本方案描述了一种癌细胞与大网膜相互作用的三维（3D）ex vivo 模型的建立方法。该模型为阐明脂肪微环境中促进肿瘤发展的机制以及测试新型治疗方法提供了一个研究平台。
本文内容
摘要
摘要
卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤。大网膜在为转移性卵巢癌细胞提供支持性微环境以及允许肿瘤耐受的免疫调节信号方面起着关键作用。然而，目前我们缺乏能够紧密模拟卵巢癌细胞与富含脂肪组织之间相互作用的模型。为了进一步理解大网膜如何提供促肿瘤微环境的细胞和分子机制，我们开发了一种独特的3D ex vivo 癌细胞-大网膜相互作用模型。利用人源大网膜，我们能够在这一富含脂肪的微环境中培养卵巢癌细胞，并监测负责肿瘤生长和免疫调控的相关因子。该模型不仅为研究富含脂肪的肿瘤微环境提供了平台，也为针对这一特定微环境内转移性癌细胞的新型治疗策略的开发与评估提供了优良的实验体系。该模型易于构建、成本低廉，适用于转化医学研究。
引言
卵巢癌是全球致死率最高的妇科恶性肿瘤1。女性一生中罹患该癌症的风险约为70分之1，诊断时的中位年龄为63岁2。原发性卵巢恶性肿瘤在组织学上分为上皮性和非上皮性两类。上皮性卵巢癌（EOC）占所有卵巢肿瘤的90%以上，其中最常见的亚型是高级别浆液性癌（HGSC），约占EOC的70%–80%。目前尚无有效的早期筛查方法来发现该疾病，因此大多数患者在确诊时已处于晚期（即国际妇产科联盟[FIGO]III期或IV期），此时癌症已扩散至整个腹膜腔2。
标准的一线治疗方案是减瘤手术，以切除所有可见的肉眼病灶，随后辅以基于铂类的化疗，以清除任何残留的微小病灶。尽管在过去二十年中，卵巢癌的治疗取得了诸多进展，但约70%的晚期患者在治疗后3年内会复发3。鉴于这些患者总体预后较差，目前及未来针对上皮性卵巢癌（EOC）的转化研究致力于发现可用于早期检测的生物标志物，防止转移，改进现有疗法以避免耐药，并开发新的个体化癌症治疗策略。
腹腔内广泛转移及其相关的化疗耐药性是改善卵巢癌患者治疗的两大主要障碍4,5。大网膜是卵巢癌转移的主要部位，它是一种脂肪性的、围裙样结构，从胃部下垂并覆盖在肠管表面6,7。除了作为物理屏障的功能外，大网膜还具有再生和促血管生成能力，并具备免疫活性，这些功能共同促进血管形成、加速伤口愈合并限制感染8。大网膜含有高浓度的干细胞，这些干细胞可分化为多种细胞类型，有助于修复受损组织。当发生损伤或感染时，大网膜可能发生炎症反应，从而触发免疫细胞向损伤部位迁移9。这些免疫细胞释放生长因子及其他分子，促进受损组织的修复与再生。位于大网膜中的免疫细胞（如巨噬细胞、淋巴细胞和浆细胞）聚集形成称为"乳斑"的结构，负责识别和攻击病原体，并调节腹膜免疫。研究还表明，大网膜在诱导免疫耐受10方面发挥作用，即免疫系统耐受自身抗原而不攻击健康组织的能力。然而，相同的免疫相关活动也参与了病理反应，例如大网膜肿瘤的生长、转移以及逃避免疫监视9,11。我们实验室及他人的前期研究已证实，脂肪组织微环境在抑制抗肿瘤免疫反应以及获得化疗耐药性方面具有独特而积极的作用12,13,14。遗憾的是，目前我们对大网膜如何提供促肿瘤微环境的细胞与分子机制仍了解有限。
为了更好地理解癌细胞与大网膜之间的相互作用，我们建立了一种由人卵巢癌细胞和患者来源的大网膜组织外植体组成的三维培养系统。本文所述方案代表了一种新型的腹膜癌转移的离体（ex vivo）模型。该模型可模拟卵巢癌在富含脂肪组织中的自然发生发展过程。该模型易于构建、成本低廉，且在卵巢癌研究的转化研究中具有潜在应用价值。
方案
本研究方案已通过韦恩州立大学机构审查委员会（IRB）的审查和批准。所有患者在手术前均签署了知情同意书。图1展示了本方案中的三个主要步骤。
1. 人网膜组织的制备
- 配制大网膜培养基（DMEM/F12 + 10% 胎牛血清 + 1% 青霉素-链霉素），置于 4 °C 保存。将 30–40 mL 该培养基分装至无菌的 50 mL 锥形管或外科标本容器中。
- 获取来自大网膜活检或大网膜切除术的外科标本。在手术室取出后，立即将无菌标本浸入大网膜培养基中。若操作流程不允许，应尽快将标本放入培养基。将样本置于冰上转运，并在 4 °C 保存至处理前。
注意：所切除的大网膜标本大小将决定可利用组织的量。 - 在采集后 1–2 小时内，于超净工作台中处理大网膜标本。确保所有材料和工具均为无菌或已灭菌。
- 将大网膜从收集容器中取出，转移至 100 mm 培养皿中。用 1× 磷酸盐缓冲液（1× PBS）浸没标本，并轻轻冲洗以去除任何血块或碎片。
- 使用小型手术剪或 10–15 mm 手术刀将组织切成 0.5 cm × 0.5 cm 或 100–200 mg 的小块（图 2A）。使用小型手术镊子辅助操作组织，避免压碎大网膜。若手术切除大网膜标本时使用了能量器械，则应避免使用封闭边缘处发生形变的组织。
- 将每块切好的大网膜组织放入 24 孔培养板的独立孔中，并向每孔加入 500 μL 大网膜培养基，或加至足以覆盖组织且防止组织漂浮离开孔底的体积（图 2B）。
- 将大网膜组织块置于新鲜培养基中，在 4 °C 保存，直至准备注射。
2. 卵巢癌细胞的制备
- 在收集大网膜样本当天，将人卵巢癌细胞在37 °C、5% CO2条件下，于75 cm2培养瓶中培养至至少75%融合度。
注意：本方案使用先前已描述的表达mCherry的OCSC1-F2人卵巢癌细胞15,16,17,18，可修改用于任何带有荧光标记的癌细胞系。 - 在获取大网膜标本后，立即于超净工作台内处理细胞。确保所有材料和工具均无菌或已灭菌。
- 向培养瓶中加入10 mL无菌1×PBS，轻轻晃动培养瓶以洗涤细胞，随后吸除1×PBS，再加入3 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA。
- 轻轻晃动培养瓶使胰蛋白酶-EDTA均匀覆盖细胞，然后将培养瓶置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育不超过5分钟。轻敲培养瓶使细胞完全脱落，随后加入3 mL大网膜培养基以中和胰蛋白酶活性。
- 用移液器吹打混匀细胞悬液，转移至15 mL锥形离心管中，在24 °C下以1,200 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于6 mL新鲜的大网膜培养基中。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数。将细胞悬液稀释至每100–200 μL含至少100,000个细胞，此为每块切割后的大网膜组织的接种体积。
- 将适量细胞转移至新的培养瓶中，以继续细胞传代培养。
3. 卵巢癌细胞的注射
- 使用1 mL注射器吸取细胞悬液，然后安装26-G针头。切勿通过针头吸取细胞悬液，以免造成细胞破碎。
- 使用小型手术镊子夹取一段剪下的大网膜组织，将其转移至另一个无菌操作培养皿中以便进行注射。用针尖轻轻刺入大网膜组织，并向组织内注射少量细胞悬液（图2C）。
- 在大网膜多个区域重复注射，总注射体积至少达到100 μL或100,000个细胞。注意，大部分细胞悬液可能在样本周围积聚。若对注射质量存有疑虑，可重复注射或向样本中注射更大体积的细胞悬液。
- 将完成注射的大网膜样本放回24孔培养板的各个孔中。注意，培养基的液面应刚好覆盖大网膜组织，避免其漂浮。小心操作培养板，并将其放入培养箱中（37 °C，5% CO2）。
- 可选：使用Matrigel（基底膜基质）将大网膜组织悬浮于固态基质中，以利于注射并实现更集中的细胞悬液递送。
- 在使用前于4 °C条件下解冻基底膜基质，并立即与大网膜培养基按1:1比例混合。在使用前将基底膜基质混合液置于冰上或4 °C保存。在空孔中加入足量的基底膜基质混合液，以完全浸没剪下的大网膜组织片段。
- 将样本放入基底膜基质混合液中，随后将24孔培养板置于培养箱中（37 °C，5% CO2）孵育20分钟。待混合液凝固后，按上述方法继续进行注射。
- 通过荧光成像确认注射成功。确保在注射部位观察到连续的荧光信号条带（图2D）。需注意，注射后实际附着于大网膜组织上的细胞数量无法准确预测。
4. 人网膜与卵巢癌细胞的共培养
- 每 48–72 小时更换一次培养基，加入 500–2000 μL 新鲜的大网膜培养基。切勿将培养基直接吹加到大网膜组织上方，以免移位癌细胞。注意：若培养基颜色变为黄色，则需更换培养基。
注意：培养基更换频率取决于所用培养基的体积以及癌细胞生长情况。一旦癌细胞已在大网膜上定植，大网膜组织是否漂浮已不再重要。 - 可选步骤：若使用了基底膜基质，则通常在首次更换培养基时基质已溶解。
- 通过荧光成像监测卵巢癌肿瘤的生长情况。成像频率由研究者自行决定。预计约 14 天时可观察到微小肿瘤形成的证据（图 3A–C）。结果可能因注射质量不同而有所差异。
- 根据实验终点终止实验。
注意：已观察到肿瘤生长及大网膜组织完整性可维持超过 50 天。
结果
大约在第14天时，可见卵巢癌细胞成功植入大网膜组织样本中（图3A-C）。每个采集的样本均制备并注射至少24个重复样本，以供后续实验使用。通过采集荧光图像来监测肿瘤生长情况（图3D，E）。图像需仔细解读，因为每个孔底部未附着于大网膜的区域也生长了一层癌细胞单层。我们倾向于在大网膜悬浮于培养基中时进行成像，以避免荧光信号与癌细胞单层发生重叠。
到第14天仍未出现荧光信号，可视为注射失败。观察发现，癌细胞在前7天内最初扩散至大网膜表面，但随着时间推移，逐渐聚集形成肿瘤（图3A-D）。不同样本间肿瘤负荷的一个替代指标是大网膜培养基颜色由红色变为黄色的速度（图3F）。我们通过荧光成像、组织学评估以及肉眼观察，证实了共培养超过50天后肿瘤的生长情况以及大网膜组织的存活状态（图4）。
图1：实验方案中通用步骤的示意图。（A）步骤1：大网膜的准备；（B）步骤2：癌细胞注射；（C）步骤3：癌细胞-大网膜微环境的建立。（图由BioRender.com制作）。请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：将癌细胞制备并注射至大网膜。（A）将大网膜切成 1×1 cm 的小块。（B）每块组织置于 24 孔板的一个孔中，并加入 500 μL 培养基覆盖。（C）将癌细胞注射至大网膜组织块中。（D）注射后可观察到荧光标记的癌细胞条带。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：共培养14天和25天后的代表性图像。 （A-C）共培养14天后的代表性图像：（A）相差图像，（B）mCherry通道，（C）合并图像。（D-E）共培养25天后的代表性图像。（F）培养基颜色由粉红色变为黄色，表明癌细胞注射成功并建立了共培养体系。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：大体形态学及苏木精-伊红（H&E）染色。 （A,B）共培养第50天的大体形态学代表性图像；箭头指示mCherry+卵巢癌细胞生长部位。（C,D）共培养第50天的H&E染色代表性图像。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
通过本方案，结合基本的体外（in vitro）和离体（ex vivo）技术，建立了卵巢癌腹膜癌病的临床前模型。在将mCherry+ OCSC1-F2人卵巢癌细胞接种至大网膜组织标本后，共培养50天内观察到肿瘤持续生长。该方法在多次实验中经过不同大网膜标本的测试与优化。肿瘤成功生长依赖于大网膜组织的质量、癌细胞的活力以及注射操作的有效性。在本研究中，仅使用了此前多项研究中已报道的mCherry+ OCSC1-F2细胞和mCherry+ R182人卵巢癌细胞系12,15,16,17,18,19,20,21,22。由于这两种细胞系的倍增时间不同（OCSC1-F2为16小时，R182为36小时），在大网膜组织中达到对数生长期所需时间也存在差异。尽管如此，我们均成功在共培养系统中建立了这两种细胞系的生长模型。
研究人员、研究协调员和外科团队之间的高效沟通对于大网膜标本的采集和处理至关重要。研究人员负责确定符合方案的候选对象，研究协调员在手术前获得患者的知情同意，随后由研究人员从手术室中获取标本。鉴于这一工作流程，研究人员的日程安排必须具有灵活性，因为许多影响标本采集的患者相关因素具有不可预测性（例如手术被取消、手术时间变更、切除的大网膜不足或未切除）。直接在手术室中对组织进行可视化观察和选择，可确保标本的完整性、手术的无菌性以及及时处理。最初，标本采集工作由研究协调员负责；然而，在采集了若干标本后，我们发现处理时间出现延迟（即>4 小时），且大网膜标本质量明显较差（例如组织呈碎片状）。在一次实验中，由于肿瘤细胞未能及时准备就绪，大网膜组织在4 °C条件下保存了48小时后才进行注射。尽管仍观察到类似的肿瘤生长情况，但由于已知温度变化会影响肿瘤微环境（TME），该操作流程未被再次重复。
在采集标本前，根据手术安排，必须确保癌细胞生长达到足够的汇合度。由于每月采集的标本数量不同，卵巢癌细胞的活跃培养物并不总是持续维持。因此，冻存的细胞需至少提前一周解冻，按照标准操作规程接种，并至少传代一次以确保其活性。本方案所使用的细胞系相对耐受性强；然而，我们仍遇到过一些情况，即细胞在手术当日尚未恢复，无法进行注射。在本研究中，从未尝试注射汇合度低于50%的癌细胞。为减少因细胞准备导致的后续延误，我们采用了良好的无菌操作技术，并根据预期的标本采集时间表，以适当的分传比例进行细胞传代以维持汇合度。本方案仅限使用两种荧光标记的癌细胞系，但需要指出的是，其他已建立的癌细胞系或未表达荧光蛋白的原代癌细胞也可被采用。
最后，肿瘤生长速率与注射后紧邻脂肪细胞及位于脂肪细胞内部的癌细胞汇合度相关。这一结果通过注射后对所有大网膜标本进行荧光成像分析确定。与向实体器官或皮下组织接种肿瘤细胞相比，将癌细胞注射至大网膜组织更具挑战性。由于大网膜结构疏松且富含脂肪，难以有效容纳细胞悬液而不发生渗漏。当使用较细的针头（例如30 G或更细）注射时，存在细胞破碎的风险，且观察到细胞增殖能力下降。我们测试了多种注射技术、细胞数量和细胞悬液体积，最终发现上述方案可获得稳定一致的结果。同时，我们也认识到，鉴于这些细胞的恶性特性，对本方案进行某些调整仍可能产生类似结果。添加Matrigel可使注射过程更易操作，因为细胞外基质能更好地固定细胞悬液；然而，该方法成本较高，且并未在样本中持续产生更高的肿瘤负荷。总体而言，大网膜标本未形成肿瘤的情况极为罕见，但肿瘤数量和生长速度存在差异。
该模型通过模拟卵巢癌向富含脂肪的腹膜组织早期转移，再现了卵巢癌致瘤过程的一个典型特征。本方案操作简便，无需特殊技能，易于重复，并可构建具有潜在转化价值的实验体系。与现有的卵巢癌体外（in vitro）和离体（ex vivo）模型相比，本文所述方法结合了多种技术，构建出一种能够在较长生命周期内维持肿瘤结构和肿瘤微环境（TME）的模型。此外，我们观察到，当将含有多个肿瘤的网膜标本转移至新的培养孔中，并与无癌网膜组织（即未注射癌细胞的网膜）共培养时，7天内无癌网膜即被癌细胞定植。该结果提示，所复制的肿瘤通过上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition）保留了转移潜能。据我们所知，目前文献中尚无其他类似的卵巢癌模型能够对组织活检样本进行长期培养。本方法得到了先前研究的支持：从小鼠网膜分离的间皮细胞在获取后可连续培养超过30代23。
本研究中描述的模型可用于进一步理解卵巢癌细胞与富含脂肪的网膜内细胞之间直接相互作用的影响。可从网膜组织中分离并获取癌细胞，用于转录组学或免疫组织化学（IHC）分析。此外，这些细胞还可用于药物反应研究。
该模型的主要局限性在于肿瘤数量、肿瘤生长速度以及肿瘤位置均不可预测。样本间缺乏标准化和存在变异可能限制该模型的应用。在本实验方案的开发过程中，我们还发现了一些需要进一步研究的问题。例如，在某次实验中，一名患者被后续诊断出存在大网膜微转移灶，因此其被标记为"对照"的重复样本实际上并非无癌状态；然而，未注射细胞的肿瘤在整个实验期间仍保持活性。该模型未来的应用将包括对卵巢癌早期肿瘤发生过程中肿瘤微环境（TME）的分子机制研究、通过注射免疫细胞对TME进行干预，以及药物反应的探索。总之，我们认为本文所描述的临床前模型将丰富现有的研究工具体系，并有助于阐明卵巢癌中肿瘤微环境的分子机制。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究部分由珍妮特·伯罗斯纪念基金会资助。我们感谢患者以及卡曼诺斯癌症研究所妇科肿瘤科在大网膜样本采集方面的支持。同时感谢卡曼诺斯癌症研究所生物样本库与相关科学核心实验室在患者招募协调及病理切片制备方面的工作。卡曼诺斯癌症研究所生物样本库与相关科学核心实验室部分由美国国立卫生研究院中心资助项目P30 CA22453支持，该项目资助对象为韦恩州立大学卡曼诺斯癌症研究所。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1x) | Gibco | 25300054 | |
| 1 mL 胰岛素注射器，带 26 G 可拆卸针头 | BD | 329652 | |
| 10 mL 血清移液管 | CELLTREAT | 229010B | |
| 100 mm 组织培养皿 | Fisherbrand | FB012924 | |
| 15 mL 离心管 | CELLTREAT | 229411 | |
| 24 孔细胞培养板 | Costar | 3524 | |
| 50 mL 离心管 | CELLTREAT | 229421 | |
| 75 cm2 组织培养瓶 | CELLTREAT | 229341 | |
| Corning 细胞计数仪 | Corning | 9819000 | |
| Cytation 5 成像仪 | Biotek | ||
| DMEM/F12 (1:1) (1x)，含 L-谷氨酰胺，2.438 g/L 碳酸氢钠 | Gibco | 11320033 | |
| 优质胎牛血清 | Gibco | 1043028 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | 基底膜基质 |
| 10 号不锈钢一次性手术刀 | Integra-Miltex | 4410 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 磷酸盐缓冲液，pH 7.4 (1x) | Gibco | 10010023 | |
| Revolve 显微镜 | Echo |
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