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训练实验室兔以优化常规饲养管理操作

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DOI：

10.3791/66008

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2024年2月16日

 ,  ,  , 
1German Centre for the Protection of Laboratory Animals (Bf3R), German Federal Institute for Risk Assessment

本文内容

摘要

已制定并验证了在兔子日常饲养管理操作中采用正向强化的训练方案，结果表明该方案是成功的，因为兔子在每周的常规检查中均能稳定地表现出所训练的行为。使用运输箱抓取兔子比传统的抓取方法更不易引起动物的应激反应。

摘要

非厌恶性操作与训练技术在实验动物管理中至关重要，有助于促进实验及常规饲养操作，同时提升动物福利与科研质量。本研究采用响片训练法，为家兔建立训练方案，以优化通常因抓举（即从地面拾起）或约束（即被人抱在怀中）而引发应激的常规饲养操作。13只雌性新西兰白兔接受了为期三周的训练。所有家兔均学会了预设的目标行为：跟随目标棒、跳上称重台、进入运输箱，并以后肢直立、前肢搭在训练员手上的姿势站立。此外，其中10只动物能够从地面跳到坐着的训练员腿上，并在训练员腿上就座时允许训练员将其前肢抬离表面。对于部分个体，需增加额外的中间步骤以调整训练方案。训练结束时，即使经过短期或长期的训练间歇，家兔仍能稳定表现出预期的目标行为。除少数例外情况外，除训练员外的熟悉人员也能够引发家兔的目标行为（泛化），但实现泛化仍需额外训练。在自主接近测试中，家兔更倾向于与训练员互动st 试验中，但与陌生人相处的时间与和训练者相处的时间一样长nd 试验。行为观察表明，按照本方案所述，使用运输箱捕捉兔子，而不是抓住其颈背部皮肤并将其托在手臂上，对兔子的负面影响更小。总体而言，这些训练方案切实可行，可作为实验动物设施中的优化策略。出于动物福利的考虑，应尽可能应用这些训练方案。

引言

2015年至2019年间，欧盟（及挪威）共有超过4900万只动物被用于科学目的，其中兔子为1,745,037只（占3.5%）1兔子主要用于法规性研究（如质量控制、毒理学及其他安全性测试，包括药理学）以及生物制品的常规生产（如血液制品）2尽管人们已努力以无动物方法替代动物实验，但某些研究目的仍需使用动物。当动物实验无法被替代时，至关重要的是减少使用动物的数量，并优化实验过程以及饲养和管理条件，以最大程度减轻动物痛苦。Russel 和 Burch 于 1959 年将这一策略描述为“3R 原则”（替代、减少、优化）3 并于2010年被纳入欧盟关于用于科学目的的实验动物保护的指令2010/63/EU4“3R原则中精炼化的角色，有时被称为‘3R中的灰姑娘’”5，其重要性日益凸显。尽管替代和减少动物使用是实现指令最终目标——全面取代动物实验——的长期策略，优化措施却能够立即改善动物福利。5，这反过来有可能提高科学质量6动物操作与训练是优化措施的关键组成部分，这一点在欧盟指令2010/63/EU附件III中已明确指出。该指令规定，动物设施应针对实验动物的物种、实验程序及研究项目，设计相应的适应性驯化与训练方案。4. 欧洲药典标准第123号附录A建议，实验动物工作人员应投入时间 "与动物交谈、接触、训练和护理"7.

某些操作程序会引起动物应激反应，尤其是对兔子等陆生猎物动物而言。例如，在进行健康检查或实验操作时，动物被逼入角落、受到束缚（即被人抓握、抱在怀中或被器械固定）以及被提起（即从地面被拾起）等情况均可能引发应激8。一项针对宠物兔的调查显示，57%至61%的兔子在被提起时会出现挣扎行为9,10，部分个体甚至表现出与恐惧相关的攻击行为（例如咬人）11。这凸显了采用温和操作和训练技术的重要性。已有研究表明，在小鼠等其他小型哺乳动物中，温和的操作技术可降低其焦虑水平12。此外，温和操作结合训练能够减少小鼠的应激、焦虑以及类抑郁行为13。在恒河猴和黑猩猩中，若动物事先接受过相关操作的训练，则其与应激相关的生理指标变化较小14,15。可以推测，如果动物能够自主选择是否参与训练，它们便能主动参与并掌控所处情境，从而改善动物福利，并可能有助于获得更稳健、可靠的科学数据16。

许多动物训练程序依赖于操作性条件反射原理，尤其是正向强化和行为塑造17,18,19。操作性条件反射要求动物产生某种行为，随后该行为可被增强或减弱20。描述操作性条件反射的常见四种依随关系包括：正向强化、负向强化、正向惩罚和负向惩罚21,22。在兔子训练中，当人接近动物（非期望刺激）以驱使其远离或移向某一特定位置时，即使用了正向惩罚23。在实验台上操作兔子的情境中，负向强化的一个例子是当兔子保持静止时，解除对其身体施加的压力（非期望刺激）；负向惩罚的例子则是当兔子开始挣扎时，撤除食物奖励（期望刺激）。在动物训练中，不推荐使用正向/负向惩罚或负向强化。惩罚会引起负面情绪反应24，例如在犬类中观察到的痛苦表现25。相反，正向强化应作为动物训练的首选方法25,26。正向强化训练（PRT）是指在动物表现出期望行为后，给予一种期望刺激（如食物奖励），从而提高该动物未来再次表现该期望行为的可能性27。PRT 通常涉及使用条件性强化物。条件性强化物（次级强化物）通常是一种中性刺激，例如某种声音，动物通过学习将其与非条件性强化物（初级强化物，如食物奖励）关联起来28。当动物表现出期望行为后，立即呈现条件性强化物，随后给予食物奖励26。PRT 的一个著名例子是响片训练，其中使用响片发出“咔哒”声作为次级强化物26。

训练应遵循可预测的模式，这可通过设计训练方案来实现。训练方案描述了如何逐步达到目标行为（即行为塑造），其中每一步都由客观标准定义，并应易于完成26。如果训练遵循特定的方案，则实验室动物工作人员可以轮换进行动物训练。需要注意的是，相关人员必须了解学习原理和训练技术，才能正确地加以应用26。动物训练通常包含行为塑造。行为塑造法最早由斯金纳（Skinner）及其同事在20世纪40年代初有意使用29。相比之下，在此前的研究中，斯金纳更关注"对物理环境进行微小改变，以实施逐步逼近的程序"29。他在《科学美国人》杂志发表的一篇文章中解释道，强化某种行为会增加该行为被重复的可能性，这"使得塑造动物行为几乎如同雕塑家塑造一块黏土一般"30。自那时起，行为塑造在圈养动物中的重要性日益增加29,30,31,32。为了复制和改进行为塑造方案，以系统且客观的方式评估这些方案至关重要33,34,35,36。

Pfaller-Sadovsky 等人最近发表的一项系统综述与荟萃分析发现，条件性强化研究最常在马和狗中进行，但猫、牛、鱼、山羊以及非人灵长类动物也已被研究37。在实验动物科学领域，阳性强化训练（PRT）被广泛应用于非人灵长类动物38,39,40和狗41,42。此外，在实验室环境中，猪43、山羊44以及小型哺乳动物如小鼠13和大鼠45,46,47也已成功通过使用响片进行训练。据作者所知，针对实验兔的 PRT 应用报道仍极为罕见48；数十年前发表的现有同行评审文献已过时，无法满足现代伦理研究的标准。尽管一些非同行评审的信息表明，兔子可通过 PRT 成功训练49，但在实验动物设施中饲养的兔子适用训练方案方面，目前仍缺乏系统知识。其潜在原因可能多种多样。例如，研究文章中可能未详细描述所使用的训练技术，或相关数据是为监管性研究生成因而未予发表。此外，由于小鼠和大鼠在科研中使用更为频繁，兔子可能并未成为优化研究的主要关注对象。由于兔子能够极好地掩饰压力与不适，其在被操作时的负面情绪状态常常未被识别。兔子的体型使得人类可在操作过程中徒手固定这些动物，而其他物种如非人灵长类动物若以类似方式徒手约束，则可能导致严重伤害50。然而，这些事实不应成为阻碍实验兔 PRT 方案开发与共享的理由。

关于PRT的潜在益处，研究人员首次尝试填补实验室兔适用训练方案方面的知识空白。为了便于进行日常操作，如抓取、健康检查和称重，研究开发了训练方案，并评估了这些方案对雌性新西兰白兔的可行性。通过比较分析，评估训练方案中描述的替代抓取技术是否比传统抓取技术更具温和性，以及这些训练方案是否可作为优化动物福利的改进措施。 图1展示了本研究的时间安排。

动物维持

从商业渠道获得13只雌性新西兰白兔（到达动物设施时年龄约为七周）。这些动物无费拉萨（FELASA）建议所列的所有病毒、细菌和寄生虫病原体。51穿戴防护服和设备（手套、口罩、发网）以执行本方案的步骤。分别将六只和七只动物共同饲养在面积为 2.8 m × 2.8 m 的地面围栏（地面饲养）中。地面铺有细碎的片状木屑垫料（经高压灭菌）。此外，在垫料上方撒有筑巢材料和纸棉。提供三个带两个开口的塑料屋（37 cm × 60 cm；高 30 cm）和一个塑料隧道（长度：58 cm；直径：16 cm）作为遮蔽所。另提供 enrichment 物品，如木制啃咬块、干草和柳枝球，以及装有饲料颗粒的零食球（移动时颗粒会掉落）。兔子可自由获取自来水、颗粒饲料、高压灭菌的干草和稻草。有关饲料和 enrichment 物品的更多信息列于 材料表动物房每周四进行清洁。

兔子在标准条件下饲养（室温和相对湿度以均值±标准差表示：20.3 ± 0.4 °C 和 50 ± 5 %），光照周期为12:12小时明暗循环（人工光源辅以自然日光）。在每日光照阶段开始前30分钟打开收音机，持续约8小时，以使兔子适应周围环境噪音。

方案

动物饲养工作已获得柏林州政府机构（"Landesamt für Gesundheit und Soziales"，许可证编号：ZH3 - 德国联邦风险评估研究所，柏林）的批准。训练方案是在常规动物饲养管理框架内制定的，旨在优化操作流程，例如动物抓取、健康检查和称重。由于训练方案未引起任何疼痛、痛苦或伤害，且所有观察均在常规动物饲养管理过程中进行，根据欧洲立法，本研究不被视为动物实验。

1. 培训的一般要求

注意：以下要点通常适用于动物训练，与本方案无关。

  1. 对动物进行清晰标记以用于识别。
  2. 确保准备高质量的奖励物，例如适口性极佳的食物。
  3. 制定训练计划，包括通向目标行为的所有步骤，即动物应表现出的期望行为。
    注意：目标行为应通过逐步塑造完成，每一步骤均需有明确的客观标准，且应易于实现。
  4. 确定动物需成功完成80%还是100%的训练步骤后，方可进入下一步训练。
  5. 准备好记录文档（例如，补充表1）。
  6. 避免在匆忙时进行训练，并注意自身举止、语调和动作速度，即应轻声、平静地说话，缓慢且可预测地移动。
  7. 测试前一次训练中已训练的步骤。
  8. 当动物整体健康状况不佳和/或对与训练者互动缺乏兴趣时，不应进行训练。

本方案的训练流程

注意：以下训练程序是为本方案所定义的。

  1. 在动物房/栏内设置训练区域（图2）并根据训练目标行为的需要，将秤或转运箱（底面 30 cm × 50 cm；门 27 cm × 25.5 cm；盖子上开孔 16 cm × 39 cm）放置在实验区域内。
  2. 将秤和运输箱放置在实验区域外，以便在目标行为开始前使兔子熟悉这些新物体 "称重" 和 "转运箱" 经过培训。
  3. 对于目标行为（见步骤6-9），按照步骤5.7所述，将兔子带入训练区域。
  4. 坐在地板上，或在训练区域使用矮凳/台阶就座。
  5. 依次按照方案中描述的顺序训练各个目标行为，而非同时进行。若动物连续两天未能学会某一目标行为的某个步骤，则可例外，同时训练下一个目标行为。若调整目标行为的顺序有利于个体的训练进程，则可改变训练顺序。
  6. 在适应环境并引入点击器后，开始对所有动物进行1的训练st 目标行为的步骤 "靶向之后" （即目标棒末端的球体被定义为目标）。注意，根据每只动物的个体表现，它们在当天可能达到不同的训练阶段。在接下来的几天中，根据动物的个体进展继续训练。
  7. 每周每个工作日安排一次培训课程（例如，每组六到七只动物约需30分钟）。
    注意：当训练员进入动物房间/围栏并准备开始训练时，训练环节即为开始。当所有兔子均未参与（或不再参与）训练，或所有兔子均已达到本环节目标行为的最终训练步骤时，训练环节结束。每次训练环节应从该方案中上一次成功的步骤开始。每个训练环节包含每只动物至少一次或多次试验。
  8. 开始一次训练时，让动物执行特定的训练步骤（例如，在兔子学会用鼻子/嘴触碰目标后进行步骤3.1），当动物不再参与训练或已达到目标行为的最终训练步骤时，结束本次训练。训练结束时，打开训练区域，引导兔子离开训练场；然后将目标棒（目标端朝向天花板）和奖励碗置于胸前。
  9. 在喂食、清洁、治疗或实验操作之前安排训练。
  10. 使用带有集成式点击器的奖励碗（图3, 补充编码文件 1以及针对某些目标行为的额外目标棒。
  11. 用适口性食物填满奖励碗，例如葵花籽和以谷物为基础的觅食零食。
    注意：兔子是食叶动物，这些奖励示例并非最佳选择；然而，由于实验动物设施内的卫生限制，这些是目前可提供的最佳替代方案。如果条件允许，应优先选用新鲜香草作为食物奖励。需注意，只有当兔子真正偏爱某种物品时，它才能成为有效的奖励。
  12. 确保始终将奖励碗放在同一位置，例如胸前，并且只有在发出“咔哒”声后才开始将奖励碗移向兔子。目标行为除外 "饲养" 和 "跳到膝上"一手持目标棒，另一手持奖励碗。
  13. 在兔子正确表现出目标行为时，立即将奖励呈现在其鼻部/口部所处的位置。
  14. 注意在给予奖励时，让兔子仅摄入少量食物。
  15. 如果一只兔子在连续五次尝试中有至少四次表现出目标行为（成功率80%），则进入下一步。若动物无法完成下一步操作（即失败超过一次），则返回到该方案的前一步。如果需要返回前一步，或兔子未参与训练，应修订训练方案（例如，设定更小的训练步骤），更换另一种（更适口的）食物奖励，或检查训练人员的训练技能。
  16. 如果一只兔子正确完成了目标行为的最后一步训练，则应在当天结束对该兔子的训练。
  17. 打印记录表（补充文件 1），详细的训练方案以及简化的训练方案（补充文件 2）并将其固定在剪贴板上或在平板电脑上打开。使用记录表记录每只动物在各次训练中达到的训练步骤。

3. 情境性条件作用/习惯化

注意：情境条件化/适应性训练由训练员和动物饲养员每天进行，每组兔子约持续15分钟，连续五天（周一至周五）。

  1. 轻声与兔子交谈。
  2. 提供适口性好的食物作为奖励。
    注意：需注意兔子饮食的突然变化可能引起消化问题，因此应逐步引入新的食物奖励。
  3. 将装有适口性好食物的食碗移向兔子，让它们从中进食。
  4. 在不束缚兔子的情况下，轻柔地触摸其颈部、肩部、背部和臀部。

4. 引入点击器

注意：目标行为：在听到咔嗒声后，靠近训练者并从碗中取食奖励食物。目标是让兔子将食物奖励与咔嗒声关联起来，即兔子在听到咔嗒声后取食奖励食物。

  1. 让兔子靠近。
  2. 点击一次，然后将奖励碗移向兔子（称为“点击并给予奖励”或 C 和 T）。
  3. 重复步骤 4.2 十次。第十次点击时，延迟一秒钟再给予奖励，并观察兔子的行为。
    注意：如果动物在点击后立即寻找奖励，则可认为次级强化物的条件反射已成功建立。
  4. 如果兔子在点击后至少八次未食用食物奖励，则于次日重复步骤 4.1–4.3。

5. 跟踪目标

注意：目标行为：用鼻子/嘴跟随并触碰目标。第6-9节中的目标行为是第5节中所述目标行为的变体。

  1. 将目标物置于兔子的鼻/口附近。
    注意：目标棒末端的球体定义为目标。
    1. 当兔子用鼻子/嘴接触目标时记录 C 和 T。
      注意：确保兔子的鼻/口仅接触球部，不得在任何非指定位置接触棒体。
    2. 在奖励的同时将目标从兔子的视野中移除。
    3. 重复上述所有步骤五次，直至兔子在五次中有至少四次成功完成该步骤（成功率为80%）。
  2. 将目标物体放置在另一个位置，使动物仅通过头部运动（无需移动整个身体）即可用鼻部或口腔触碰到。
    1. 当兔子用鼻子/嘴触碰目标时，记录 C 和 T，并执行步骤 5.1.2 和 5.1.3。
  3. 将目标物体放置在距离兔子较远的位置，让兔子伸展身体朝向它。
    1. 当兔子用鼻子/嘴触碰目标时，记录 C 和 T，并执行步骤 5.1.2 和 5.1.3。
  4. 进一步增加目标物与兔子之间的距离，使动物需要跳跃一次才能到达目标物。
    1. 当兔子用鼻子/嘴触碰目标时，记录 C 和 T，并执行步骤 5.1.2 和 5.1.3。
  5. 将目标物体置于兔子鼻部/嘴部正前方，使兔子能够触碰到目标，然后缓慢将目标从兔子处移开。确保兔子需通过数量不等的跳跃才能跟随目标。
    注意：在五次尝试的区块中，第1次st, 2nd, 3rd, 4th，以及 5th 兔子分别在跳跃2次、1次、2次、3次和2次后得到奖励（平均：每跳跃2次后奖励一次）。
    1. 当兔子完成所需跳跃次数时，执行步骤 5.1.2 和 5.1.3。
  6. 重复步骤 5.5，将目标物体在两个物体之间的通道中移动。
    注意：此步骤中，将两个物体（如隧道）相互平行放置，形成一条走廊。
    1. 当兔子完成所需跳跃次数时，执行步骤 5.1.2 和 5.1.3。
  7. 重复步骤5.5，将目标物移向训练区域，使兔子进入其中。
    1. 当兔子完成所需跳跃次数后，进行 C 和 T，并执行步骤 5.1.2 和 5.1.3。

6. 称重

注意：目标行为：在体重秤上停留至少一秒钟。 如果秤面过于光滑，可在其上方放置防滑垫。但有些兔子倾向于啃咬该垫子。

  1. 按照步骤5.5所述，使用目标棒引导兔子走向秤。
    1. 当兔子用鼻子/嘴接触目标时，按 C 和 T 键。
    2. 在奖励的同时将目标从兔子的视野中移除。
    3. 重复上述所有步骤五次，直至兔子在五次中有至少四次成功完成该步骤（成功率为80%）。
  2. 将目标物略微移至刻度上方，使兔子以前肢踏上秤台，并用鼻/口接触目标物。
    1. C 和 T，并执行步骤 6.1.2 和 6.1.3。
  3. 将目标物略微移过秤的中心，使兔子用前爪踏上秤面，并伸展身体越过秤面，用鼻子或嘴触碰目标物。
    1. C 和 T，并执行步骤 6.1.2 和 6.1.3。
  4. 将目标物移至秤的中心更远处，使兔子用前爪和后爪站在秤上，并用鼻子/嘴触碰目标物。
    1. C 和 T，并执行步骤 6.1.2 和 6.1.3。
  5. 按照4.4节所述，将兔子引导至秤上，等待数秒后读取C和T值。
    注意：在此步骤中，在兔子于秤上静坐不定时间段后给予奖励。在连续五次尝试的一个区块中，第1次st, 2nd, 3rd, 4th，以及 5th 时间分别为0.5、1.0、2.0、0.5和1.0秒（平均1.2秒）后，给予兔子奖励。在此期间，若兔子保持静止，即可从天平读取体重。若天平需要更长时间才能稳定并完成体重测量，应延长动物在天平上的停留时间。
    1. C 和 T，并执行步骤 6.1.2 和 6.1.3。

7. 进入转运箱

注意：目标行为：进入并离开运输箱。训练期间使用一个运输箱（底面尺寸 30 cm × 50 cm；门洞尺寸 27 cm × 25.5 cm），箱盖顶部设有开口（16 cm × 39 cm），底部铺有污染过的垫料。

  1. 如步骤 5.5 所述，使用目标棒引导兔子走向箱子。
    1. 当兔子位于箱子入口前方时进行 C 和 T。
    2. 在奖励的同时，将目标棒移出兔子的视野范围。
    3. 重复上述所有步骤五次，直至兔子在五次中有至少四次成功完成任务（成功率为 80%）。
  2. 将目标棒从箱盖开口处伸入，并移入箱内，以此引导兔子前肢进入箱内。
    1. 进行 C 和 T，并执行步骤 7.1.2 和 7.1.3。
  3. 执行步骤 7.2，引导兔子完全进入箱内（即前肢和后肢均进入箱内）。
    1. 进行 C 和 T，并执行步骤 7.1.2 和 7.1.3。
  4. 执行步骤 7.3，将箱子的门关闭数秒，然后再次打开门。
    1. 进行 C 和 T，并执行步骤 7.1.2 和 7.1.3。
  5. 执行步骤 7.5，将箱子轻轻抬起一小段距离（即离地面几厘米），然后将箱子放回地面，并打开门。
    1. 进行 C 和 T，并执行步骤 7.1.2 和 7.1.3。
  6. 执行步骤 7.5，然后使用目标棒引导兔子从箱内走出。
    1. 进行 C 和 T，并执行步骤 7.1.2 和 7.1.3。

8. 培养

注意：目标行为：直立时将前爪放在手心上。训练期间，用同一只手同时握住目标棒和奖励碗。

  1. 将目标物置于兔子头部上方，使兔子伸长鼻子向上触碰目标物的鼻/口部，同时四肢均保持在地面上。
    1. C 和 T。
    2. 在给予奖励的同时，将目标物移出兔子的视野范围。
    3. 重复上述所有步骤五次，直至兔子在五次中有至少四次成功完成该步骤（成功率为 80%）。
  2. 如步骤 8.1 所述，将目标物置于兔子头部上方。当兔子向上伸长鼻子后，将目标物进一步向上移动，使兔子前肢离地并用鼻/口部触碰目标物。
    1. C 和 T，并执行步骤 8.1.2 和 8.1.3。
      注意：如果兔子无法完成步骤 8.2，可在 8.2 之后增加一个过渡步骤。具体操作为：执行步骤 8.2 后，用空出的手掌接近并触碰兔子的前肢（掌面）。然后进行 C 和 T，并执行步骤 8.1.2 和 8.1.3。
  3. 将空出的手掌置于兔子前方，并将目标物移至兔子头部上方，使兔子将前肢放在手掌上，同时用鼻/口部触碰目标物。
    1. 在兔子将前肢放上手掌后一秒钟进行 C 和 T，并执行步骤 8.1.2 和 8.1.3。
      注意：当兔子的前肢放在训练者的手掌上时，可对其腹部进行目视检查。

9. 在膝上跳跃

注意：目标行为：跳到训练员腿上并保持坐姿，同时接受触摸。在执行步骤 9.5–9.9 时，需用同一只手同时握住目标棒和奖励碗，因为另一只手需要用于触摸兔子。

  1. 按照第5.5步方案所述，使用目标棒引导兔子靠近训练员。
    1. 当兔子用鼻子/嘴触碰目标时，进行C和T。
    2. 在给予奖励时，将目标从兔子的视野中移开。
    3. 重复上述所有步骤五次，直至兔子在五次中至少成功完成四次（成功率为80%）。
  2. 将目标移至训练员腿部上方，使兔子将前爪放在训练员腿上，以便用鼻子/嘴触碰目标。
    1. C和T，并执行步骤9.1.2和9.1.3。
  3. 将目标移至训练员腿部上方并稍远离兔子，使兔子将前爪放在训练员腿上并向前伸展，用鼻子/嘴触碰目标。
    1. C和T，并执行步骤9.1.2和9.1.3。
      注：如果兔子无法完成步骤9.4，可在步骤9.3之后增加一个过渡步骤。具体操作为：执行步骤9.3，然后用奖励碗引诱兔子跳到训练员腿上。当兔子四只爪子均置于腿上时，进行C和T，并执行步骤9.1.2和9.1.3。
  4. 将目标进一步移至训练员腿部上方且更远离兔子的位置，使兔子跳上训练员腿上以用鼻子/嘴触碰目标。
    1. C和T，并执行步骤9.1.2和9.1.3。
  5. 执行步骤9.4，当兔子坐在腿上时，用空着的手从头侧向尾侧（从肩部开始）轻轻抚摸兔子。
    1. C和T，并执行步骤9.1.2和9.1.3。
  6. 执行步骤9.4，当兔子坐在腿上时，用空着的手从头侧向尾侧轻轻抚摸兔子的耳朵。
    1. C和T，并执行步骤9.1.2和9.1.3。
  7. 执行步骤9.4，当兔子坐在腿上时，轻轻抓住兔子的一只耳朵进行视觉检查。
    1. C和T，并执行步骤9.1.2和9.1.3。
  8. 执行步骤9.4，当兔子坐在腿上时，用空着的手抚摸其前爪或后爪。
    注：若兔子右侧身体朝向训练员、左侧身体背向训练员，则可轻触左侧爪子（反之亦然）。确保交替训练两侧。
    1. C和T，并执行步骤9.1.2和9.1.3。
  9. 执行步骤9.4，当兔子坐在腿上时，用空着的手小心地抬起其一只前爪或后爪。
    注：抬起爪子时可检查爪甲。确保交替训练两侧。
    1. C和T，并执行步骤9.1.2和9.1.3。

结果

在以下章节中，提供了超出实验方案的材料与方法相关信息，以及代表性结果。

统计学

通过上述方案获得的数据被保存在电子表格中，并使用高级统计分析软件进行分析（材料表）。对于连续性参数，采用正态性检验（直方图和QQ图的目视检查，以及均值、标准差与中位数的比较）。在自愿接近测试中，对与训练员和陌生人互动的时间长度、前肢触碰次数等参数之间的差异，采用Wilcoxon符号秩检验进行分析。不同操作技术之间的差异则根据数据类型采用Wilcoxon符号秩检验或McNemar检验（若为二分类变量）。当采用Wilcoxon符号秩检验时，需通过直方图的目视检查确认差异分布具有对称性。所有差异在 p < 0.05 时被认为具有统计学意义。

本研究为探索性研究。研究结束后，使用 G*Power（版本 3.1.9.7）对兔子与“操作装置”互动的时间长度进行了功效分析（Wilcoxon 符号秩检验；功效 ≥ 0.999）52。

习惯化

除兔子 #4 和 #10 外，其余所有兔子在每次适应性训练中均从奖励碗中进食，并允许训练员触碰。兔子 #4 在第 1 次训练中未接受食物奖励st 但在此期间从奖励碗中取食了四次nd 在后续训练中，该兔子的奖赏摄入量逐渐增加，且能够接受触碰。兔子#10在适应训练员和食物奖赏方面同样需要更长时间。在第一次训练中，该兔子在5分钟后接受了训练员提供的食物奖赏，但无法被触碰；在第二次训练中，未观察到其对食物的兴趣；但在随后的训练中，兔子#10接受了食物奖赏和触碰。

介绍点击器

在一天之内，十三只兔子中有十二只成功完成了方案第4部分，并在本次训练中将食物奖励（初级强化物）与咔嗒声（次级强化物）建立了关联。通过观察兔子在第十次听到咔嗒声后的行为来检验这种关联是否建立。当动物在咔嗒声出现后立即寻找奖励时，即认为兔子已将初级强化物与次级强化物关联起来。兔子#4在第1天听到咔嗒声后未食用食物奖励，因此该兔子用了更长一天的时间（即共两天）才成功建立咔嗒声与食物奖励之间的关联。

追踪目标

表1 提供训练次数（以中位数、25th 百分位数和75th 百分位数）来教会兔子达到实验方案中的目标行为。兔子中位数经过2次训练即可跟随目标棒进入训练区域（表1所有兔子均达到了该目标行为的最后一步（5.7）。

兔子 #4 和兔子 #7 分别需要经过 7 次和 8 次训练后，才能跟随目标棒进入训练区域。由于兔子 #7 未能完成步骤 5.4，且无法通过跳跃跟随目标棒，因此在步骤 5.3 之后向方案中增加了一个额外的训练步骤（5.3+）。在步骤 5.3+ 中，目标棒放置的位置比步骤 5.3 更远离兔子，兔子需朝不同方向伸展身体去接触目标棒，但无需跳跃即可触及。兔子 #4 在步骤 5.5 中存在问题，无法持续跟随放置在其鼻/口前方的目标棒完成可变次数的跳跃。因此，方案中增加了额外的步骤 5.4+。在此情况下，目标棒放置在兔子鼻/口正前方，随后向不同方向移动，要求兔子完成一次跳跃。该额外步骤同样成功应用于兔子 #7。在完成这些额外训练步骤且成功率至少达到 80% 后，它们才能继续进行后续步骤。

称重

兔子达到执行第6.5步（即在秤上停留不定时长）的行为目标所需训练次数的中位数为1次（表1）。所有兔子均达到了该目标行为的最终步骤（6.5步）。

进入转运箱

所有兔子在中位数 2 次训练课程内成功完成了从 7.1 到 7.6 的所有步骤（即在抬起后进入并离开运输箱）（表 1）。所有兔子均达到了该目标行为的最终步骤（7.6）。

当兔子 #2 和 #3 首次成功完成步骤 7.6 后，它们不愿意再次进入运输箱重复该步骤。因此，增设了步骤 7.5+：在动物跟随目标棒走向箱子后，通过箱盖的开口将奖励碗伸入，并引导动物进入箱内。一旦兔子进入箱中，即关闭箱门，并小心地将箱子抬起。将箱子放回地面后，打开箱门，再用目标棒引导兔子离开箱子。两只动物均成功完成了至少 4 次步骤 7.5+，并在次日顺利进行步骤 7.6。

饲养

中位数1次训练即可使兔子成功完成步骤8.3（即，将前爪放在训练员的手上）（表1）。由于13只兔子中有11只（即除编号#3和#7外的所有兔子）未能完成步骤8.3，因此为这些动物在步骤8.2之后增设了一个额外的训练步骤8.2+。在步骤8.2+中，将目标棒移动至兔子头部上方，使兔子抬起前爪离开地面，并用鼻子/嘴触碰目标。当兔子触碰目标时，训练员靠近并用其空闲手的手掌触碰兔子的前爪（掌面）。在至少五次尝试中的四次成功完成步骤8.2+后，再次训练并最终完成步骤8.3。

跳跃至腿部

训练兔子完成步骤9.1至9.9共需2.5次训练（中位数）（表1）。10只兔子成功达到了最终步骤9.9（即坐在训练者腿上时接受脚掌被触碰）。兔子#4仅达到步骤9.2（即将前肢放在训练者腿上），兔子#10达到步骤9.3（即跳上训练者腿上）。兔子#7达到步骤9.3+，这是在步骤9.3之后增加的一个额外中间步骤。在此步骤中，兔子如步骤9.2所述先将前肢放在训练者腿上，然后用位于训练者腿上的奖励碗引导其前进。当四只脚均置于训练者腿上后，即给予“咔哒”声信号并给予奖励。该步骤被成功加入到8只兔子的训练方案中，以促进后续步骤的完成。

泛化

为了评估兔子是否将训练中获得的线索泛化，以在除训练员之外的其他人员面前完成目标行为，由一名熟悉兔子但仅有少量响片训练经验的雌性动物饲养员，要求兔子执行已训练的目标行为“称重”、“进入运输箱”、“直立”和“跳到腿上”。如果某只兔子此前未学会“跳到腿上”的最后一步，则应演示其在训练中最后成功完成的步骤。

实验在为期3周的训练结束后连续5天内进行图1）。动物饲养员在1之前阅读了培训方案st 环节。在第1个st 在训练环节中，培训人员首先对所有目标行为进行了简要示范。随后，她留在围栏内，在训练过程中给予指导，并记录兔子所表现出的目标行为的具体步骤。如果某只兔子未能展示特定步骤，饲养员将被指示返回到操作流程的前一步骤。

除兔子 #4 外，所有兔子在经过 1 次、2 次和 2 次训练后，分别完成了目标行为“称重”、“进入运输箱”和“直立”（数据以中位数表示）（表 2）。兔子 #4 拒绝表现出这些目标行为的任何步骤。

十只动物中有八只能够在“跳上膝盖”（9.9）的最终步骤中表现出该行为，其中位数为经过3次训练后。尽管兔子#3和#11此前已学会“跳上膝盖”（9.9）的最终步骤，但它们仅在动物饲养员面前表现出第9.3步。兔子#4、#7和#10表现出与训练员相同的步骤（分别为9.2、9.3+和9.3）。

1 周训练间歇后目标行为的表现

为了检验动物是否能够保持“称重”、“进入运输箱”、“直立”和“跳到膝上”等最终步骤的行为，训练员在泛化训练结束后一周和两周时重新测试了这些目标行为（图1）。在这些间歇期间，动物未接受任何训练，也未获得任何奖励。

在两个时间点，所有兔子均能完成此前3周训练中学到的“称重”（6.5）、“进入运输箱”（7.6）和“直立”（8.3）等最后步骤。在“跳上膝盖”（9.9）这一最终目标行为中，已学会该步骤的动物（n = 10）在两个时间点均表现出该行为；未学会该目标行为最终步骤的个体（n = 3）在第一次为期1周的间歇后，能够展示其此前达到的最后步骤（兔子#4：步骤9.2；兔子#7：步骤9.3+；兔子#10：步骤9.3）。在第二次为期1周的间歇后，这三只兔子仍表现出与前一周相同的步骤，但被要求继续执行后续步骤，并最终均达到了步骤9.9。

约8.5周训练间歇后目标行为的表现

在动物经过约7.5周（#1-5，#13）或9.5周（#6-12）的训练间歇后，再次测试其目标行为。所有动物均能完成“称重”（6.5）、“进入运输箱”（7.6）和“直立”（8.3）的最终步骤。12只兔子完成了“跳到膝上”（9.9）的最终动作，而兔子#7仅将前爪放在训练员腿上，并向前伸展，用鼻子/嘴触碰目标（9.3）。

主动接近熟悉的训练员和陌生人的行为

训练三周后，通过测试兔子的自发接近行为，研究其与熟悉训练员和陌生人员（均为女性）的互动情况。测试前，两名人员均使用相同的沐浴露和洗发水洗澡，并穿戴相同类型的衣物及防护装备（手套、口罩、发网）。在动物圈舍内进行两次测试，每次持续5分钟，两次测试之间间隔2分钟。如图所示 图 4A，熟悉的训练员和一名陌生人背对围栏墙壁，面对面坐在围栏地板上的相同位置。从围栏中移除两间小屋；剩余的一间小屋和隧道被放置在靠近另外两面墙的位置，与两人距离相等。在第2个nd 实验过程中，他们交换了坐位位置，以排除兔子对特定位置的偏好。在5分钟的实验期间，观察者保持静止且不交谈。若兔子啃咬其裤装或夹伤腿部，观察者会轻柔地将手伸向兔子以使其停止。需要注意的是，对个体动物的观察是在群体中进行的，即在两次实验过程中，兔子之间可以相互互动。

采用BORIS软件53对视频进行回顾性分析。根据本研究所定义的行为谱，当兔子的四只脚均位于某人周围70 cm × 70 cm的正方形区域内或该区域的边界线上时，即判定为兔子与该人发生了互动。此外，还记录兔子是否将两只前脚置于人的腿部，或跳上其膝部（四只脚均置于膝上）。

图4B 显示了兔子与两个人互动的时间持续长度。Wilcoxon 符号秩检验表明，在第1阶段，兔子与训练员和陌生人的互动时间差异具有显著性。st 试验（z = -2.040，p = 0.041，Pearson 相关系数 r = 0.57），但在 2nd 试验（z = 0.245，p = 0.807，r = 0.07）。在第1st 试验中，兔子与训练员互动的时间更长。

在试验1和试验2中，分别有三只（#1、#5、#6）和五只（#1、#6、#7、#8、#12）兔子将前肢放在训练者的腿上。五只动物用四肢跳到训练者膝上（试验1：#1、#3、#5、#6；试验2：#9）。在1st 试验组及2组中的三只动物（#1、#4、#8）nd 在试验中，幼犬均以前肢攀爬到陌生人的腿上，但没有一只幼犬用四肢跳跃到其膝上。在试验1中，“前肢接触腿部”次数的差异均值在训练者与陌生人之间无显著差异（z = -0.264，p = 0.792，r = 0.07）；试验2中亦无显著差异（z = -0.707，p = 0.480，r = 0.20）。

操作技术对兔子对“操作装置”行为反应的影响

为了研究从地面抓起兔子所用的技术是否会影响其行为，在连续两天的常规检查过程中，于该操作后进行了2分钟的行为观察（图1）。该观察针对七只动物进行。

在第1天，使用运输箱将兔子转移。操作时，引导兔子跟随目标棒进入箱内，关闭箱门后将其转移至检查台，具体方法如训练步骤7.5所述。随后，用双手/双臂从下方/环绕兔子身体，轻柔地将其从箱中提起至检查台。进行健康检查（包括触诊身体，以及对耳朵、眼睛、鼻孔、门齿和肛生殖区域的目视检查），之后给予食物奖励。健康检查结束后，用手轻柔引导兔子重新进入运输箱。在检查台上不使用目标棒，以确保训练人员双手可自由固定动物。当兔子再次进入运输箱并关闭箱门后，将箱子转移回圈舍并打开箱门。引导兔子跟随目标棒离开箱子，随后给予食物奖励，具体操作如训练步骤7.6所述。

在第2天，采用动物饲养人员常规使用的技术抓取兔子（即用一只手抓住兔子颈部的皮肤，短暂地将其提起并放在另一只手臂上，头部朝向手臂弯处）。随后将兔子转移到检查台上，进行健康检查，检查方法如上所述。健康检查结束后，从奖励碗中给予兔子食物奖励。最后，再次抓住兔子颈部的皮肤，短暂提起并放回手臂，将其送回圈舍。放回圈舍并释放后，再次给予食物奖励。

在围栏中给予兔子食物奖励后，训练员坐在围栏地面上不与兔子互动，并录制2分钟视频，随后使用BORIS53进行回溯性分析。需要注意的是，对个体动物的观察是在群体中进行的，因为应在它们熟悉的环境中对其进行监测。这意味着兔子之间可以相互互动。以下参数被调查并定义：与训练员或运输箱互动的时间持续时间（即当兔子的鼻子距离训练员或箱子小于一个体长时，视为处于训练员或运输箱的互动区域内）；在运输箱内停留的时间持续时间（即当兔子四肢完全进入箱子时开始，当有一只或更多脚离开箱子时结束）；进食时间持续时间（即兔子摄入稻草、干草、颗粒饲料或粪便；啃咬训练员的衣服或鞋子不被视为进食）；躲藏时间持续时间（即当兔子四肢完全进入房屋或隧道时开始，当兔子有一只或更多脚离开遮蔽处时结束）；跳上膝盖（即兔子跳上训练员膝盖并将四肢全部置于其上；该行为发生时动物需处于训练员的互动区域内）；前肢搭在腿上（即兔子将两只前肢搭在训练员腿上；该行为发生时动物需处于训练员的互动区域内）。

行为学分析由训练员和一名对所实施操作完全设盲的人员共同完成。根据 Landis 和 Koch54 的标准，使用 BORIS53（Cohen's Kappa）计算的训练员与设盲人员之间的评分者间信度达到较高至几乎完美水平。后续分析采用设盲观察者提取的数据。

Wilcoxon 符号秩检验显示，传统抓握技术显著减少了与“抓握装置”互动的时间持续，即被提起后与训练者和箱体互动的总时长（z = 2.366，p = 0.018，r = 0.89； 图 5A）。操作技术对与训练员互动的时间持续长度没有显著影响（z = 1.014，p = 0.310，r = 0.28； 图 5B）。相比之下，通过箱子抓取兔子增加了它们与箱子互动的时间（z = 2.366，p = 0.018，r = 0.66； 图5C）以及在箱内停留的时间（z = 2.201，p = 0.028，r = 0.61）; 图 5D）与传统抓取方法相比。此外，使用传统抓取方法抓取后，动物在遮蔽处躲藏的时间更长（z = -1.992，p = 0.046，r = 0.046； 图5F).

操作技术对动物进食所花费的时间无显著影响（z = 0.944，p = 0.345，r = 0.26；图5E），对将前肢搭在训练员腿上的兔子数量（McNemar检验：p = 1.000）或跳到训练员腿上的兔子数量（McNemar检验：p = 0.500）亦无显著影响。无论采用何种操作技术，兔子#9均跳到了训练员的腿上，兔子#12均将其前肢搭在了训练员的腿上。此外，兔子#8和#11在被运输箱抓起后，也将前肢搭在了自己的腿上。

尽管所有兔子在箱子中短暂运输后，在检查台上均接受了食物奖励，但在常规抓握操作后，仅有一只兔子（#8）接受了食物奖励。这一差异具有显著性（McNemar检验：p = 0.031）。在圈舍中，离开运输箱后，六只兔子（即除#7外的所有兔子）接受了食物奖励；而在常规抓握操作（从手臂上释放）后，有四只兔子（#7、#9、#10和#12）接受了食物奖励（McNemar检验：p = 0.625）。

动物适应时间线示意图；训练、习惯化、行为观察方案。
图 1：时间安排表。 所有习惯化、训练和泛化阶段以及行为观察均在喂食和清洁前的上午进行。第1周（即到达后第四天）由动物饲养员和通讯作者（均为女性）进行为期五天的情境条件反射/习惯化训练（周一至周五；方案第3节），随后进入第2至第4周（周一至周五；方案第4–9节）为期三周的训练期。训练由通讯作者实施，其为专注于实验动物科学的兽医，具有丰富的兔子、小鼠、鸡和马的训练经验。此后，在连续两天内进行行为观察，以评估将兔子从地面提起的技术是否影响其行为。第5周进行五次泛化训练（周一至周五），以检验兔子是否能在非训练者人员面前表现出已学会的目标行为。在第6周和第7周（周四）以及第14周（周一/周二），训练者在每周例行健康检查过程中测试兔子是否能够保持并展示所学的目标行为。第7周进行一次与训练者及陌生人的自愿接近测试，以研究兔子对熟悉与陌生人类的行为反应差异。请点击此处查看此图的高清版本。

迷宫动物行为实验装置；兔子围栏观察示意图。
图 2：训练场地。 训练开始前几分钟设置好训练场地（参见材料表）。(A) 为便于运输和安装，场地由两部分组成，在围栏内将两部分连接在一起。(B) 两排透明塑料板构成一个约 136 cm × 90 cm × 70 cm 的训练场地。门通过扎带连接到其他面板上，可实现开启和关闭，也可使用卡扣将门锁紧。由于训练场地的墙壁是透明的，兔子进入场地时可与群体成员保持视觉、嗅觉和听觉上的接触。场地内可放置一个矮凳/台阶作为训练员的座位，并可根据训练目标行为的不同，在场地内放置秤或运输箱。请点击此处查看该图的放大版本。

汽车门禁系统钥匙扣与3D打印支架的组装示意图。
图3：集成点击器的奖励碗。 奖励碗采用白色聚乳酸（PLA）3D打印而成。方形碗尺寸：8 cm × 8 cm × 3 cm；圆柱形手柄尺寸：9.5 cm × 2.3 cm。点击器（见材料表）固定于手柄上。奖励碗的3D打印文件见补充代码文件1。请点击此处查看该图的放大版本。

兔子互动研究装置与试验图；利用隧道和房屋元素进行社交行为分析。
图 4：主动接近测试。（A）在两次各5分钟的试验中，熟悉的训练员与一位陌生的女性人员背对背坐在围栏内，背部朝向围栏墙壁。房屋和隧道分别放置在靠近另外两面墙的位置，且与两人距离相等。（B）分析每只兔子与人员互动的持续时间。当兔子的四只脚均位于人员周围70 cm × 70 cm的正方形区域内或该区域边界线上时，即视为与该人员发生互动。图中符号表示每只个体动物的数据。请点击此处查看该图的高清版本。

兔子行为分析，图 A-F 显示在搬运箱与常规抓取方式下互动、进食、躲藏的时间。
图 5：不同抓取技术对兔子行为的影响。 （A-F）对七只兔子在使用搬运箱或常规技术抓取后所记录的行为数据的图示。由于训练员和搬运箱均被视为“抓取装置”，（A）该图显示了图 B 与图 C 数据的总和。符号表示每只个体动物的数据。请点击此处查看该图的高清版本。

兔子训练目标行为所需的训练次数
跟随目标称重进入运输箱直立站立跳上膝盖
#111222
#211415
#321314
#472132 (步骤 9.2)
#521313
#621211
#781223 (步骤 9.3+)
#821211
#921212
#1022335 (步骤 9.3)
#1121224
#1221111
#1323124
中位数（第25–75百分位数）21212.5
(2–2)(1–1.5)(1.5–3)(1–2)(1–4)*

表1：训练目标行为所需的训练次数。 如果一只兔子未能学会目标行为的最后一步，则括号中所示为达到的最后训练步骤。

训练环节的定义：每组约 30 分钟（6-7 只动物）；每周一至周五，持续三周；以训练员坐入围栏并准备开始训练为起点；以所有兔子均不再参与训练或全部兔子均已达到目标行为的最终步骤为结束；单只动物在一次训练环节中可进行多次试验。

* 由于兔子 #4、#7、#10 未达到“跳到腿上”这一步骤，因此未纳入本计算。

兔达到目标行为最终步骤所需的训练次数
称重（5个训练步骤）进入运输箱（6个训练步骤）直立（3个训练步骤）跳上膝盖（9个训练步骤）
#11311
#21311
#3131F (9.3)
#4FFF3 (9.2)
#52322
#61133
#71133 (9.3+)
#81113
#91113
#101133 (9.3)
#11113F (9.3)
#121133
#131325
中位数（第25–75百分位数）1223
(1–1)(1–3)(1–3)(1.25–3)
(排除#4)(排除#4)(排除#4)(排除#3、#4、#7、#10、#11)

表2：泛化能力。 在五个连续的工作日（周一至周五）中，一位兔子熟悉的动物饲养员要求兔子执行已训练目标行为的最后步骤（或已达到的最后一步）。如果某目标行为的最后一步尚未达到，则用括号标示训练中实际达到的最后一步。当动物未能表现出此前训练中已达到的目标行为最后一步时，记为F（失败）。实验环节定义如下：连续一周内的周一至周五每天为一个环节；环节开始于动物饲养员和训练员进入围栏就座时；结束于所有兔子均完成目标行为的最终步骤（或已达到的最后一步），或无任何兔子继续参与（或不再参与）时；每个环节中，单只动物可进行多次试验。

补充代码文件 1：3D 打印文件“奖励碗”。 可使用聚乳酸（PLA）进行打印。 请点击此处下载该文件。

补充文件 1：六只兔子的记录表。该表格应打印或在平板电脑上打开，用于记录每只兔子的训练进展。在每次训练过程中，必须注明每只动物达到的训练步骤，或是否需要对方案进行调整。任何特殊情况（例如，外部因素、健康状况受损）也应予以记录。请点击此处下载该文件。

补充文件 2：简化的训练方案。 表格以简化的形式描述了第 3-9 节协议步骤。如需更多细节，应阅读主文稿中的协议步骤。请点击此处下载该文件。

讨论

训练方案旨在优化实验室兔的常规操作流程，如抓取、健康检查和称重。本探索性研究采用13只雌性新西兰白兔评估了这些训练方案的可行性。结果表明，这些训练方案可被可靠地应用于成功训练兔子。大多数兔子在不到3周的训练周期内即学会了训练方案中定义的目标行为，经过1周的训练间歇后仍能记住这些行为，并能将所学行为泛化至训练员以外的其他人员。为满足个体动物的需求，仅需对方案进行少量调整。本研究的主要发现是，训练方案中描述的优化抓取技术比传统抓取技术更不易引起兔子的厌恶反应。有趣的是，在自愿接近测试中，经过训练的兔子不仅对熟悉的训练员表现出探索行为，也对陌生人员表现出探索行为。

目标的意义

目标物作为当前训练方案的基础。在引入目标物时，动物学会了其行为会影响环境并产生相应后果。引入目标物有助于建立人与动物之间的信任关系。以兔子#4为例，它在经历了7次训练后才愿意跟随目标棒进入训练区域，但随后迅速学会了后续的目标行为（即在1-3次训练内掌握）。该兔子#4在目标物引入过程中似乎对训练员建立了信任，从而促进了其他目标行为的训练。然而，这只兔子对其他人仍缺乏信任，在泛化训练环节中不愿表现出大多数目标行为。

需要注意的是，在某些实验方案部分，目标并未被定义为终点。例如，动物需要跟随目标进行可变次数的跳跃，或在秤上停留可变时长的秒数。采用可变的奖励模式是为了提高并维持兔子在训练过程中的注意力和积极性。

信号

当兔子成功完成步骤5.1后，在所有后续的训练阶段中，训练员将目标物放置在靠近兔子鼻子的位置，以提示兔子训练试次开始。如果兔子用鼻子或嘴触碰目标物，则视为其具有参与训练的意愿，训练随即开始。

本方案未包含其他信号，例如，未将秤、运输箱或手视为信号。相反，是利用目标引导动物进入训练区域、站上秤、进入运输箱、站立（后肢直立）或坐到训练员腿上。这意味着目标行为 "称重", "进入转运箱", "饲养"，以及 "跳到膝上" 是……的修改版本 "跟随目标"其原因是训练方案需满足以下要求：动物设施的工作人员（可能并非动物训练专家）能够顺利实施，并可轻松融入日常工作中。因此，该方案必须高效，且能快速实现目标行为。

然而，放置在兔子前方的手（步骤 8.3）、电子秤或运输箱也可能同时成为兔子前爪的信号和目标。因此，有可能制定出超越当前方案的进一步步骤，且无需使用目标棒。例如，一旦兔子看到电子秤，电子秤便会向兔子发出信号，使其四只爪子全部跳上秤面。

实验方案的调整

尽管人们可能预期遗传背景几乎完全相同的实验动物具有非常相似的表型，但个体之间仍存在行为上的"差异，这些差异在时间和不同情境下具有稳定性，被称为“个性”"55，例如某些动物较为胆怯，而另一些则更为大胆56。胆怯且探索性较低的动物可能需要更长时间才能学会实验方案中设定的目标行为（例如，兔子#4）。即使标准化的训练方案适用于大多数动物，在必要时训练仍需考虑个体动物的需求并作出相应调整26。因此，对于未能掌握某一训练步骤的兔子，应为其设定额外的、更小的中间步骤。这些附加的中间训练步骤应有助于它们顺利过渡到下一阶段。尤其由于训练计划通常先在理论上制定，再在实践中检验，因此在实施过程中可能会发现，为了实现某一特定目标行为，需要增加额外的训练步骤。

关于当前的训练方案，必须为达到目标行为而增加一些中间训练步骤。 "靶向之后", "转运箱", "饲养"，以及 "跳到膝上"，如代表性结果部分详述的那样，由于个别动物无法继续后续训练步骤。有趣的是，大多数兔子需要中间步骤8.2+和9.3+，这凸显了这些步骤的重要性。因此，已在训练方案中将这些步骤作为备注添加。

作为步骤8.2+的替代方法，训练者可将一只手掌心朝上放在地面上，让兔子先用一只前爪、再逐渐用两只前爪踩上手掌。此外，在步骤9.3+之前，兔子可能需要增加若干过渡步骤，例如先让兔子将一只后爪放在训练者腿上，随后再将两只后爪都放上去。如果兔子在步骤9.5–9.9中不接受被触碰，可逐步延长触碰各个身体部位的时间。此外，初期可仅用食指和中指以极轻的力度抚摸动物，随后分多个阶段逐步增加用于触碰的手指数量以及施加的压力。

操作技术的优化

可以认为，操作对兔子而言具有高度的厌恶性，尤其是对性格胆小的个体。兔子是陆生猎物动物，将其提起（即从地面抱起）或限制其活动（即被人抱在怀中）以进行健康检查或实验操作，很可能引发焦虑和痛苦。训练方案中提出了一种优化操作方法的方案：无需通过抓握兔颈部皮肤并将其转移到另一手臂上进行限制，而是可使用目标棒引导兔子进入盒子，再将盒子携带至检查台（如先前研究所建议50,57），随后将兔子从盒中轻柔地转移至台面。或者，也可移除盒子的顶部，或使用目标棒引导兔子自行从盒中走出。

在使用传统抓取方法或运输箱抓取兔子后进行的行为观察显示，与替代方法相比，传统抓取方法与更多与应激和焦虑相关的行为有关。这一结论基于以下两点：当采用传统抓取方法时，有较多数目的动物拒绝在检查台上接受食物奖励，且在遮蔽处躲藏的时间显著延长。有趣的是，抓取方法并未影响兔子与训练员互动的时间，表明抓取过程可能并未损害人与动物之间的关系。然而，除了训练员外，运输箱也充当了"抓取装置"（即传统方法中的抓取装置为训练员，而替代方法中的抓取装置则包括训练员和运输箱）。因此，也分析了兔子与运输箱的互动时间。尽管兔子刚刚通过运输箱被转移，但与使用传统抓取方法相比，它们与运输箱接触或待在箱内的时间更长。这表明运输箱可能与积极情绪相关。当比较与两种"抓取装置"互动的总时长（即与运输箱和训练员互动时间的总和）时，发现使用运输箱的抓取方法增加了与"抓取装置"的互动时间，说明该方法在预期被抓取时对兔子对"抓取装置"的行为反应具有明确的积极影响。在实验小鼠中也获得了类似发现，研究表明温和的抓取技术和训练可减少应激和焦虑：使用隧道或用手掌抓取的小鼠比通过尾部抓取的小鼠更愿意主动与"抓取装置"互动，且表现出更少的焦虑相关行为12。训练似乎增强了这种效应。Leidinger 等人证明，经过正向强化训练（PRT）的温和抓取（使用隧道或手掌）小鼠在颈部皮肤被固定时表现出更少的排尿、排便和发声行为，在莫里斯水迷宫实验中表现出更少的漂浮行为，而未接受训练的小鼠则表现相反13。

日常工作中方案的可行性——培训时长、保持性与泛化性

学会目标行为所需的训练次数取决于个体动物和目标行为本身，而目标行为包含的步骤数量各不相同，范围从上述方案的第3节到第9节不等。

根据成功学会目标行为的动物数量以及针对个体动物在方案中所需进行的调整次数，训练步骤具有不同的难度等级。行为"跟随目标物"是兔子接受的首次训练体验，因此如上所述，部分动物在该行为上的训练耗时比其他目标行为更长。尽管所有动物均可按照本方案完成"称重"训练，但有两只动物在"进入运输箱"时需要增加额外的中间步骤，而几乎所有兔子在"直立"以及"跳上膝盖"时也都需要额外的中间步骤。这可能与动物与训练员之间执行不同目标行为时所需的身体接触程度有关。"称重"和"进入运输箱"不涉及动物与人类之间的任何身体接触。"直立"的最后一步（8.3）以及"跳上膝盖"的步骤9.2–9.4要求兔子与训练员发生身体接触。此外，在"跳上膝盖"的步骤9.5–9.9中，训练员会触碰兔子的肩部、背部、臀部、耳朵或脚掌，进一步增加了动物与训练员之间的身体接触程度。对某些兔子而言，接受被触碰比其他兔子更具挑战性。如上所述，针对这些目标行为调整训练方案并增加中间步骤是行之有效的。

然而，有三只兔子需要额外的训练课程才能完成目标行为"跳到训练者腿上"（#4、#7、#10）。这些动物无法跳到训练者腿上并非由于身体损伤所致，可以排除此类因素。此外，这些兔子能够跳上它们的兔舍，而兔舍的高度高于训练者的膝盖位置。

值得注意的是，这三只兔子中的两只（#4 和 #10）在适应阶段需要更长时间来适应训练员以及食物奖励，部分个体还需要更多的训练阶段才能达到其他目标行为的最终步骤。兔子#7也是如此，自第四次适应阶段以来，由于群体内的争斗导致其尾部受伤。因此，兔子#7被每日抓取、转移至检查台并接受治疗和检查，持续15天，这可能导致其对人类更加警惕。一方面，必须强调的是，训练表现可能受到健康状况受损、应激水平升高或因其他干预导致的人-动物关系紊乱等因素的影响。另一方面，这些观察结果也凸显了动物对训练员及食物奖励进行适应的重要性。一些动物可能需要更长时间才能熟悉训练员的存在，并接受来自训练员的食物奖励。如果增加了额外的适应阶段，兔子#4和#10在训练阶段的表现可能会更好。兔子对人类的适应重要性在已有文献中已有报道。本研究所用兔子的商业繁殖场近期引入了定期抚摸程序，显著减少了与应激相关的行为，并消除了攻击行为58。在一项早期研究中，对幼兔进行抚摸和抓握操作被证明可降低与焦虑相关的行为，促进体重增长，并降低死亡率59。

兔子学会不同的目标行为后，尽管有个别例外，但仍能在两次短暂（一周）和一次长期（约7.5至9.5周）的训练间歇后表现出这些行为。这些观察结果可能表明，在进行常规检查并清洁房间/围栏时，每周只需让兔子执行一次已训练的目标行为即可。

对于该方案在日常工作中的可行性而言，兔子能否将训练获得的目标行为泛化至训练者以外的其他人员也至关重要。在训练人员休假或生病时，需由其他人继续开展训练并照护动物。大多数兔子（13只中的12只）均能将目标行为成功泛化 "称重", "进入转运箱"，以及 "饲养" 尽管在某些情况下，兔子需要经过一次以上的训练才能表现出期望的行为。 "称重" 似乎具有最佳的泛化能力；其次是 "进入转运箱" 和 "饲养"。然而， "跳到膝上" 似乎更难以推广到另一个人。动物表现出目标行为所需时间更长（9.9），且有两只此前已学会最后一步（9.9）的兔子未能表现出该目标行为，可能是因为需要更多的身体接触（见上文）。其中一只兔子（#4）未表现出任何目标行为的步骤。 "称重", "进入转运箱"，以及 "饲养" 对与动物饲养员互动不感兴趣。兔子#4是在适应训练中需要更长时间来适应训练员和食物奖励的个体之一。这表明，对于某些个体而言，增加由动物饲养员陪伴的适应训练环节，让兔子逐步接受来自饲养员的食物奖励，并建立积极的情感联系，可能是有益的23兔子可能能够区分不同的人，这一点已在大鼠中得到证实60此外，可能影响兔子在训练员和动物饲养员训练环节中表现的其他因素，还包括训练员在训练过程中无意识向动物传递的信号，例如目标棒或奖励碗的位置、身体姿势或动作。如果训练员未意识到这些信号，则不会对其进行记录，其他人员也无法模仿这些信号。

此外，与动物接触的工作人员的训练技能，包括使用目标棒和给予奖励的操作熟练程度，都可能影响动物的行为。除了需要掌握学习原理和动物交流的知识外，成功训练动物还需要具备实际操作经验。61 并获取目标行为。由于未比较涉及熟练者与非熟练者的泛化阶段，该因素的相关性 "训练技能" 无法确定。然而，据作者所知，大部分实验动物工作人员未接受过动物训练方面的培训，因此泛化训练阶段所采用的条件（即由一位此前几乎无响片训练经验的动物饲养员进行操作）代表了实验动物设施中的真实情况。

各方案的代表性数据可使动物设施了解训练不同目标行为所需的工作量。这些数据有助于动物设施在实施（部分）方案时制定自身的工作计划。根据个体动物及目标行为的不同，应预留一定额外时间用于泛化过程。然而，在与雄性兔或其它兔品种开展工作时，所需时间可能会有所变化。动物设施应讨论是否有足够的时间，以及需要做出哪些调整，才能为动物训练留出充足时间。

除了训练动物所需的时间外，还必须考虑到训练工作需要熟练的训练人员，而培训员工掌握动物训练方法同样耗时。如果将动物训练作为实验动物工作人员（即动物饲养员、兽医和研究人员）教育培训的必修内容，将有助于在实验设施中更顺利、更高效地实施动物训练。根据欧盟指令2010/63/EU附件III的规定， "实验机构应为动物、实验操作及项目持续时间制定适宜的适应性训练和培训方案"，即法律要求必须进行动物训练。在德国，申请动物实验许可时必须提交此类培训项目。这就要求计划开展动物实验及从事实验动物工作的人员具备动物训练方面的技能。然而，至少在德国，动物训练并未纳入科研和临床领域实验动物饲养人员的培训课程中62,63,64此外，欧盟关于教育培训框架的建议中并未明确提及这一点65因此，只要这些法规中尚未实施相关培训，针对正向强化训练的持续职业发展就需要得到更多关注。实验动物从业人员需要学习学习原理和训练技术、所需标准、训练者之间的操作传递、记录保存方法，以及如何应对未能按预期方式参与训练的动物，以确保操作的一致性和可预测性。

人与动物互动

训练期间密集的人兔互动时间为人兔个体之间关系的加强提供了理想条件26,66。积极的人兔关系有助于动物福利，因为它可以降低动物在饲养和实验环境中的应激水平67。在本训练方案中，训练员会尊重兔子的自主性，兔子可自愿决定是否参与训练。赋予动物自主性对其福利具有促进作用16，因此应在实验、饲养及管理过程中予以提倡。自主性行为存在不同层次68；参与PRT（正向强化训练）可归为“由行动驱动的自主性”层次，即"主动采取行为以实现当前目标（例如获取食物）"68。

在分析兔子主动接近训练员和陌生人的行为时，可观察到强烈的人-动物互动。结果表明，除了一只兔子外，所有兔子均表现出这种行为st 第12次试验中，受试者同时与训练员和陌生人互动。他们似乎能够识别训练员，因为在互动中明显表现出对训练员的偏好st 试验中，一些兔子会用四只爪子跳到训练者的腿上，而这种行为并未在面对陌生人时出现。尽管兔子与训练者互动的时间比与陌生人互动的时间更长st 试验中，相互作用时间在第2次已不再存在差异nd 试验中出现这一现象的原因可能是，兔子预期会从训练者那里获得食物奖励st 试验中，由于自愿接近测试中缺乏食物奖励，它们在第二阶段与训练员相处的时间并未增加nd 不再进行试验。然而，这些数据强调了训练过的兔子能迅速适应陌生人的存在，且没有一只表现出过度胆怯而无法互动。相反，它们表现出很强的探索性，对陌生人非常感兴趣。但由于未设置未经训练的对照组，因此尚不明确训练对兔子主动接近行为的影响。

解释12号兔子在1中的行为的假设st 试验的关键在于，该个体仍需适应陌生人在场的情况st 次试验中，对与训练者（70秒）和陌生人（9秒）互动表现出更大的兴趣nd 试验。兔子具有不同的个性特征，这些特征可能影响其在陌生人周围的舒适程度，进而影响其接近陌生人的时间延迟或与人互动的持续时间69,70.

局限性

我们注意到，在训练过程中，围栏/房间内的所有兔子（不仅限于参与训练的个体）都能听到“咔哒”声（即条件性强化刺激），但由于并未同时呈现食物奖励（即自然/非条件性强化刺激），该声音的强化效果可能会被削弱。如果训练区域外的兔子表现出已训练的行为并听到“咔哒”声，但未获得食物奖励（且这种情况多次发生），则该训练行为可能会逐渐消退。这种现象被称为消退64,71。然而，由于本实验方案中的所有目标行为均依赖于训练者所呈现的目标刺激，因此在我们的训练环境中，消退现象不太可能发生。

由于训练区域的墙壁是透明的，且训练区域位于围栏内，兔子在训练期间能够相互看见、听到和闻到彼此，这在动物福利方面具有明显优势。此外，兔子可能在训练过程中观察到同组成员的行为，并由此相互学习。先前在大鼠中的研究表明，个体可通过观察同笼伙伴接受PRT训练而学会执行目标行为45。这一现象既可能被视为优势，也可能被视为劣势。当动物能够相互观察时，其学习进度可能会更快；然而，个体动物的数据可能受到同组成员表现的影响，因而不能完全归因于个体自身的训练效果。因此，若在无任何群体接触条件下训练动物，或对单独饲养的兔子进行训练，可能需要更长时间。

在个体熟悉的社交环境和群体中进行行为观察（在自愿接近测试中以及应用不同抓握技术后），以避免因进入新环境或与群体分离所引起的压力和分心，这些因素反过来会影响行为观察结果。然而，其缺点是兔子在观察期间可能会相互影响彼此的行为。

仅在七只动物中研究了操作技术的影响，且均由训练员负责动物的操作。作者计划开展一项后续研究，包括预先进行样本量计算，以通过其他操作人员重现研究结果，并进一步探讨不同操作技术之间的差异。

所有参与训练、操作以及自愿接近测试的人员均为女性。尚未研究如果由男性参与，兔子的训练表现或其行为是否会有所不同。

目前的训练方案旨在让读者了解兔子可以接受哪些训练，但并未涵盖在实验兔中所有可能有益的训练目标行为。例如，在“一般要求”方案部分中建议的对兔子进行标记操作，也值得通过PRT进行训练。

如上所述，选择合适的奖励并非易事。由于卫生限制，一些实验动物设施不允许使用新鲜草本植物作为食物奖励，因此必须使用较不理想的食物奖励，例如葵花籽或基于谷物的觅食零食。在选择食物奖励时，当前实验室实践中的一些规则和规定可能不利于动物福利和有效训练，因此可能需要根据具体情况重新评估。此外，也可以使用非食物类奖励作为替代方案，例如轻柔的触碰、与训练员的互动或环境丰富化物品。然而，训练员必须确保所选的每种替代方式对个体动物而言确实是一种奖励，因为只有当兔子真正偏好某种刺激时，它才能成为有效的奖励。尤其是触碰，并非所有兔子都会将其视为奖励性刺激。

结论

总之，本研究是填补关于实验室兔适宜训练方案知识空白的第一步。雌性新西兰白兔可通过正向强化训练（PRT）学习常规饲养管理操作，并能将所习得的目标行为泛化至其他人员，但应为泛化过程预留额外时间。无需身体接触的目标行为似乎比需要与人类进行身体接触的行为更容易学会。动物成功完成某一目标行为训练后，每周仅需在常规检查和笼舍清洁时进行一次复习即可。虽然被认为可普遍适用于所有兔子的训练方案较为便捷，但训练者必须意识到，在某些情况下，方案需根据动物个体的需求进行调整。关于抓取技术的结果表明，使用运输箱捕捉兔子比抓住其颈部皮肤并将其提离地面的方式更不易引起动物厌恶。总体而言，本研究提供的方案为兔子的适应性训练过程提供了切实可行的操作指导，可在实验动物设施中作为动物福利优化措施加以应用。

不得因节省劳力、时间或金钱而导致动物遭受痛苦（至少根据德国《动物福利法》72的规定）。以尽可能温和的方式照料和对待所有 动物至关重要。由于未经训练的动物在实验操作和常规饲养管理过程中所经历的焦虑与痛苦程度高于经过训练的动物13，因此训练是一种简单的优化措施，可有效防止动物陷入负面情绪状态。

披露

作者声明本出版物不存在利益冲突。

致谢

作者感谢动物饲养员对兔子的悉心照料，以及他们富有同情心且专注敬业的工作。感谢 Kai Diederich 对手稿的校对。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
床’巢美国莫米，安德森公司该方案的成功实施不依赖于本特定产品，您可使用其他公司的同类产品。 
手指点击器ASCOhttps://ascoshop.de/products/fingerclicker
G*Power版本 3.1.9.7
Heu-ProppenSsniff Spezialdiäten GmbH，德国索斯特该方案的成功实施不依赖于本特定产品，您可使用其他公司的同类产品。 
IBM Corp. 发布于 2020 年。IBM SPSS Statistics for Windows，  美国纽约州阿蒙克：IBM 公司IBM 公司版本 27.0在文中称为 "用于高级统计分析的软件"
家兔饲养 + 25 mg/kg 盐霉素钠特殊混合物Ssniff Spezialdiäten GmbH，德国索斯特该方案的成功实施不依赖于特定的此款产品，您可使用其他公司提供的类似产品。 
木质素纤维块Lignocel J. Rettenmaier &Söhne GmbH + Co KG，德国罗森贝格该方案的成功实施不依赖于本特定产品，您可使用其他公司生产的类似产品。 
Lillebro geschä向日葵籽”，Martina 公司，Mü德国南肯）和 Rainbow 采食颗粒（Bio-Serv，美国弗莱明顿） Martina GmbH, Mü德国南肯该方案的成功实施不依赖于本特定产品，您可使用其他公司生产的类似产品。 
Microsoft Excel for Microsoft 365 MSO微软公司版本 2305在文中称为 "电子表格"
新西兰白兔 查尔斯河实验室法国公司
DE 35K5DL 平台秤KERN & SOHN GmbH，德国巴林根-弗罗梅尔恩该方案的成功实施不依赖于本特定产品，您可使用其他公司的同类产品。 
优质科学实验垫料（细） &和薄片）SAFE，奥吉，法国该方案的成功实施不依赖于本特定产品，您可使用其他公司生产的类似产品。 
彩虹觅食颗粒Bio-Serv，弗莱明顿，美国该方案的成功实施不依赖于本产品，您可使用其他公司的同类产品。 
Snackball für 兔 – 7 cmTRIXIE 宠物用品有限公司 & Co. KG，德国塔普该方案的成功实施不依赖于本特定产品，您可使用其他公司生产的类似产品。 
带集成式点击器的目标棒TRIXIE 宠物用品有限公司 & Co. KG，德国塔普该方案的成功实施不依赖于本特定产品，您可使用其他公司的同类产品。 
Trixi 运输箱 Capri 敞口型TRIXIE 宠物用品有限公司 & Co. KG，德国塔普该方案的成功实施不依赖于本特定产品，您可使用其他公司生产的类似产品。 
魏登-许巴尔JR FARM GmbH，德国霍尔茨海姆-佩森堡海姆该方案的成功实施不依赖于本特定产品，您可使用其他公司生产的类似产品。 

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