本文描述了建立大鼠离体肺灌注（EVLP）模型所需的必要步骤，并展示了灌注肺组织相关的炎症特征。目的是传播有关大鼠EVLP模型的知识与经验，促进对这一革命性技术所涉及的生物学反应的全面理解。
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方法文章
建立一种 离体 用于肺移植转化研究的大鼠肺灌注模型
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
自肺移植作为晚期肺部疾病的治疗策略确立以来，科学界一直面临可用于供体捐献的肺脏数量不足的问题。然而，在最近几十年中，随着体外肺灌注（ex vivo lung perfusion, EVLP）技术的发展，这一局面已得到积极改善。EVLP作为一种评估和修复边缘性肺脏的策略，已在大型移植中心得到应用，不仅提高了肺功能诊断的准确性，还为肺移植物的修复提供了有效平台，从而促进了肺移植数量的增加。在此背景下，面对伦理和后勤方面的挑战，以及与肺移植相关的免疫学因素研究需求，啮齿类动物EVLP模型的建立变得尤为重要，因其具有可靠性高、可进行基因操作以及成本较低等优势。本文介绍了一种建立大鼠EVLP模型的实验方案，并展示了灌注肺脏相关的炎症特征。这将有助于推广关于大鼠EVLP模型的知识，深化我们对这一革命性技术所涉及生物学反应的理解。
引言
肺移植已被公认为治疗终末期肺疾病的治疗策略，在过去几十年中，随着外科技术与免疫抑制方案的改进，其疗效不断提升。尽管临床需求很高，但合适的已故肺脏供体数量却低于其他实体器官，导致肺移植手术的开展数量相对较少1,2,3。为缓解供体短缺问题，医学界已逐步扩大肺脏捐献的标准，使过去被认为不可用的器官转变为潜在的可移植器官。然而，扩大标准的同时也需付出更多努力，以更好地理解并干预来自供体器官可能引发的全身性后果。离体肺灌注（EVLP）技术应运而生，该技术可实现肺脏的常温保存、肺功能评估，并对过去认为不适合移植的肺脏进行修复和再调节4,5,6。
随着体外肺灌注（EVLP）在大型移植中心的建立，肺移植的数量不断增加，肺脏保存与修复策略也因此受到越来越多的关注。在此背景下，面对伦理和后勤方面的挑战，以及与肺移植相关的免疫学因素的研究需求，啮齿类动物EVLP模型的开发变得尤为重要，这得益于其可靠性、可进行基因操作的可能性以及较低的成本7,....
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方案
动物实验按照大学健康网络动物护理委员会批准的动物使用方案进行。雄性Lewis大鼠（255-330 g）被给予 随意摄取 自由饮水和进食。随后，将它们置于受控环境（18–22 °C）中，保持12小时昼夜循环。参见 材料表 有关本方案中使用的所有材料、溶液和仪器的详细信息。
1. 初始化 离体 肺灌注系统
- 确保所有传感器已连接至隔离的器官灌注设备和数据采集系统（图1），然后打开数据采集软件。
- 灌注前，用150 mL Steen溶液填充体外肺灌注（EVLP）回路，该溶液需添加1,000 USP单位的肝素钠、50 mg头孢唑林和50 mg甲泼尼龙。
- 将温水浴设置为20 °C，开始循环温水以预热整个EVLP系统。
2. 供体肺获取手术步骤
- 通过腹腔注射氯胺酮（50 mg/kg）和赛拉嗪（5 mg/kg）对大鼠进行麻醉，或根据当地操作规范实施麻醉，并通过脚趾夹捏反射确认麻醉深度。在整个操作过程中，使用眼用润滑剂防止角膜干燥，并使用加热垫或等效系统维持动物体温，直至器官摘取。
- 进行经口气管插管（使用14 G静脉导管）。....
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结果
所有冷缺血时间（CIT）在20分钟至18小时之间的肺均能够完成4小时的灌注（图2）13。大多数组别的肺顺应性保持稳定，但18小时CIT组在4小时灌注期间顺应性逐渐下降（图2A）。尽管如此，各组之间的血管阻力、肺移植物氧合能力及葡萄糖水平均未观察到显著差异（图2B-D）。乳酸水平随时间上升，组间存在差异，且随着CIT延长呈升高趋势（图2E）。灌注液电解质水平在各组间相似（图2F-H）。在体外肺灌注（EVLP）结束时，CIT不超过18小时的各组间肺水肿形成程度无显著差异；而24小时CIT则导致较严重的肺水肿13。EVL.......
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讨论
本研究描述了建立大鼠离体肺灌注（EVLP）方案所需的必要步骤。在此，我们证明供体肺在4°C下进行长达18小时的冷静态保存后，仍可灌注4小时。该结论通过评估肺顺应性、肺血管阻力、灌注液中葡萄糖/乳酸浓度以及P/F比值得以证实。
体外肺灌注（EVLP）平台作为评估肺功能和移植肺修复的重要工具，已促使多个研究团队开发大鼠EVLP模型。由于大鼠模型成本较低且便于进行生物学操作，可减少样本差异、缩短实验周期，并为概念验证提供广泛的可能性，因此这些研究工作具有充分的合理性。然而，建立稳定可靠的大鼠EVLP操作方案仍具挑战性，已有文献报道在EVLP进行4小时之前难以维持稳定的灌注状态，并出现肺功能下降的情况9,11,13,14,15,
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披露
MC 是 Traferox Technologies Inc 的股东，并担任 Lung Bioengineering Inc 的顾问。MC 收到了来自 Beyond Air Inc. 和 Synklino 的研究资助。作者声明，本文报道的结果未受到任何竞争利益的影响。
致谢
图1 使用 BioRender.com 制作（已确认出版和授权权利［协议：BT25KGSKWF］）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 14 G 静脉导管 | BD | 381167 | 经口气管插管 |
| 16 G 静脉导管 | BD | 381157 | 肺冲洗导管 |
| 2-0 缝合线 Sofsilk | Covidien | S-305 | 气管插管固定 |
| 3-0 缝合线 Sofsilk | Covidien | S303 | 动脉和心房插管固定 |
| IPL-2 核心离体灌注肺系统（大鼠用） | Harvard Apparatus | 734276 | 离体肺灌注（EVLP）系统 |
| 氯胺酮（Narketan） | Vetoquinol | 440894 | 镇静/麻醉 |
| 大肺动脉插管 | Harvard Apparatus | 73-0711 | |
| 左心房插管 | Harvard Apparatus | 73-0712 | |
| 低钾右旋糖酐葡萄糖溶液（Perfadex） | XVIVO | 19811 | 保存液 |
| 甲基泼尼松龙琥珀酸钠（SOLU-MEDROL） | Pfizer | 14705 | 抗炎 |
| 前列腺素 E1（Prostin VR） | Pfizer | RX297945 | |
| 小型动物呼吸机（型号 683） | Harvard Apparatus | 55-0000 | |
| 肝素钠 | Leo Pharma | 453811 | |
| Steen 溶液 | XVIVO | 19004 | EVLP 期间用于肺灌注的缓冲细胞外溶液 |
| Sugita 动脉瘤夹（弯曲型） | Mizuho | 07-940-86 | 气管夹 |
| 气管插管 | Harvard Apparatus | 73-3384 | |
| 赛拉嗪（Rompun） | Bayer Healthcare | 2169592 | 镇静/麻醉 |
参考文献
- Chambers, D. C., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-eighth adult lung transplantation report — 2021; Focus on recipient characteristics. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 40
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