建立一种 离体 用于肺移植转化研究的大鼠肺灌注模型

摘要

本文描述了建立大鼠离体肺灌注（EVLP）模型所需的必要步骤，并展示了灌注肺组织相关的炎症特征。目的是传播有关大鼠EVLP模型的知识与经验，促进对这一革命性技术所涉及的生物学反应的全面理解。

摘要

自肺移植作为晚期肺部疾病的治疗策略确立以来，科学界一直面临可用于供体捐献的肺脏数量不足的问题。然而，在最近几十年中，随着体外肺灌注（ex vivo lung perfusion, EVLP）技术的发展，这一局面已得到积极改善。EVLP作为一种评估和修复边缘性肺脏的策略，已在大型移植中心得到应用，不仅提高了肺功能诊断的准确性，还为肺移植物的修复提供了有效平台，从而促进了肺移植数量的增加。在此背景下，面对伦理和后勤方面的挑战，以及与肺移植相关的免疫学因素研究需求，啮齿类动物EVLP模型的建立变得尤为重要，因其具有可靠性高、可进行基因操作以及成本较低等优势。本文介绍了一种建立大鼠EVLP模型的实验方案，并展示了灌注肺脏相关的炎症特征。这将有助于推广关于大鼠EVLP模型的知识，深化我们对这一革命性技术所涉及生物学反应的理解。

引言

肺移植已被公认为治疗终末期肺疾病的治疗策略，在过去几十年中，随着外科技术与免疫抑制方案的改进，其疗效不断提升。尽管临床需求很高，但合适的已故肺脏供体数量却低于其他实体器官，导致肺移植手术的开展数量相对较少^1,2,3。为缓解供体短缺问题，医学界已逐步扩大肺脏捐献的标准，使过去被认为不可用的器官转变为潜在的可移植器官。然而，扩大标准的同时也需付出更多努力，以更好地理解并干预来自供体器官可能引发的全身性后果。离体肺灌注（EVLP）技术应运而生，该技术可实现肺脏的常温保存、肺功能评估，并对过去认为不适合移植的肺脏进行修复和再调节^4,5,6。

随着体外肺灌注（EVLP）在大型移植中心的建立，肺移植的数量不断增加，肺脏保存与修复策略也因此受到越来越多的关注。在此背景下，面对伦理和后勤方面的挑战，以及与肺移植相关的免疫学因素的研究需求，啮齿类动物EVLP模型的开发变得尤为重要，这得益于其可靠性、可进行基因操作的可能性以及较低的成本^7,8,9。本文描述了建立大鼠EVLP模型所需的各个步骤，并展示了灌注肺组织相关的炎症特征。

方案

动物实验按照大学健康网络动物护理委员会批准的动物使用方案进行。雄性Lewis大鼠（255-330 g）被给予 随意摄取 自由饮水和进食。随后，将它们置于受控环境（18–22 °C）中，保持12小时昼夜循环。参见 材料表 有关本方案中使用的所有材料、溶液和仪器的详细信息。

1. 初始化  离体 肺灌注系统

1. 确保所有传感器已连接至隔离的器官灌注设备和数据采集系统（图1），然后打开数据采集软件。
2. 灌注前，用150 mL Steen溶液填充体外肺灌注（EVLP）回路，该溶液需添加1,000 USP单位的肝素钠、50 mg头孢唑林和50 mg甲泼尼龙。
3. 将温水浴设置为20 °C，开始循环温水以预热整个EVLP系统。

2. 供体肺获取手术步骤

1. 通过腹腔注射氯胺酮（50 mg/kg）和赛拉嗪（5 mg/kg）对大鼠进行麻醉，或根据当地操作规范实施麻醉，并通过脚趾夹捏反射确认麻醉深度。在整个操作过程中，使用眼用润滑剂防止角膜干燥，并使用加热垫或等效系统维持动物体温，直至器官摘取。
2. 进行经口气管插管（使用14 G静脉导管）。插管后，将气管导管连接至小动物呼吸机系统，以潮气量10 mL/kg、呼吸频率60次/分钟、吸入氧浓度（FiO₂）0.5、呼气末正压（PEEP）2 cmH₂O的参数对大鼠进行通气。
3. 将大鼠置于仰卧位。
4. 在无菌 剪刀和镊子的辅助下，进入腹腔并向上延伸切口，行正中腹切开术，同时向门静脉注射肝素钠（400 USP单位）。
5. 随后经剑突进入胸腔，通过切除胸骨前部并小心地放射状切开膈肌，避免损伤肺组织，完成胸骨切开术。
6. 为获取心肺组织块，于下腔静脉（IVC）和左心尖部沿长轴做切口。
7. 使用显微剪刀在右心室流出道前壁做切口，随后将18 G静脉导管插入肺动脉干，并用20 mL含10 µg/mL前列腺素E1的低钾右旋糖酐（LPD）溶液灌洗肺脏。
8. 灌洗完成后，于吸气末夹闭气管下三分之一段，以保持肺脏处于膨胀状态。
9. 摘取心肺组织块并将其置于LPD溶液中保存。
   ​注意：肺移植物可根据研究目的在不同温度和时间间隔下保存。此处展示的是在冰上经历不同冷缺血时间（CIT）的肺组织的代表性结果。

3. 离体 肺灌注实验步骤

1. 在主肺动脉（PA）下方及心室周围放置一根0号丝线结扎线，并预先打结以方便插管。
2. 将PA插管连接至体外肺灌注（EVLP）系统的流入管路，启动蠕动泵，设置为维持流量的10%，以排出PA插管中的任何空气。
3. 将流入插管置入主肺动脉（外径：2.0 mm/头端直径：2.5 mm）并固定，随后将引流插管从心尖经二尖瓣插入左心房（LA-头端直径：4.0 mm），用于后续灌注。使用镊子扩张二尖瓣，以利于插管操作。
4. 在气管上打一小孔，插入气管插管（外径：2.0 mm/长度：14 mm），然后将其连接至系统的通气管路。
5. 将左心房（LA）插管连接至系统的流出管路。
6. 注意：我们以维持流量的10%作为灌注起始点。为避免向肺部引入气泡，需确保除泡装置已充满液体。
7. 逐步增加灌注流速，直至达到心输出量（CO）的20%。
   注意：为灌注双肺，我们采用250 g大鼠的估计心输出量为75 mL/min^10,11。根据我们的临床EVLP方案¹²，灌注流速在1小时内逐步增加至目标值。灌注参数总结于表1¹³中。
8. 灌注开始20分钟后移除气管夹，启动肺通气，同时开始EVLP气体（8% CO₂、6% O₂、86% N₂）的流动，以维持灌注液流入端PCO₂在35至45 mmHg之间。
   ​注意：通气参数总结于表1¹³中。

4. 参数与样本管理

1. 在EVLP期间，每小时实时记录动态肺顺应性和肺血管阻力（PVR）。
   注意：在生理评估前5分钟，应将肺膨胀至设定的充气压力。
2. 每小时从取样口采集灌注液样本，并在液氮中速冻，用于后续分析。
   注意：此外，我们在评估前5分钟进行一次肺复张操作（最高达20 cmH₂O），之后采集灌注液进行血气分析，以测定pH、PCO₂、PO₂、电解质、葡萄糖和乳酸。
3. 停止灌注，并夹闭气管以保持肺处于膨胀状态。随后取出肺组织样本，置于液氮中速冻，或放入固定液中，用于后续研究。
   注意：此处肺灌注持续了4小时。

结果

所有冷缺血时间（CIT）在20分钟至18小时之间的肺均能够完成4小时的灌注（图2）¹³。大多数组别的肺顺应性保持稳定，但18小时CIT组在4小时灌注期间顺应性逐渐下降（图2A）。尽管如此，各组之间的血管阻力、肺移植物氧合能力及葡萄糖水平均未观察到显著差异（图2B-D）。乳酸水平随时间上升，组间存在差异，且随着CIT延长呈升高趋势（图2E）。灌注液电解质水平在各组间相似（图2F-H）。在体外肺灌注（EVLP）结束时，CIT不超过18小时的各组间肺水肿形成程度无显著差异；而24小时CIT则导致较严重的肺水肿¹³。EVL...

讨论

本研究描述了建立大鼠离体肺灌注（EVLP）方案所需的必要步骤。在此，我们证明供体肺在4°C下进行长达18小时的冷静态保存后，仍可灌注4小时。该结论通过评估肺顺应性、肺血管阻力、灌注液中葡萄糖/乳酸浓度以及P/F比值得以证实。

体外肺灌注（EVLP）平台作为评估肺功能和移植肺修复的重要工具，已促使多个研究团队开发大鼠EVLP模型。由于大鼠模型成本较低且便于进行生物学操作，可减少样本差异、缩短实验周期，并为概念验证提供广泛的可能性，因此这些研究工作具有充分的合理性。然而，建立稳定可靠的大鼠EVLP操作方案仍具挑战性，已有文献报道在EVLP进行4小时之前难以维持稳定的灌注状态，并出现肺功能下降的情况^{9,11,13,14,15,}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
14 G 静脉导管	BD	381167	经口气管插管
16 G 静脉导管	BD	381157	肺冲洗导管
2-0 缝合线 Sofsilk	Covidien	S-305	气管插管固定
3-0 缝合线 Sofsilk	Covidien	S303	动脉和心房插管固定
IPL-2 核心离体灌注肺系统（大鼠用）	Harvard Apparatus	734276	离体肺灌注（EVLP）系统
氯胺酮（Narketan）	Vetoquinol	440894	镇静/麻醉
大肺动脉插管	Harvard Apparatus	73-0711
左心房插管	Harvard Apparatus	73-0712
低钾右旋糖酐葡萄糖溶液（Perfadex）	XVIVO	19811	保存液
甲基泼尼松龙琥珀酸钠（SOLU-MEDROL）	Pfizer	14705	抗炎
前列腺素 E1（Prostin VR）	Pfizer	RX297945
小型动物呼吸机（型号 683）	Harvard Apparatus	55-0000
肝素钠	Leo Pharma	453811
Steen 溶液	XVIVO	19004	EVLP 期间用于肺灌注的缓冲细胞外溶液
Sugita 动脉瘤夹（弯曲型）	Mizuho	07-940-86	气管夹
气管插管	Harvard Apparatus	73-3384
赛拉嗪（Rompun）	Bayer Healthcare	2169592	镇静/麻醉