此处，我们提出了首个用于局部真空渗透的实验方案 体内 对大型植物遗传转化的研究。利用该方法，我们首次实现了 农杆菌介导的 在植株中 可可的瞬时转化
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摘要
摘要
瞬时的 在植株中 转化是一种快速且经济高效的植物遗传转化替代方法。大多数相关实验方案 在植株内 转化依赖于使用 农杆菌-介导的转化。然而，目前使用的方案因对大型植物进行真空处理时存在物理和经济上的限制，仅标准化适用于小型植物。本研究提出了一种针对大型植物定制的局部真空农杆菌浸润高效方案。为评估该方法的有效性，我们在可可植株（一种难以进行遗传转化的热带植物）中测试了该方案的应用。本方案允许对可可叶片的局部地上部分施加高达0.07 MPa的真空压力，并可重复操作，从而实现强制浸润 农杆菌 进入附着叶片的细胞间隙。因此，我们实现了 农杆菌介导的瞬时 在植株中 表达RUBY报告系统的附着可可叶片的转化。这也是首次 农杆菌介导的 在植株中 可可的瞬时转化。该方案将使基于真空的农杆菌渗透法可应用于其他具有类似尺寸限制的植物物种，并为此类研究开辟新的途径 在植株中 难处理的木本大型物种中基因的表征
引言
植物遗传转化方法对于验证基因的生物学功能至关重要，在后基因组时代，由于预测出大量尚未表征的基因，这些方法如今显得尤为重要1。这些方法可用于获得完全转化的植株，或实现基因的瞬时表达。当宿主细胞摄取的外源DNA完全且不可逆地整合到宿主基因组中，并能遗传给后代时，即为稳定转化。瞬时表达，又称瞬时转化，是由农杆菌（Agrobacterium）向细胞转移的多个拷贝T-DNA所引起，这些T-DNA未整合至宿主基因组中，其表达水平通常在感染后2-4天达到峰值2。
值得注意的是，瞬时表达实验通常足以完成基因的功能表征，并且相较于稳定转化具有多项优势。例如，瞬时转化无需基于组织培养的再生过程。另一项优势在于其适用于植株内（in planta）基因功能分析，目前已有多个针对模式植物物种（如Arabidopsis thaliana3和Nicotiana benthamiana4）优化成熟的标准化实验方案，但在非模式物种中的应用仍较为有限5。
瞬时检测体系的建立依赖于高效的基因转移方法。其中，最常用的方法基于 农杆菌 浸润，利用了 农杆菌的 将DNA转移至植物细胞的独特能力6另一种用于这些分析的有用工具是报告基因的使用，例如绿色荧光蛋白（GFP）、β-葡萄糖醛酸酶（GUS）、荧光素酶或RUBY，这些报告基因均被用于追踪转化事件。在这些报告系统中，RUBY目前最易于观察，其原理依赖于酪氨酸通过三个酶促反应步骤转化为甜菜碱类色素。与其他报告系统不同，转化后的植物组织中产生的甜菜碱类色素呈现鲜艳的颜色，可直接肉眼观察，无需复杂设备或额外反应试剂。7.
当进行渗透时 农杆菌 将悬浮液注入叶片叶肉细胞的胞间空间时，成功实现农杆菌侵染最关键的步骤是克服叶片表皮角质层所形成的物理屏障8. 尽管对于某些植物而言，使用无针注射器（无针注射器农杆菌渗入法）产生的压力梯度已足以实现高效的农杆菌渗入，例如在 Nicotiana benthamiana9，其他植物物种可能需要更大的压力梯度，例如借助真空泵产生的压力梯度10在真空辅助过程中，农杆菌浸润分为两个步骤。第一步，通过真空使植物材料处于低压环境，迫使叶肉细胞间隙中的气体从气孔和伤口逸出。随后，在重新加压阶段， 农杆菌 悬浮液通过气孔和伤口渗透到细胞间隙11.
与注射器渗透相比，真空渗透具有更高的使用频率、可重复性，并且能够在渗透过程的每个阶段控制压力和持续时间10。在不同植物物种的叶片中，例如菠菜（Spinacia oleracea）12、牡丹（一种木本多年生植物）（Paeonia ostii）13和豇豆（Vigna unguiculata）14，真空农杆菌渗透方案比注射器渗透实现了更深的渗透率。同样，在番茄（Lycopersicon esculentum）15和非洲菊（Gerbera hybrida）16中，真空农杆菌渗透产生的基因沉默效果更强且更均匀。真空渗透的另一个优势是其对基因型的依赖性较低，而注射器渗透则表现出较高的基因型依赖性，这一点最近在三种柑橘品种（Fortunella obovata、Citrus limon和C. grandis）中得到证实17。然而，当尝试将真空农杆菌渗透应用于体型过大而无法放入干燥器的植物时，真空室的尺寸可能成为限制因素，这种情况在热带木本植物中尤为常见。
以下，我们描述了一种克服真空腔室空间限制的实验方案，并验证其应用价值 在植株中 可可叶片的瞬时转化。我们提出了首个针对可可的局部真空渗透方法，该方法无需额外设备，甚至可利用常用于整株植物渗透的普通实验室干燥器，仅需进行简单改造，使植物部分组织能够进入真空室，从而适用于植物不同发育阶段的操作。为验证所提出的局部真空渗透方法的有效性，我们选择可可作为难以转化的大型叶片热带植物物种的代表。利用该局部渗透方法，我们近期报道了首个 在植株中 通过瞬时表达在牛油果中 农杆菌介导的真空渗透，条件已针对离体叶片进行过优化18，本文报道了首个 在植株内 可可中的瞬时表达
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方案
1. Agrobacterium tumefaciens 培养
- 解冻电转感受态细胞 Agrobacterium tumefaciens 菌株 LBA4404
- 加入1 mL 酵母麦芽提取物（YM； 表1将肉汤加入一支 17 mm × 100 mm 的培养管中。将此试管留待后续使用，并置于室温（RT）下保存。
- 在1.5 mL 微离心管中，加入 30 µL 解冻后的 农杆菌 细胞和100-250 ng（最多 5 µL) 含有 DNA 的 35S:RUBY轻轻混匀。
注意： 35S:RUBY 由中国台湾的Yunde Zhao惠赠。为避免样品电弧现象，应尽可能减少离子化合物的存在。这些离子化合物可能是DNA乙醇沉淀过程中残留的盐类。19. - 此时，将一个1 mm的电穿孔比色皿置于冰上。
- 将上述悬浮液转移至预冷的1 mm电穿孔比色皿中。全程保持冰上操作。用纸巾擦净比色皿的金属电极。
- 将电穿孔仪设置为 Agr （2.2 kV，约5 ms，1次脉冲）。将比色皿放入电穿孔腔室中。
- 按压 脉冲 按钮。记录脉冲参数。如果样品发生电弧，电穿孔过程即为失败。
注意：脉冲处理后必须立即将细胞转移至YM培养基中。延迟转移会显著降低转化效率20. - 立即使用保存的YM培养基将细胞从比色皿转移至17 mm × 100 mm试管中，轻轻重悬细胞。
- 将转化后的细胞在37°C下孵育3小时 28 °C 并在摇床培养箱中以 250 rpm 的转速孵育。
注意：该培养物不含抗生素；请注意保持适当的无菌条件。 - 将该培养物划线接种于选择性YM琼脂平板上21对于转化的LBA4404-RUBY菌株，确保这些平板含有利福平（rifampicin）25 µg/mL），壮观霉素（50 µg/mL）和链霉素（streptomycin）50 µg/mL）。将该板在37°C下孵育过夜 28 °C 立式培养箱
注意：在本方案中，载体 35S:RUBY 使用了赋予细菌对壮观霉素抗性的基因（50 µg/mL）并在浸润的植物组织中起到视觉报告的作用。 - 将过夜培养物中的菌落接种于 12.5 mL YM 培养基与LB（Luria Bertani）培养基混合液（体积比为 9:1）、10 mM MES、pH 5.7 的体系中22确保该选择性液体培养基含有与步骤1.10中使用相同的抗生素。参考 表1 查看这些培养基的成分和浓度。
- 孵育时 农杆菌，为培养物留出足够的通气空间，约为液体体积的4到5倍。使用YM培养基进行培养 农杆菌 菌株 LBA4404 以避免细胞成团23.
- 将培养物在250 rpm条件下孵育16 h 28 °C 轨道摇床
- 用与步骤1.11中相同的培养基，将培养物扩增至初始体积的10倍。
- 将培养物在250 rpm条件下孵育16 h 28 °C 轨道摇床
- 将过夜培养物调节至光密度（OD6000.4。添加 20 µM 乙酰丁香酮（AS）。
- 在250 rpm条件下振荡孵育 28 °C 轨道摇床培养至OD600 达到约1.0。
- 以 4 500 x 离心细胞 g 10 分钟 20 °C.
- 用悬浮液（10 mM MES，10 mM MgCl₂）重悬沉淀2，pH 5.7），调节 OD600 至0.6。添加 200 µM AS24.
注意：将悬浮液预孵育于 28 °C如果加入的悬液温度过低，细胞将会沉淀。 - 在避光条件下静置细菌悬液2-24小时，并 25 °C无需振荡22.
2. 植物选择
- 选择一株处于农杆菌浸润最佳阶段的带叶枝条的植株。
注意：植株可以是完全生长的植株或成熟树木。对于可可树，推荐使用 C 阶段的幼嫩叶片。这些叶片呈青铜色至浅绿色，尚未完全展开，也不如 D 阶段叶片那样坚硬25（图 1）。- 作为对照，同时在其他农杆菌浸润效率较高的植株（例如 Nicotiana tabacum）上，使用相同菌株和载体进行农杆菌浸润实验。
注意：如果该对照未获得阳性结果，则阴性结果可能是由于所用菌株或载体所致。
- 作为对照，同时在其他农杆菌浸润效率较高的植株（例如 Nicotiana tabacum）上，使用相同菌株和载体进行农杆菌浸润实验。
3. 真空室装置设置
- 使用带有真空计以测量内部真空压力的干燥器作为真空室。
- 向步骤 1.19 中的 Agrobacterium 悬液中加入 250 µM 茉莉酸（JA）18,26。
- 将 Agrobacterium 培养物转移至广口烧杯中，以浸没所选的枝条和叶片。然后将含有 Agrobacterium 培养物的烧杯放入干燥器内。
- 将枝条置于干燥器及其盖子之间。确保目标叶片完全浸入 Agrobacterium 培养物中。接着使用跳跃环（jump ring），即带有切口的圆环，使植物枝条能够进入干燥器内部。跳跃环同时作为干燥器底部与顶部之间的间隔物。
- 确保密封圈结构稳定，足以防止被盖子压扁，具有足够的柔韧性以弯曲并贴合干燥器的周长，并且不由多孔材料制成。
注意：本研究使用了一种由多股细金属丝绞合而成的金属丝环，外层包覆有类似密封圈的非多孔塑料材料（图 2）。 - 使用硅橡胶印模材料将枝条固定在干燥器上。确保该材料具有黏性、非多孔性，对干燥器和植物均呈化学惰性，并易于操作，可充分填充枝条、密封圈与干燥器之间的微小间隙。
- 待硅橡胶印模材料聚合（约需 1 分钟）并将枝条牢固固定后，关闭干燥器。确保不留任何缝隙。
- 将干燥器连接至真空泵（图 3）。
4. 真空浸润
- 启动真空泵，直至达到 -0.07 MPa。
- 一旦达到该压力，关闭压力阀并关闭真空泵。维持此压力 5 分钟。
- 打开压力阀以恢复腔室压力。
注意：此步骤至关重要。应逐步且稳定地恢复腔室压力。完全重新加压干燥器可能需要长达 3 分钟。延长加压时间会增加细菌侵入组织内部的数量10。 - 重复此过程再进行两次。
- 将枝条从细胞悬浮液和干燥器中取出。
- 用蒸馏水清洗已浸润的叶片。
5. 注入叶片的孵育
- 将浸润后的叶片置于25 °C黑暗条件下静置48 h。
- 随后，将浸润的组织暴露于16/8 h的光/暗光周期条件下。
- 在感染后3–7天评估瞬时叶片转化效果。
图1可可叶片发育阶段 (A-E发育阶段25. 请点击此处以查看该图的放大版本。
图2：真空腔室的结构及其组件。 真空腔室是一个连接真空表的干燥器。密封垫/O型圈被切割出一个开口，以便放置枝条。(A) 真空表，(B) 盖子，(C) 密封垫/O型圈，(D) 压力阀，(E) 干燥器，(F) 软管。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：体内 真空农杆菌浸润系统。 为避免浸润过程中发生真空泄漏，必须使用硅橡胶印模材料将枝条固定在干燥器及垫圈/O型环上。（A）可可植株，（B）真空室，（C）硅橡胶印模材料，（D）浸没于农杆菌悬浮液中的叶片，（E）真空泵。请点击此处查看该图的高清版本。
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结果
本方案介绍了一种适用于大型木本植物的有效农杆菌浸润方法。采用本方案，我们实现了-0.07 MPa的真空压力，从而有效、局部地浸润了可可叶片。在图4中，我们展示了浸润系统的搭建过程，在图5中展示了最终的配置状态。
图 4：真空室装置示意图。 （A）注意枝条放置在垫圈两端之间。该垫圈尺寸足够大，可使枝条穿过干燥器本体与其盖子之间。可见由于枝条表面不规则而...
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讨论
在本研究中，我们提出了一种高效、低成本的农杆菌浸润实验方案，用于 在植株中 以可可植株为例的木本植物瞬时转化。鉴于叶片角质层对植物组织转化具有众所周知的限制作用，本研究重点开发一种促进农杆菌真空渗透的策略，以克服木本植物通常对此类操作难以适用的问题。
真空室内部达到的真空压力之所以能够实现，主要得益于对干燥器、树枝、垫圈/O型圈以及干燥器盖之间所形成微小间隙的有效密封和填充，这也是本实验方案的主要难点。因此，使用硅胶印模材料将树枝固定在干燥器上至关重要。该材料无孔、具有足够的黏性以使树枝牢固附着于干燥器和垫圈上，且化学性质惰性，因此既不会损伤浸润后的树枝，也不会损坏干燥器。
此外，需要使用真空泵在叶片切片内部产生压力梯度，使气孔腔和叶肉区域中的空气被抽出，随后在重新加压过程中，较大的压力梯度推动 农杆菌 通过气孔和伤口将悬浮液注入叶片10我们使用冷冻干燥机作为真空泵。这体现了本方案对各类实验室需求的多功能性和适应性。使用冷冻干燥机作为真空泵时，...
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
感谢Lic. Jesús Fuentes González和Néstor Iván Robles Olivares在视频拍摄过程中提供的协助。感谢CIATEJ的Antonia Gutierrez Mora博士提供的Theobroma cacao植株。同时感谢CIATEJ和墨西哥国家植物生物技术实验室（Laboratorio Nacional PlanTECC, México）提供的设施支持。H.E.H.D.（CVU: 1135375）的硕士研究得到了墨西哥国家人文、科学与技术理事会（CONAHCYT）的资助。R.U.L.感谢哈利斯科州科学技术委员会（COECYTJAL）以及墨西哥哈利斯科州创新科学与技术秘书处（SICYT）的支持（项目编号7270-2018）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 35S:RUBY 质粒 | Addgene | 160908 | http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID:Addgene_160908 |
| 1 mm 电穿孔比色皿 | Thermo Fisher Scientific | FB101 | Fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus |
| 干燥器 | Bel-Art SP SCIENCEWARE | F42400-2121 | |
| 冷冻干燥机 | LABCONCO | 700402040 | |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P8281-500G | 用于 YM 培养基，添加 0.38 g/L |
| LBA4404 电转感受态农杆菌 | Intact Genomics USA | 1285-12 | https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/ |
| 甘露醇 | Sigma Aldrich | 63560-250G-F | 用于 YM 培养基，添加 10 g/L |
| MES | Sigma Aldrich | PHG0003 | （用于 LB、YM 及重悬培养基）添加 1.95 g/L（10 mM） |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | 用于重悬培养基，添加 0.952 g/L（10 mM） |
| MgSO4·7H2O | Sigma Aldrich | 63138-1KG | 用于 YM 培养基，添加 0.204 g/L |
| MicroPulser 电穿孔仪 | Bio-Rad | 165-2100 | |
| NaCl | Karal | 60552 | 用于 LB 培养基，添加 5 g/L；用于 YM 培养基，添加 0.1 g/L |
| NanoDrop One 微量紫外-可见分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| President 硅橡胶印模材料 | COLTENE | 60019938 | |
| 利福平 | Gold-Bio | R-120-1 | （100 mg/mL） |
| 硅橡胶印模材料注射枪 | Andent | TBT06 | |
| 壮观霉素 | Gold-Bio | S-140-SL10 | （100 mg/mL） |
| 链霉素 | Gold-Bio | S-150-SL10 | （100 mg/mL） |
| 酪蛋白酶解物胰蛋白胨 | Sigma Aldrich | 95039-1KG-F | 用于 LB 培养基，添加 10 g/L |
| 酵母提取物 | MCD LAB | 9031 | 用于 LB 培养基，添加 5 g/L；用于 YM 培养基，添加 0.4 g/L |
参考文献
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