时间分辨率展示了在正常和细胞质力被破坏条件下核斑点（SRSF2-GFP⁺ 液滴）的情况。在对照组中，液滴表面的波动明显强于细胞质力被破坏的卵母细胞中的液滴表面，这一差异可通过Radioak³²插件进行可视化和量化。从视觉上看，绿色和红色（见图5A-B底部图像中的Radioak输出）表示插件检测到连续图像间表面发生变化的角度，白色则表示表面无变化。

图1：小鼠卵子发生的后期及早期胚胎发生的示意图。 图示卵母细胞晚期生长过程中细胞核的居中现象、卵母细胞分裂期间染色体的偏心现象，以及胚胎发生的早期阶段（1细胞期和2细胞期）。雌性基因组（卵母细胞核和雌性原核）以粉红色表示，雄性原核以蓝色表示，胚胎细胞核（父母基因组融合后）为紫色。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：小鼠生长卵母细胞中细胞质与细胞核在多尺度上的重塑示意图。 本图总结了文献^9,10,11中的关键发现，展示了基于肌动球蛋白的细胞质重塑、细胞核振荡以及在时空多尺度上功能性细胞核生物分子凝聚物的重塑过程。核斑点的跨尺度重塑增强了与其功能相关的生物分子反应（例如，前体mRNA的剪接）。需要注意的是，本实验方案仅允许在空间尺度上评估细胞核振荡，而无法在时间尺度上进行评估，因为所有成像均以相同的0.5秒时间分辨率采集图像帧。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：完全成熟的卵母细胞及核质的样本图像。（A）完全成熟卵母细胞的明场图像，显示环绕核仁的染色质（青色）。白色虚线圆圈标示细胞核边界。（B）表达YFP-Rango的活卵母细胞核；注意核仁区域无荧光信号。（C）显微注射适量cRNA（左图）或高剂量cRNA（右图）后表达SRSF2-GFP的活卵母细胞核示例；注意左侧呈现凝聚相（液滴）与溶解相共存的状态，而右侧条件下该现象消失。（D）固定卵母细胞中的核斑点免疫染色结果；注意其内源表达模式与（C）左图相似。比例尺 = 5 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：对照组与受干扰的细胞核轮廓波动插件输出结果。（A）表达 YFP-Rango 的对照组卵母细胞细胞核的延时图像（上方），及其由 Ovocyte_nucleus 插件生成的对应二值掩膜图像（下方）。（B）随时间及在特定方向上测量细胞核轮廓波动的原理。方向由从 0° 到 360°、以 1° 为增量旋转的角度 θ 定义。图中展示了 t=0 s（黄色）和 t=135 s（紫色）两个代表性形态。蓝色形态表示随时间变化的平均形态。（C）由于 F-肌动蛋白（FMN2 突变小鼠）和微管（诺考达唑处理；如¹⁰所述）均被破坏，导致细胞骨架作用力降低的卵母细胞中细胞核的轮廓波动。比例尺 = 5 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：对照组与扰动条件下液滴表面波动的插件分析结果。（A）对照组 SRSF2-GFP 核内液滴的图像裁剪区域，每帧成像时间为 500 ms，采用 Ice 查找表（LUT）显示（顶部）；由 Fiji 生成的同一液滴的二值化掩膜（中部）；以及 Radioak 插件对液滴表面波动分析后的输出结果（底部），其中绿色和红色表示插件检测到连续图像间表面发生变化的角度位置，白色表示无表面变化。（B）由于 F-肌动蛋白和微管结构均被破坏，导致细胞骨架作用力降低的卵母细胞中核内液滴的表面波动情况（如文献¹¹所述）。比例尺 = 5 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

补充表1：卵母细胞核插件分析输出示例。 该核的分析结果与图4A中所示样本相同。Theta（θ）为角度（单位：度），t1至t600对应帧编号，可转换为时间。半径单位为 µm。请点击此处下载该文件。

补充表 2：用于计算核轮廓波动的示例电子表格。 分析的同一细胞核与图 4A中所示相同。Theta (θ) 为角度（单位：度），t1 至 t600 对应帧编号，可转换为时间。Raw 和 average 选项卡：半径单位为 µm。r-R 选项卡：r-R 距离单位为 µm。表 (r-R)²：波动值单位为 µm²。x 和 y 选项卡对应于 Raw 和 average 选项卡中半径的笛卡尔坐标，可用于在 mean shape 选项卡中绘制随时间变化的细胞核平均形状。请点击此处下载该文件。

补充表3：Radioak插件分析输出示例。 该液滴的分析结果与图5A中所示液滴相同。表中列出了在不同时间点和角度下测得的半径值，半径单位为µm。请点击此处下载该文件。

补充表4：用于计算核滴表面波动的示例电子表格。 分析的为与图5A中所示相同的液滴。Theta（θ）为角度（单位：度），t1至t600对应帧编号，可转换为时间。Raw和average工作表：半径单位为µm。r-R工作表：r-R距离单位为µm。²工作表：波动值单位为µm²。x和y工作表对应于Raw和average工作表中半径的笛卡尔坐标。请点击此处下载该文件。

讨论

本方案的关键步骤包括在不影响卵母细胞存活或正常功能的前提下对其进行适当的显微注射^9,10,11，以及注射预定量的cRNA，以实现对相关结构（如核斑点）的准确可视化。

在研究细胞骨架如何扰动细胞核或其内部结构时，建立细胞质与（细胞核内）核动态之间的关联至关重要。本实验方案经轻微修改后，可通过关联细胞质搅动强度与核内YFP-Rango或SRSF2-GFP液滴的动态（如¹¹所述）实现这一目标。操作时，应首先以明场模式对卵母细胞进行120秒的录像，以记录细胞质搅动情况，随后立即使用491 nm激光进行120秒录像，以捕捉细胞核轮廓或液滴动态。若研究对象为核内SRSF2-GFP液滴，可通过将其有效扩散系数（见本方案步骤7）与通过图像相关分析获得的细胞质搅动最大强度值的倒数进行比较，从而简单评估二者之间的相关性（见本方案步骤4）。另一个重要考虑因素是用于液滴表面波动分析的凝聚体尺寸。为避免因尺寸影响表面波动强度而引入偏差，在比较分析中应选择直径相近的液滴。

本方案存在一些局限性。对核轮廓波动的分析依赖于完整的核内染色，例如使用YFP-Rango或NLS-GFP。在核斑点分析中，过量显微注射SRSF2-GFP cRNA可能导致该凝聚体标记物的相分离特性出现明显改变（图3C），这一点此前已有文献综述²⁶。因此，验证外源蛋白的表达水平是否与内源蛋白相当至关重要。此外，由于本文所定义工具的空间分辨率限制，半径相对较小的液滴（<2 µm）应从表面波动分析流程中排除。这一分辨率问题通常可通过使用更高分辨率的显微镜来解决，例如在卵母细胞核或体积显著更小的体细胞核中探测较小凝聚体的表面波动时可能需要此类设备。

总体而言，本实验方案能够跨尺度捕捉小鼠卵母细胞核中由肌动蛋白和微管细胞骨架驱动的扰动现象。具体而言，该方案可用于记录细胞骨架介导的细胞质流动、核轮廓波动，以及核内液滴状核斑点的位移和表面波动。尽管已有部分研究通过复杂程度不同的独立实验方案，在特定空间尺度上探讨了其他细胞类型中的类似问题^38,39,40，但本方案首次提供了一种简便的方法，可在单一工作流程中跨多个尺度研究上述细胞动态过程。此外，结合如文献^10,11中所采用的生物物理建模方法，本方案所产生的数据可实现对以下方面的最小侵入性评估：i) 核力学性质的变化¹⁰；ii) 细胞骨架驱动的活性力从细胞质传递至细胞核内凝聚体的过程¹¹；以及 iii) 这种活性能量在不同细胞区室间的耗散情况^10,11。重要的是，该方案具有良好的通用性，不仅可适用于核仁²³等其他核内凝聚体，还可拓展至癌细胞等其他细胞类型，因为在这些细胞中已观察到细胞骨架和核内凝聚体行为的改变^17,41。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A3311
CSU-X1-M1 转盘	横河
DMI6000B 显微镜	Leica
Femtojet 微注射仪	Eppendorf
Fiji
滤光轮	Sutter Instruments Roper Scientific
Fluorodish	世界精密仪器公司	FD35-100
Metamorph 软件	通用成像，		版本 7.7.9.0
矿物油	Sigma Aldrich	M8410-1L
NanoDrop 2000	赛默飞世尔科技
OF1和C57BL/6小鼠	查尔斯河实验室
Poly(A)加尾试剂盒	赛默飞世尔科技	AM1350
Retiga 3 CCD相机	QImaging
RNAeasy 试剂盒	Qiagen	74104
SC35 抗体	Abcam	ab11826	核斑点抗体；小鼠 IgG1 抗 SRSF2/SC35（1:400）
SRSF2-GFP 质粒	OriGene Technologies	MG202528	NM_011358
去污微移液管	XLAB 解决方案		专用于卵母细胞采集
T3 mMessage mMachine	赛默飞世尔科技	AM1384
T7 mMessage mMachine	赛默飞世尔科技	AM13344
恒温箱	生命成像服务
Windows Excel	Windows