一个 离体 利用人网膜建立卵巢癌腹膜转移模型

摘要

本方案描述了一种癌细胞与大网膜相互作用的三维（3D）ex vivo 模型的建立方法。该模型为阐明脂肪微环境中促进肿瘤发展的机制以及测试新型治疗方法提供了一个研究平台。

摘要

卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤。大网膜在为转移性卵巢癌细胞提供支持性微环境以及允许肿瘤耐受的免疫调节信号方面起着关键作用。然而，目前我们缺乏能够紧密模拟卵巢癌细胞与富含脂肪组织之间相互作用的模型。为了进一步理解大网膜如何提供促肿瘤微环境的细胞和分子机制，我们开发了一种独特的3D ex vivo 癌细胞-大网膜相互作用模型。利用人源大网膜，我们能够在这一富含脂肪的微环境中培养卵巢癌细胞，并监测负责肿瘤生长和免疫调控的相关因子。该模型不仅为研究富含脂肪的肿瘤微环境提供了平台，也为针对这一特定微环境内转移性癌细胞的新型治疗策略的开发与评估提供了优良的实验体系。该模型易于构建、成本低廉，适用于转化医学研究。

引言

卵巢癌是全球致死率最高的妇科恶性肿瘤¹。女性一生中罹患该癌症的风险约为70分之1，诊断时的中位年龄为63岁²。原发性卵巢恶性肿瘤在组织学上分为上皮性和非上皮性两类。上皮性卵巢癌（EOC）占所有卵巢肿瘤的90%以上，其中最常见的亚型是高级别浆液性癌（HGSC），约占EOC的70%–80%。目前尚无有效的早期筛查方法来发现该疾病，因此大多数患者在确诊时已处于晚期（即国际妇产科联盟[FIGO]III期或IV期），此时癌症已扩散至整个腹膜腔²。

标准的一线治疗方案是减瘤手术，以切除所有可见的肉眼病灶，随后辅以基于铂类的化疗，以清除任何残留的微小病灶。尽管在过去二十年中，卵巢癌的治疗取得了诸多进展，但约70%的晚期患者在治疗后3年内会复发³。鉴于这些患者总体预后较差，目前及未来针对上皮性卵巢癌（EOC）的转化研究致力于发现可用于早期检测的生物标志物，防止转移，改进现有疗法以避免耐药，并开发新的个体化癌症治疗策略。

腹腔内广泛转移及其相关的化疗耐药性是改善卵巢癌患者治疗的两大主要障碍^4,5。大网膜是卵巢癌转移的主要部位，它是一种脂肪性的、围裙样结构，从胃部下垂并覆盖在肠管表面^6,7。除了作为物理屏障的功能外，大网膜还具有再生和促血管生成能力，并具备免疫活性，这些功能共同促进血管形成、加速伤口愈合并限制感染⁸。大网膜含有高浓度的干细胞，这些干细胞可分化为多种细胞类型，有助于修复受损组织。当发生损伤或感染时，大网膜可能发生炎症反应，从而触发免疫细胞向损伤部位迁移⁹。这些免疫细胞释放生长因子及其他分子，促进受损组织的修复与再生。位于大网膜中的免疫细胞（如巨噬细胞、淋巴细胞和浆细胞）聚集形成称为"乳斑"的结构，负责识别和攻击病原体，并调节腹膜免疫。研究还表明，大网膜在诱导免疫耐受¹⁰方面发挥作用，即免疫系统耐受自身抗原而不攻击健康组织的能力。然而，相同的免疫相关活动也参与了病理反应，例如大网膜肿瘤的生长、转移以及逃避免疫监视^9,11。我们实验室及他人的前期研究已证实，脂肪组织微环境在抑制抗肿瘤免疫反应以及获得化疗耐药性方面具有独特而积极的作用^12,13,14。遗憾的是，目前我们对大网膜如何提供促肿瘤微环境的细胞与分子机制仍了解有限。

为了更好地理解癌细胞与大网膜之间的相互作用，我们建立了一种由人卵巢癌细胞和患者来源的大网膜组织外植体组成的三维培养系统。本文所述方案代表了一种新型的腹膜癌转移的离体（ex vivo）模型。该模型可模拟卵巢癌在富含脂肪组织中的自然发生发展过程。该模型易于构建、成本低廉，且在卵巢癌研究的转化研究中具有潜在应用价值。

方案

本研究方案已通过韦恩州立大学机构审查委员会（IRB）的审查和批准。所有患者在手术前均签署了知情同意书。图1展示了本方案中的三个主要步骤。

1. 人网膜组织的制备

1. 配制大网膜培养基（DMEM/F12 + 10% 胎牛血清 + 1% 青霉素-链霉素），置于 4 °C 保存。将 30–40 mL 该培养基分装至无菌的 50 mL 锥形管或外科标本容器中。
2. 获取来自大网膜活检或大网膜切除术的外科标本。在手术室取出后，立即将无菌标本浸入大网膜培养基中。若操作流程不允许，应尽快将标本放入培养基。将样本置于冰上转运，并在 4 °C 保存至处理前。
   注意：所切除的大网膜标本大小将决定可利用组织的量。
3. 在采集后 1–2 小时内，于超净工作台中处理大网膜标本。确保所有材料和工具均为无菌或已灭菌。
4. 将大网膜从收集容器中取出，转移至 100 mm 培养皿中。用 1× 磷酸盐缓冲液（1× PBS）浸没标本，并轻轻冲洗以去除任何血块或碎片。
5. 使用小型手术剪或 10–15 mm 手术刀将组织切成 0.5 cm × 0.5 cm 或 100–200 mg 的小块（图 2A）。使用小型手术镊子辅助操作组织，避免压碎大网膜。若手术切除大网膜标本时使用了能量器械，则应避免使用封闭边缘处发生形变的组织。
6. 将每块切好的大网膜组织放入 24 孔培养板的独立孔中，并向每孔加入 500 μL 大网膜培养基，或加至足以覆盖组织且防止组织漂浮离开孔底的体积（图 2B）。
7. 将大网膜组织块置于新鲜培养基中，在 4 °C 保存，直至准备注射。

2. 卵巢癌细胞的制备

1. 在收集大网膜样本当天，将人卵巢癌细胞在37 °C、5% CO₂条件下，于75 cm²培养瓶中培养至至少75%融合度。
   注意：本方案使用先前已描述的表达mCherry的OCSC1-F2人卵巢癌细胞^15,16,17,18，可修改用于任何带有荧光标记的癌细胞系。
2. 在获取大网膜标本后，立即于超净工作台内处理细胞。确保所有材料和工具均无菌或已灭菌。
3. 向培养瓶中加入10 mL无菌1×PBS，轻轻晃动培养瓶以洗涤细胞，随后吸除1×PBS，再加入3 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA。
4. 轻轻晃动培养瓶使胰蛋白酶-EDTA均匀覆盖细胞，然后将培养瓶置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育不超过5分钟。轻敲培养瓶使细胞完全脱落，随后加入3 mL大网膜培养基以中和胰蛋白酶活性。
5. 用移液器吹打混匀细胞悬液，转移至15 mL锥形离心管中，在24 °C下以1,200 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于6 mL新鲜的大网膜培养基中。
6. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。将细胞悬液稀释至每100–200 μL含至少100,000个细胞，此为每块切割后的大网膜组织的接种体积。
7. 将适量细胞转移至新的培养瓶中，以继续细胞传代培养。

3. 卵巢癌细胞的注射

1. 使用1 mL注射器吸取细胞悬液，然后安装26-G针头。切勿通过针头吸取细胞悬液，以免造成细胞破碎。
2. 使用小型手术镊子夹取一段剪下的大网膜组织，将其转移至另一个无菌操作培养皿中以便进行注射。用针尖轻轻刺入大网膜组织，并向组织内注射少量细胞悬液（图2C）。
3. 在大网膜多个区域重复注射，总注射体积至少达到100 μL或100,000个细胞。注意，大部分细胞悬液可能在样本周围积聚。若对注射质量存有疑虑，可重复注射或向样本中注射更大体积的细胞悬液。
4. 将完成注射的大网膜样本放回24孔培养板的各个孔中。注意，培养基的液面应刚好覆盖大网膜组织，避免其漂浮。小心操作培养板，并将其放入培养箱中（37 °C，5% CO₂）。
5. 可选：使用Matrigel（基底膜基质）将大网膜组织悬浮于固态基质中，以利于注射并实现更集中的细胞悬液递送。
   1. 在使用前于4 °C条件下解冻基底膜基质，并立即与大网膜培养基按1:1比例混合。在使用前将基底膜基质混合液置于冰上或4 °C保存。在空孔中加入足量的基底膜基质混合液，以完全浸没剪下的大网膜组织片段。
   2. 将样本放入基底膜基质混合液中，随后将24孔培养板置于培养箱中（37 °C，5% CO₂）孵育20分钟。待混合液凝固后，按上述方法继续进行注射。
6. 通过荧光成像确认注射成功。确保在注射部位观察到连续的荧光信号条带（图2D）。需注意，注射后实际附着于大网膜组织上的细胞数量无法准确预测。

4. 人网膜与卵巢癌细胞的共培养

1. 每 48–72 小时更换一次培养基，加入 500–2000 μL 新鲜的大网膜培养基。切勿将培养基直接吹加到大网膜组织上方，以免移位癌细胞。注意：若培养基颜色变为黄色，则需更换培养基。
   注意：培养基更换频率取决于所用培养基的体积以及癌细胞生长情况。一旦癌细胞已在大网膜上定植，大网膜组织是否漂浮已不再重要。
2. 可选步骤：若使用了基底膜基质，则通常在首次更换培养基时基质已溶解。
3. 通过荧光成像监测卵巢癌肿瘤的生长情况。成像频率由研究者自行决定。预计约 14 天时可观察到微小肿瘤形成的证据（图 3A–C）。结果可能因注射质量不同而有所差异。
4. 根据实验终点终止实验。
   注意：已观察到肿瘤生长及大网膜组织完整性可维持超过 50 天。

结果

大约在第14天时，可见卵巢癌细胞成功植入大网膜组织样本中（图3A-C）。每个采集的样本均制备并注射至少24个重复样本，以供后续实验使用。通过采集荧光图像来监测肿瘤生长情况（图3D，E）。图像需仔细解读，因为每个孔底部未附着于大网膜的区域也生长了一层癌细胞单层。我们倾向于在大网膜悬浮于培养基中时进行成像，以避免荧光信号与癌细胞单层发生重叠。

到第14天仍未出现荧光信号，可视为注射失败。观察发现，癌细胞在前7天内最初扩散至大网膜表面，但随着时间推移，逐渐聚集形成肿瘤（图3A-D）。不同样本间肿瘤负荷的一个替代指标是大网膜培养基颜色由红色变为黄色的速度（图3F）。我们通过荧光成像、组织...

讨论

通过本方案，结合基本的体外（in vitro）和离体（ex vivo）技术，建立了卵巢癌腹膜癌病的临床前模型。在将mCherry+ OCSC1-F2人卵巢癌细胞接种至大网膜组织标本后，共培养50天内观察到肿瘤持续生长。该方法在多次实验中经过不同大网膜标本的测试与优化。肿瘤成功生长依赖于大网膜组织的质量、癌细胞的活力以及注射操作的有效性。在本研究中，仅使用了此前多项研究中已报道的mCherry+ OCSC1-F2细胞和mCherry+ R182人卵巢癌细胞系^{12,15,16,17,18,19,20,}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1x)	Gibco	25300054
1 mL 胰岛素注射器，带 26 G 可拆卸针头	BD	329652
10 mL 血清移液管	CELLTREAT	229010B
100 mm 组织培养皿	Fisherbrand	FB012924
15 mL 离心管	CELLTREAT	229411
24 孔细胞培养板	Costar	3524
50 mL 离心管	CELLTREAT	229421
75 cm2 组织培养瓶	CELLTREAT	229341
Corning 细胞计数仪	Corning	9819000
Cytation 5 成像仪	Biotek
DMEM/F12 (1:1) (1x)，含 L-谷氨酰胺，2.438 g/L 碳酸氢钠	Gibco	11320033
优质胎牛血清	Gibco	1043028
Matrigel	Corning	356230	基底膜基质
10 号不锈钢一次性手术刀	Integra-Miltex	4410
青霉素-链霉素	Gibco	15140122
磷酸盐缓冲液，pH 7.4 (1x)	Gibco	10010023
Revolve 显微镜	Echo