体内大鼠三叉神经节感觉神经元的钙成像

摘要

基因编码的钙离子指示剂（GECI）可实现对感觉神经元信号传导的稳健且群体水平的分析。本文中，我们开发了一种新方法，可实现 体内 大鼠三叉神经节神经元活动的GECI可视化

摘要

基因编码的钙离子指示剂（GECIs）可实现对特定细胞群体中细胞内钙离子变化的成像监测。由于其具有较高的信噪比，GECIs 成为检测感觉神经元中刺激诱发活动的有力工具。GECIs 能够促进对刺激编码的群体水平分析，使可同时研究的神经元数量显著增加。这种群体编码分析最适合在 在体背根神经节（DRG）含有支配颈部以下躯体和内脏结构的感觉神经元胞体，被最广泛地用于 体内 成像，因为这些结构相对容易获取。最近，该技术被用于小鼠以研究支配口腔和颅面结构的三叉神经节（TG）中的感觉神经元。除了背根神经节（DRG）之外，研究TG的原因众多，其中包括一系列特发于口腔和颅面结构的疼痛综合征，这些综合征似乎反映了感觉神经元活动的变化，例如三叉神经痛。由于遗传工具的可及性，小鼠被最广泛地用于DRG和TG神经元的研究。然而，考虑到大小、操作便利性以及潜在的重要物种差异，也有必要对大鼠而非小鼠的TG神经元进行研究。因此，我们建立了一种用于成像大鼠TG神经元的方法 体内我们通过腹腔注射的方式向新生幼鼠（p2）注射了编码GCaMP6s的腺相关病毒（AAV），结果导致 >三叉神经节（TG）和背根神经节（DRG）神经元的感染率达到90%。通过开颅和去皮质手术在成年动物中观察三叉神经节（TG），并在刺激面部下颌支和上颌支区域后监测TG神经元中GCaMP6s荧光信号的变化。我们通过外周神经阻断证实荧光增强是由刺激诱发的。尽管该方法具有多种潜在应用，目前我们正利用它来表征外周神经损伤后发生变化的TG神经元亚群。

引言

躯体感觉是指机械、热和化学刺激作用于皮肤或其他身体结构（包括肌肉、骨骼和内脏）时，由支配这些结构的初级传入神经元活动所引发的神经编码过程¹。基于单个神经元的电生理学方法已为参与该过程的传入神经元亚型及其刺激-反应特性随时间变化的规律提供了大量信息^1,2,3。然而，尽管支持“标记线理论”（即特定感觉模式由特定神经元亚群传递）的证据仍然充分，但许多神经元亚群能够对相同类型的机械、热和化学刺激产生反应的事实表明，大多数躯体感觉刺激是由多个神经元亚群共同编码的^4,5。因此，只有具备同时研究数十个甚至数百个神经元活动的能力，才能更深入地理解躯体感觉机制。

随着共聚焦显微技术的出现，以及随后多光子成像和数字成像技术的发展，光学方法取得了显著进步，使得对神经元活动进行相对无创的群体水平分析成为可能^6,7。该技术应用中的最后一个挑战之一，是开发出可用于光学检测神经活动的工具。鉴于动作电位的发生和结束可在不到一毫秒内完成，能够以动作电位的速度追踪膜电位变化的电压敏感性染料，将是实现这一目标的理想工具。尽管该领域已取得巨大进展^7,8,9,10，但这些染料中的许多信号噪声比仍不够高，尚无法在单细胞水平上对数百个神经元进行群体分析。作为一种替代方法，研究人员转而监测细胞内Ca²⁺浓度（[Ca²⁺]_i）的变化。这一策略的局限性从一开始就十分明确，包括：[Ca²⁺]_i升高是神经活动的间接指标¹¹；[Ca²⁺]_i升高可能独立于电压门控Ca²⁺通道（VGCCs）激活所引起的Ca²⁺内流而发生^12,13；Ca²⁺瞬变的幅度和持续时间可能受控于与VGCC活性无关的其他过程^11,12,14；以及Ca²⁺瞬变的时间进程远长于动作电位¹⁵。然而，使用Ca²⁺作为神经活动间接测量指标仍具有若干显著优势。其中尤为突出的是大多数Ca²⁺指示剂所具有的较高信号噪声比，这既反映了细胞内Ca²⁺变化的幅度，也得益于信号来源于细胞质的三维空间，而非细胞膜的二维空间。此外，随着基因编码Ca²⁺指示剂（GECI's）的发展，现在可以利用基因策略驱动Ca²⁺指示剂在特定细胞亚群中的表达，从而促进在完整组织样本中进行群体水平的分析（例如见¹⁶）。

鉴于目前可用于小鼠的遗传工具数量众多，GECI 在该物种中的应用最为广泛也就不足为奇了。现已开发出在感觉神经元亚群中组成型表达 GECI 的小鼠品系。^7,16,17随着表达重组酶的特定小鼠品系的发展，现在可以采用更为复杂精密的策略来控制GECI的表达¹⁵然而，尽管这些工具正变得越来越强大，仍有一些原因使得其他物种（如大鼠）在某些实验问题上可能更为合适。这包括大鼠体型更大，便于进行许多在体型较小的小鼠中难以甚至无法实施的实验操作；大鼠在相对复杂的行为学任务中更容易训练；并且至少有一些证据表明，大鼠感觉神经元中多种离子通道的生物物理特性及其表达模式，相较于小鼠，更接近于人类感觉神经元中所观察到的情况 小鼠中相对于人类的相同通道¹⁸.

虽然躯体感觉刺激的转导通常发生在初级传入神经元的外周末梢，但从外周引发的动作电位必须经过初级传入神经元胞体所在的结构——即背根神经节（DRG）或三叉神经节（TG）——才能传入中枢神经系统¹⁹。尽管有证据表明，并非每一个沿初级传入轴突传导的动作电位都会侵入胞体²⁰——这可能是由于初级传入神经元胞体通过T型分支与主传入轴突相连所致¹⁹——但大多数在外周引发的动作电位似乎仍会侵入胞体²¹。这一特性在使用基因编码钙指示剂（GECIs）评估初级传入神经元群体编码时提供了三个实验优势：相对于轴突而言较大的胞体尺寸，在利用细胞内钙离子浓度[Ca²⁺]_i作为传入活动间接指标时可进一步提高信噪比；DRG通常易于接近；并且在空间上远离传入末梢的部位评估活动，可最大限度地减少暴露神经节所需的手术对传入末梢刺激-反应特性可能造成的影响。然而，由于TG位于脑下方（或腭部上方），其可及性远低于DRG。此外，尽管DRG与TG神经元之间存在诸多相似之处，但两者之间的差异也日益显现，包括TG神经元大致呈躯体定位式的排列方式²²、所支配的独特结构、不同的中枢末梢终止模式^23,24,25,26，以及越来越多发现的基因表达^27,28和功能型受体表达方面的差异²⁹。此外，由于我们关注的是疼痛外周机制的识别，而临床上存在大量似乎仅局限于三叉神经系统的疼痛综合征（例如偏头痛、三叉神经痛、灼口综合征），这些疾病被认为涉及初级传入神经元的异常活动^30,31,32，因此有必要对TG进行直接研究。

因此，尽管已利用基因编码的钙离子指示剂（GECIs）在小鼠中研究了三叉神经节（TG）神经元的刺激-反应特性¹⁶，但由于上述原因表明大鼠可能是回答多种实验问题的更合适物种，本研究的目的是建立一种在大鼠中使用GECIs研究TG神经元的方法。为实现这一目标，我们采用病毒介导的方法在周围神经系统中驱动GECI GCaMP6s的表达。随后去除前脑，以暴露并获取对TG的通路。最后，在对面部施加机械和热刺激的同时，通过荧光显微镜评估神经元的反应。这些数据共同支持利用大鼠研究多种状态下TG变化的作用，从而扩展了对三叉神经系统感觉编码感兴趣的科研人员可用的技术工具。

方案

所有涉及动物实验的研究均遵循美国国立卫生研究院和国际疼痛研究协会制定的标准，并经匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会批准（方案编号 #22051100）。每次实验结束后，大鼠通过冰冻磷酸盐缓冲液（PBS）心脏灌流放血处死，该方法已获美国兽医协会和匹兹堡大学IACUC批准。

1. GCaMP 诱导

1. 订购妊娠时间明确的Sprague Dawley大鼠，以便在幼崽出生后的适当时间进行注射。
2. 在接触每只幼鼠前，用70%乙醇喷洒手套。这可以防止母鼠吞食幼崽。
3. 用70%乙醇擦拭幼鼠（P1-2），并在冰上麻醉3分钟。
4. 使用25 µL无菌、气密的Hamilton注射器，将15 µL AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40（Addgene）经腹腔注射。

2. 三叉神经节暴露手术

1. 根据体重，对6-8周龄大鼠（约150-200 g）腹腔注射麻醉混合液（55 mg/kg 氯胺酮，5.5 mg/kg 赛拉嗪，1 mg/kg 乙酰丙嗪）。
   注意：通常这足以维持手术所需的麻醉深度，可通过后肢足垫施加有害性夹捏后无回缩反射来评估。然而，若动物麻醉变浅，需通过鼻罩补充异氟烷。
2. 待大鼠完全麻醉后，剃除头部和面部的毛发及胡须。
3. 将大鼠固定于立体定位仪上，使用耳杆固定，并在下方放置加热垫（约37 ^oC），以维持体温。
4. 使用小鼠血氧仪或同类设备监测生命体征（心率、呼吸频率、血氧饱和度）。
   注意：通过直肠探头监测体温，并将大鼠置于由反馈控制的循环水毯上以维持体温。
5. 将浸有冰生理盐水的纱布置于头部，以收缩血管、减少出血。使用15号手术刀在颅骨上方沿中线切开皮肤和肌肉。
6. 钝性分离皮肤和肌肉组织，暴露颅骨。
7. 使用¼圆钻头小心钻穿颅骨，暴露前脑。然后使用咬骨钳（2.5 mm杯）小心切除颅骨。
8. 使用15号手术刀在脑部（前囟：-3.80）和嗅球处进行切开。
   注意：若切口位置更偏尾侧，则会导致大鼠死亡
9. 使用解剖铲小心分离硬脑膜与颅骨，并轻轻抬起已切断的脑组织，以暴露三叉神经节（TG）和颅底。
   注意：在整个取出过程中持续使用冰生理盐水灌注，有助于减少出血并优化后续解剖视野。
10. 使用电凝笔止住取材过程中出现的出血。
    ​注意：切开硬脑膜将不可避免地引起出血。最好预先准备好冰冻人工脑脊液（aCSF，含119 mM NaCl、26.2 mM NaHCO₃、2.5 mM KCl、1 mM NaH₂PO₄、1.3 mM MgCl₂、10 mM 葡萄糖、2.5 mM CaCl₂），用于灌洗颅腔，以帮助收缩血管并同时维持神经元活性。

3. GCaMP6s 成像

注意：由于这些神经元的尺寸和密度，所使用的成像和数据采集系统（物镜、显微镜、光源、相机）将决定可观察到的 GECI⁺ 细胞数量。光源、物镜和相机还将决定图像采集的参数，包括曝光时间和图像采集速率。虽然根据实验参数可以选择双光子或共聚焦成像技术，但落射荧光显微镜可能已足以分辨大量细胞。可使用任何图像采集软件包。理想情况下，刺激施加应与图像采集软件包实现时间同步。

1. 将颅腔置于物镜下方，使用可见光将TG调至焦点。
2. GCaMP6s 的激发波长为 496 nm，发射波长为 513 nm；因此，请使用合适的二向色镜和滤光片组来定位 GCaMP⁺ 细胞。调节焦距以定位并清晰观察神经元对目标感受野所受刺激产生反应的神经节区域。
3. 使用10倍物镜以实现对三叉神经节中大多数神经元的可视化，这些神经元对施加于1 cm区域的机械刺激有反应² 面部区域¹⁶使用工作距离较长（10.8 mm）的20倍干镜物镜以提高分辨率。
4. 使用采集软件（例如 Metamorph）随时间采集荧光数据，并记录对刺激应用的响应。
   1. 为尽量减少神经元的光漂白，应使用尽可能短的曝光时间来检测荧光的基础水平及刺激诱导的荧光增强。在本研究中采用20倍、0.40 NA的空气物镜、120 W汞卤素光源以及互补金属氧化物半导体（CMOS）相机，设置曝光时间为300 ms，图像采集速率为3 Hz，可获得稳定的基线记录 >90 分钟
      注意：1）这些图像采集参数必须通过实验经验确定。2）可在感受野上施加机械性（刷子、点状、振动、夹捏）、温度性（热和冷）以及化学性（辣椒素、薄荷醇、炎症介质）刺激。一种相对廉价的主观方法是手动施加刺激，但建议采用更客观且可重复的方法，例如使用反馈控制的驱动装置以已知力度进行重复刺激。虽然反馈控制的帕尔帖（Peltier）装置适用于精确的加热和冷却，但并不适合对曲面（如面部）进行热刺激。反馈控制的红外光源可作为加热的替代方案，而冷喷雾则是冷却效果较差的替代方法。

结果

由于我们先前使用 AAV9 血清型感染大鼠感觉神经元已取得成功¹⁵，因此本研究采用该血清型在大鼠三叉神经节（TG）神经元中表达 GCaMP6s。我们首先评估了将 AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40（AAV9-GCaMP）病毒注射至新生大鼠后对感觉神经元的感染效率²⁰。该病毒采用 CAG 启动子，可驱动并维持高水平的基因表达。此外，已有研究表明，AAV9 在注射至新生大鼠时能高效感染感觉神经元³³。初次注射采用 5 µL 病毒量，注射于出生后第 5 天（p5）的幼鼠，感染效率约为 51.66% ± 14.33%（图 1A）。为提高感染率，后续实验改用更小日龄（p2）的大鼠，并增加病毒注射体积至 15 µL，同时保持病毒滴度为 2.4 × 10¹⁴ 不变。该策略使神经元感染率达到 91.84% ± 3.18%（n = 8）（图 1B）。

讨论

在此，我们展示了一种快速、无创的方法，用于生成可用于TG成像的GECI大鼠。我们选用CAG启动子来驱动并维持高水平的基因表达。尽管先前的研究表明其他AAV血清型可能在DRG神经元中高效驱动基因表达³⁹，但我们的结果与最近一项关于新生大鼠腹腔注射AAV的研究一致³²，表明AAV9血清型在感染新生大鼠感觉神经元方面具有很高的效率。

在对该技术进行故障排查时，需注意一些可能影响最佳感染效果的潜在问题。首要考虑的变量是仔鼠的年龄。大鼠神经系统在出生后的前7天内发育迅速⁴⁰。我们曾尝试在较晚的时间点（例如出生后第4至7天）进行感染，结果感染效率不稳定且较低。而在较早的时间点（出生后第1至4天）进行操作可获得更强且更一致的感染效率，其中以出生后第1至2天的感染率最高。第二个变量是注射体积。无论年龄如何，使用滴度为2.5 × 10¹⁴时，至少需要15 µL的注射量才能在三叉神经节（TG）或背根神经节（DRG）中实现超过70%的感染效...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40	Addgene	100844-AAV9	AAV9-GCaMP6s 病毒
马来酸乙酰丙嗪	Covetrus	11695-0095-5	10 mg/mL
镇痛灵（赛拉嗪）注射液	AKORN Animal Health	23076-35-9	20 mg/mL
CTR5500 电子控制箱	Leica	11 888 820	电源供应器
Cutwell 钻头	Ransom & Randolph		¼ 圆形
DM 6000 FS	Leica	11 888 928	底座支架
EL6000	Leica	EL6000	带120 W汞灯的光源
镊子	FST	11252-00	Dumont No. 05
弗里德曼咬骨钳	FST	16000-14	2.5 mm 杯口尺寸
弗里德曼-皮尔逊咬骨钳	FST	16021-14	1 mm 杯口尺寸
加热垫（温度治疗垫）	STRYKER	8002-062-022
盐酸氯胺酮	Covetrus	1695-0703-1	100 mg/mL
Plan Fluor 20x/0.40	Leica	MRH00105	20倍物镜，数值孔径0.4，工作距离10.8 mm
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