此处，我们提出了首个用于局部真空渗透的实验方案 体内 对大型植物遗传转化的研究。利用该方法，我们首次实现了 农杆菌介导的 在植株中 可可的瞬时转化
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摘要
摘要
瞬时的 在植株中 转化是一种快速且经济高效的植物遗传转化替代方法。大多数相关实验方案 在植株内 转化依赖于使用 农杆菌-介导的转化。然而，目前使用的方案因对大型植物进行真空处理时存在物理和经济上的限制，仅标准化适用于小型植物。本研究提出了一种针对大型植物定制的局部真空农杆菌浸润高效方案。为评估该方法的有效性，我们在可可植株（一种难以进行遗传转化的热带植物）中测试了该方案的应用。本方案允许对可可叶片的局部地上部分施加高达0.07 MPa的真空压力，并可重复操作，从而实现强制浸润 农杆菌 进入附着叶片的细胞间隙。因此，我们实现了 农杆菌介导的瞬时 在植株中 表达RUBY报告系统的附着可可叶片的转化。这也是首次 农杆菌介导的 在植株中 可可的瞬时转化。该方案将使基于真空的农杆菌渗透法可应用于其他具有类似尺寸限制的植物物种，并为此类研究开辟新的途径 在植株中 难处理的木本大型物种中基因的表征
引言
植物遗传转化方法对于验证基因的生物学功能至关重要，在后基因组时代，由于预测出大量尚未表征的基因，这些方法如今显得尤为重要1。这些方法可用于获得完全转化的植株，或实现基因的瞬时表达。当宿主细胞摄取的外源DNA完全且不可逆地整合到宿主基因组中，并能遗传给后代时，即为稳定转化。瞬时表达，又称瞬时转化，是由农杆菌（Agrobacterium）向细胞转移的多个拷贝T-DNA所引起，这些T-DNA未整合至宿主基因组中，其表达水平通常在感染后2-4天达到峰值2。
值得注意的是，瞬时表达实验通常足以完成基因的功能表征，并且相较于稳定转化具有多项优势。例如，瞬时转化无需基于组织培养的再生过程。另一项优势在于其适用于植株内（in planta）基因功能分析，目前已有多个针对模式植物物种（如Arabidopsis thaliana3和Nicotiana benthamiana4）优化成熟的标准化实验方案，但在非模式物种中的应用仍较为有限5。
瞬时检测体系的建立依赖于高效的基因转移方法。其中，最常用的方法基于 农杆菌 浸....
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方案
1. Agrobacterium tumefaciens 培养
- 解冻电转感受态细胞 Agrobacterium tumefaciens 菌株 LBA4404
- 加入1 mL 酵母麦芽提取物（YM； 表1将肉汤加入一支 17 mm × 100 mm 的培养管中。将此试管留待后续使用，并置于室温（RT）下保存。
- 在1.5 mL 微离心管中，加入 30 µL 解冻后的 农杆菌 细胞和100-250 ng（最多 5 µL) 含有 DNA 的 35S:RUBY轻轻混匀。
注意： 35S:RUBY 由中国台湾的Yunde Zhao惠赠。为避免样品电弧现象，应尽可能减少离子化合物的存在。这些离子化合物可能是DNA乙醇沉淀过程中残留的盐类。19. - 此时，将一个1 mm的电穿孔比色皿置于冰上。
- 将上述悬浮液转移至预冷的1 mm电穿孔比色皿中。全程保持冰上操作。用纸巾擦净比色皿的金属电极。
- 将电穿孔仪设置为 Agr （2.2 kV，约5 ms，1次脉冲）。将比色皿放入电穿孔腔室中。
- 按压 脉冲 按钮....
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结果
本方案介绍了一种适用于大型木本植物的有效农杆菌浸润方法。采用本方案，我们实现了-0.07 MPa的真空压力，从而有效、局部地浸润了可可叶片。在图4中，我们展示了浸润系统的搭建过程，在图5中展示了最终的配置状态。
图 4：真空室装置示意图。 （A）注意枝条放置在垫圈两端之间。该垫圈尺寸足够大，可使枝条穿过干燥器本体与其盖子之间。可见由于枝条表面不规则而.......
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讨论
在本研究中，我们提出了一种高效、低成本的农杆菌浸润实验方案，用于 在植株中 以可可植株为例的木本植物瞬时转化。鉴于叶片角质层对植物组织转化具有众所周知的限制作用，本研究重点开发一种促进农杆菌真空渗透的策略，以克服木本植物通常对此类操作难以适用的问题。
真空室内部达到的真空压力之所以能够实现，主要得益于对干燥器、树枝、垫圈/O型圈以及干燥器盖之间所形成微小间隙的有效密封和填充，这也是本实验方案的主要难点。因此，使用硅胶印模材料将树枝固定在干燥器上至关重要。该材料无孔、具有足够的黏性以使树枝牢固附着于干燥器和垫圈上，且化学性质惰性，因此既不会损伤浸润后的树枝，也不会损坏干燥器。
此外，需要使用真空泵在叶片切片内部产生压力梯度，使气孔腔和叶肉区域中的空气被抽出，随后在重新加压过程中，较大的压力梯度推动 农杆菌 通过气孔和伤口将悬浮液注入叶片10我们使用冷冻干燥机作为真空泵。这体现了本方案对各类实验室需求的多功能性和适应性。使用冷冻干燥机作为真空泵时，.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
感谢Lic. Jesús Fuentes González和Néstor Iván Robles Olivares在视频拍摄过程中提供的协助。感谢CIATEJ的Antonia Gutierrez Mora博士提供的Theobroma cacao植株。同时感谢CIATEJ和墨西哥国家植物生物技术实验室（Laboratorio Nacional PlanTECC, México）提供的设施支持。H.E.H.D.（CVU: 1135375）的硕士研究得到了墨西哥国家人文、科学与技术理事会（CONAHCYT）的资助。R.U.L.感谢哈利斯科州科学技术委员会（COECYTJAL）以及墨西哥哈利斯科州创新科学与技术秘书处（SICYT）的支持（项目编号7270-2018）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 35S:RUBY 质粒 | Addgene | 160908 | http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908 |
| 1 mm 电穿孔比色皿 | Thermo Fisher Scientific | FB101 | Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus |
| 干燥器 | Bel-Art SP SCIENCEWARE | F42400-2121 | |
| 冷冻干燥机 | LABCONCO | 700402040 | |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P8281-500G | 用于 YM 培养基，添加 0.38 g/L |
| LBA4404 电转感受态农杆菌 | Intact Genomics USA | 1285-12 | https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/ |
| 甘露醇 | Sigma Aldrich | 63560-250G-F | 用于 YM 培养基，添加 10 g/L |
| MES | Sigma Aldrich | PHG0003 | （用于 LB、YM 及重悬培养基）添加 1.95 g/L（10 mM） |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | 用于重悬培养基，添加 0.952 g/L（10 mM） |
| MgSO4·7H2O | Sigma Aldrich | 63138-1KG | 用于 YM 培养基，添加 0.204 g/L |
| MicroPulser 电穿孔仪 | Bio-Rad | 165-2100 | |
| NaCl | Karal | 60552 | 用于 LB 培养基，添加 5 g/L；用于 YM 培养基，添加 0.1 g/L |
| NanoDrop One 微量紫外-可见分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| President 硅橡胶印模材料 | COLTENE | 60019938 | |
| 利福平 | Gold-Bio | R-120-1 | （100 mg/mL） |
| 硅橡胶印模材料注射枪 | Andent | TBT06 | |
| 壮观霉素 | Gold-Bio | S-140-SL10 | （100 mg/mL） |
| 链霉素 | Gold-Bio | S-150-SL10 | （100 mg/mL） |
| 酪蛋白酶解物胰蛋白胨 | Sigma Aldrich | 95039-1KG-F | 用于 LB 培养基，添加 10 g/L |
| 酵母提取物 | MCD LAB | 9031 | 用于 LB 培养基，添加 5 g/L；用于 YM 培养基，添加 0.4 g/L |
参考文献
- Huang, L. Q. Functional Genome of Medicinal Plants. Molecular Pharmacognosy. , Springer, Singapore. (2019).
- Janssen, B. J., Gardner, R. C. Localized transient expression of GUS in leaf discs following cocultivation with Agrobacterium. Plant Molecular Biology. 14 (1), 61-72 (1990).
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重印与许可
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