本研究建立了一种大鼠泪腺功能障碍模型，为研究水样液缺乏型干眼症提供基础。
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摘要
摘要
水液缺乏型干眼症（ADDE）是一种可导致泪液分泌量和质减少的干眼病。长期异常的泪液分泌可引起眼表环境紊乱，包括角膜损伤和炎症反应。在严重情况下，ADDE可导致视力下降甚至失明。目前，干眼症的治疗主要局限于使用滴眼液或物理疗法，这些方法仅能缓解眼部不适症状，无法从根本上治愈干眼综合征。为了恢复干眼症患者泪腺的功能，我们建立了由东莨菪碱诱导的大鼠泪腺功能障碍动物模型。通过对泪腺、角膜、结膜及其他相关因素的综合评估，旨在全面揭示ADDE的病理变化。与现有的干眼小鼠模型相比，该ADDE动物模型包含了对泪腺功能的评估，为研究ADDE中泪腺功能障碍提供了更理想的平台。
引言
截至2021年，约有12%的人群受到干眼症的显著影响1，使其成为最常见的慢性眼病之一。根据致病因素的不同，干眼症可分为两种类型：水液缺乏型干眼（ADDE）和蒸发过强型干眼（EDE）2。ADDE又可进一步分为干燥综合征（SS）和非SS型，但在临床上大多数干眼患者为非SS型患者3。慢性干眼症状严重影响患者的视觉质量。目前，干眼症（DED）的常规治疗包括使用人工泪液润滑眼表以及对眼睑进行物理治疗。然而，在许多情况下，干眼症可能无法完全治愈。因此，研究干眼病的发病机制对于开发新的治疗方法和药物至关重要。干眼症的动物模型为深入研究提供了基础。
构建干眼综合征动物模型的方法有很多4，包括通过改变激素水平来调节泪液分泌量。例如，切除大鼠的睾丸可减少雄激素分泌，增加泪液分泌量，并降低泪液中游离分泌成分（SC）和IgA的浓度5,6另一种方法是通过去除控制泪腺的眼表神经来提示泪腺中的自身免疫反应。此外，可通过手术切除泪腺直接减少泪液分泌。7环境条件的改变也可能加速泪液蒸发。例如，在低湿度和干燥通风条件下培养动物，可建立蒸发过强型干眼模型。8，可与其他方法联合使用以加重干眼症状。用于诱导干眼实验模型的主要药物为阿托品和东莨菪碱9作为副交感神经抑制剂，两者均可在泪腺中诱导胆碱能（毒蕈碱型）受体的药理学阻断，从而抑制泪液分泌。与阿托品肌肉注射所致的干眼相比10，东莨菪碱对分泌腺的抑制作用更强，药效持续时间更长，对心脏、小肠和支气管平滑肌的作用较弱。它是干眼动物模型中最为成熟的药物之一。
可采用多种方法使用东莨菪碱诱导干眼，例如皮下注射、药物泵或贴剂给药4,11,12。为了减少对实验动物的给药频率，许多研究人员选择将透皮贴剂贴于小鼠尾部，或使用药物泵。然而，这两种方法均存在局限性。例如，透皮贴剂的吸收需考虑个体小鼠的吸收差异，可能导致药物剂量不一致。尽管药物泵能够精确控制每次给药的剂量，但其并不总是与所用药物或浓度相容。此外，药物泵需通过手术植入，对动物更具侵入性，需要麻醉操作，且存在术后并发症（如伤口裂开）的风险。皮下注射虽然操作较为繁琐，但可确保每次给药剂量准确，并维持不同大鼠间给药的一致性。同时，该方法成本较低，适用于开展大量动物实验。
本研究通过反复皮下注射东莨菪碱建立干眼大鼠模型。我们分析了角膜缺损、泪液分泌水平以及角膜、结膜和泪腺的病理形态等干眼相关指标。结合药物浓度、病理表现及干眼症状，进一步详细阐述该干眼大鼠模型，为干眼治疗及病理机制研究提供更为准确的实验数据。同时，本文还详细描述了造模过程，以供后续研究者参考。
方案
所有按照本方案进行的动物实验均须经机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准后方可开展。
1. 动物准备
- 准备12只健康的6周龄SPF级Wistar雌性大鼠，体重为160 g ± 20 g。
- 使用裂隙灯和检眼镜检查所有大鼠的眼部状况，确保无眼前段或视网膜疾病。
- 将所有大鼠在充足的食物和水源条件下饲养1周。
- 将所有大鼠随机分为正常组、东莨菪碱药物浓度2.5 mg/mL组、东莨菪碱药物浓度5 mg/mL组和东莨菪碱药物浓度7.5 mg/mL组，每组3只动物。
2. 溶液配制
- 通过将氢溴酸东莨菪碱溶解于0.9%氯化钠溶液中，配制浓度为7.5 mg/mL、5 mg/mL和2.5 mg/mL的溶液。
- 配制不含氢溴酸东莨菪碱的0.9%氯化钠溶液，用于大鼠对照组的注射。
3. 仪器与材料准备
- 准备一台小动物显微镜。
- 准备实验所需材料，包括1 mL一次性带针注射器（26 G）；荧光素钠眼科试纸；Schirmer泪液检测试纸条；无水乙醇；4%多聚甲醛；二甲苯；中性树胶；苏木精、伊红；以及过碘酸-雪夫染色试剂盒。
4. 皮下注射
注意：该操作需要第二人协助以固定大鼠。
- 固定大鼠身体，抓住并拉伸其左侧（或右侧）后肢。
注意：可由助手协助固定动物。 - 用酒精清洁注射部位。
- 使用1 mL一次性带针注射器（26 G）插入拇指与食指间皮肤皱褶基部。
- 回抽注射器活塞进行抽吸。若注射器内出现血液，表明针头位置不当；应退出并重新调整针头位置。
- 以稳定流畅的动作注射0.9%氯化钠溶液，可含或不含氢溴酸东莨菪碱。
- 根据不同的浓度对所有大鼠进行注射，每次0.5 mL，每日四次（分别于9:00、12:00、15:00和18:00），连续19天，左右肢体交替注射。
注意：各组命名如下：
不含氢溴酸东莨菪碱组：0组（对照组）
含氢溴酸东莨菪碱2.5 mg/mL组：2.5组
含氢溴酸东莨菪碱5 mg/mL组：5组
含氢溴酸东莨菪碱7.5 mg/mL组：7.5组 - 将动物放回笼中，并观察其呼吸和行为5–10分钟。
5. 泪液分泌试验（Schirmer 泪液试验，STT）
- 为大鼠制备改良的滤纸条11。将用于人类的滤纸条沿中线剪去一半（1 mm × 15 mm），并修剪条带头部使其平滑。
注意：在进行泪液分泌试验前，需手动固定大鼠身体，防止其移动，并确保大鼠眼睛充分暴露。 - 将滤纸条置于大鼠下眼睑结膜囊的外1/3处。
- 计时5分钟。在整个操作过程中控制大鼠眼睛保持闭合。
- 测量完成后，用镊子将滤纸条夹入微量离心管中，并在管壁上标记以记录泪液体积。
- 在第0天、第1天、第3天、第5天、第7天、第11天、第15天和第19天测量泪液分泌量。
6. 角膜荧光素染色
- 将0.5 µL的0.5%荧光素钠溶液滴入每只大鼠的下结膜囊内。
- 滴入荧光素后，在蓝光下观察角膜3分钟。
- 记录每只大鼠角膜的荧光染色情况，并观察是否存在角膜缺损。
- 分别在第0、1、3、5、7、11、15和19天进行角膜荧光素染色检查。
7. 结膜组织的组织学观察
- 模型制备完成后，通过腹腔注射10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）对大鼠进行深度麻醉，以缓解动物的紧张状态。随后通过颈椎脱位法处死大鼠。
- 取各鼠相同部位的球结膜组织，大小约为2 mm × 2 mm。
- 立即将组织用4%多聚甲醛固定24小时，并进行石蜡包埋13。
- 切取5 µm厚的切片，进行苏木精-伊红（HE）染色14和过碘酸-雪夫（PAS）染色（按试剂说明书操作）。
8. 角膜和泪腺组织的组织学观察
- 模型构建完成后，按照步骤 7.1 所述方法处死大鼠。
- 取每只大鼠右侧角膜，并立即置于 4% 多聚甲醛溶液中固定。
- 沿耳部与眼外角连线切开头侧皮肤及皮下组织，向两侧扩大切口，进一步分离淡黄色的眶外腺。
- 彻底去除大鼠毛发，并用 0.9% 氯化钠溶液分离眶外腺。
- 将分离出的眶外腺组织置于 4% 多聚甲醛溶液中固定 24 小时，随后进行石蜡包埋。
- 切取约 5 µm 厚的连续切片，对角膜和眶外腺组织标本进行苏木精-伊红（HE）染色。
9. 统计分析
- 使用适当的软件对数据进行统计分析。
- 采用单因素方差分析（ANOVA）对数据进行分析，并使用最小显著差异（LSD）法进行组间比较。显著性水平设为 α = 0.05，当 P < 0.05 时认为差异具有统计学意义。
注：实验数据的统计分析采用 SPSS 20 软件完成。
- 采用单因素方差分析（ANOVA）对数据进行分析，并使用最小显著差异（LSD）法进行组间比较。显著性水平设为 α = 0.05，当 P < 0.05 时认为差异具有统计学意义。
结果
Schirmer I 试验，SIT I
在实验开始后的第 0、3、5、7、11、15 和 19 天测量大鼠的泪液量。实验结果表明，与对照组（0 组）相比，东莨菪碱组（2.5 组、5 组、7.5 组）的泪液分泌量显著降低，差异具有统计学意义（P < 0.01）。2.5 组、5 组与 7.5 组之间差异无统计学意义（P > 0.05）。各组在不同时间点之间的差异均无显著性（P > 0.05）（图 1，表 1）。
角膜荧光素染色
在实验的第0、3、5、7、11、15和19天进行角膜荧光素染色。结果显示，各组均未出现角膜荧光素染色，表明在为期20天的不同浓度东莨菪碱药物实验过程中，未形成明显的角膜上皮缺损（图2）。
角膜上皮的病理学分析
实验结束后，收集每只大鼠的角膜组织进行苏木精-伊红（HE）染色，以观察角膜上皮的形态并测量角膜上皮层的厚度。对照组的角膜上皮由4–6层有序排列的上皮细胞组成，其中基底层由一层排列整齐且紧密的柱状上皮细胞构成。东莨菪碱2.5、5和7组的角膜上皮明显比对照组更薄，细胞形态扁平、萎缩，细胞结构紊乱。在7.5组中，基底层出现细胞间连接疏松及空泡样结构（图3中红色箭头所示）。与东莨菪碱各组的角膜上皮相比，正常对照组的角膜上皮层厚度具有统计学差异（图4）。
泪腺的病理学分析
大鼠泪液分泌的主要腺体是眶外泪腺15观察泪腺切片时，随着东莨菪碱浓度的增加，泪腺上皮细胞形态发生改变，并伴有炎症和组织水肿；对照组未见此类变化。病理学结果提示，泪腺的炎症性改变、细胞水肿以及腺上皮细胞萎缩可作为泪腺功能损伤的指标16 (表 2）。这些指标可用于根据泪液分泌量来评估干眼症的严重程度（图5).
结膜染色结果分析
对照组结膜结构完整，主要由表层和固有层构成。表层为复层柱状上皮细胞，表面光滑完整，细胞表面具有微绒毛。上皮细胞间散在杯状细胞，细胞体积较大，胞质内含有黏液颗粒。三种东莨菪碱药物组的结膜上皮表层明显变薄，微绒毛和杯状细胞数量减少，细胞排列结构不完整，伴有水肿现象，HE染色中可见少量炎性细胞浸润（图6）。
通过PAS染色结膜，计算每只小鼠三个独立样本中40倍显微镜视野下的平均杯状细胞数，并以均值±标准差表示（图7).
图1：各组泪液分泌试验值统计结果（mm）请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：大鼠角膜的荧光素钠染色。 在为期20天的荧光素钠实验中，所有大鼠的角膜均未观察到阳性结果。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：角膜上皮染色与厚度测量。 在7.5组中，基底层可见细胞间连接松散及空泡样结构（红色箭头所示）请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：各组角膜上皮厚度的统计结果。 与东莨菪碱组的角膜上皮相比，正常对照组的角膜上皮层厚度显示出统计学差异。请点击此处查看此图的放大版本。
图 5：大鼠眶外泪腺的 HE 染色结果。（A）0 组：视野中，泪腺呈小叶状结构，由导管和管状腺组成，导管形态无明显异常；管状腺由锥形腺细胞构成，胞质内含丰富的黏液样物质，间质结缔组织无明显水肿，间质血管无明显异常，亦无明显坏死及炎性细胞浸润。（B）2.5 组：视野中偶见泪腺上皮细胞萎缩，体积缩小，腺腔呈不规则扩张，腔内黏液样物质减少（红箭头所示）；间质中偶见游离淋巴细胞浸润（蓝箭头所示），但导管形态无明显异常，亦无水肿表现。（C）5 组：视野中泪腺上皮细胞偶见萎缩、体积减小，腺腔扩大，腔内黏液样物质减少（红箭头所示）；间质中偶见游离淋巴细胞浸润（蓝箭头所示）；导管形态及泪腺小叶间结缔组织未见明显水肿或其他异常。（D）7.5 组：视野中可见水肿表现，泪腺间间距增宽，排列不规则（绿箭头所示）；泪腺上皮细胞多见萎缩，体积变小，形态不规则（黄箭头所示）；偶见腺腔扩大，腔内黏液样物质减少（红箭头所示），偶见游离淋巴细胞浸润（蓝箭头所示），导管形态无明显异常。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：大鼠结膜的苏木精-伊红染色。 与对照组的结膜上皮相比，三种东莨菪碱处理组的结膜上皮均表现出不同程度的结构损伤。 请点击此处查看该图的放大版本。
图7：结膜的PAS染色。（A）正常对照组大鼠。（B）东莨菪碱组大鼠。（C）各组杯状细胞密度（20倍放大）。黑色标尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
| Schirmer I 试验，SIT（平均值，单位 [mm]） | |||||||
| 组别 | 0 天 | 3 天 | 5 天 | 7 天 | 11 天 | 15 天 | 19 天 |
| 0 | 6 | 4.2 | 5 | 8 | 7 | 5.5 | 6.3 |
| 2.5 | 2 | 2.7 | 2 | 2.7 | 3.3 | 3.7 | 3 |
| 5 | 2.3 | 2.7 | 1.7 | 2.3 | 3.2 | 3.7 | 3 |
| 7.5 | 2.3 | 3.2 | 2.5 | 2.8 | 2.7 | 3.2 | 2.8 |
表1：四组大鼠在不同时间点的Schirmer泪液分泌试验结果（mm）。 用药后，大鼠的泪液分泌量显著减少。
| 编号 | 坏死 | 炎症 | 水肿 | 上皮萎缩 |
| 0 组-1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 组-2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 组-3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2.5 组-1 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 2.5 组-2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2.5 组-3 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 组-1 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 组-2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 5 组-3 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| 7.5 组-1 | 0 | 1 | 2 | 1 |
| 7.5 组-2 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| 7.5 组-3 | 0 | 1 | 2 | 2 |
表2：大鼠泪腺的病理组织学评分。 评分标准：0分：在正常条件下，综合考虑动物年龄、性别和品系等因素，组织视为正常；
1：观察到的变化刚刚超出正常范围；2：可以观察到病灶，但尚未达到严重程度；3：病灶明显且持续恶化；4：病灶极为严重，已累及整个组织16。
讨论
水液缺乏型干眼（ADDE）是一种重要的干眼类型，约占全部干眼患者总数的1/317，其主要病因是泪腺的病理性损伤和炎症13。对于此类干眼，临床上最常用的治疗方法是使用人工泪液以缓解症状，或局部应用类固醇或环孢素18，然而针对泪腺损伤的治疗选择仍十分有限。因此，探索泪腺功能重建对干眼的影响，并建立泪腺功能障碍的动物模型具有重要意义。我们采用反复给药的方法抑制大鼠泪腺分泌，成功构建了一种慢性泪腺功能障碍性干眼动物模型。
我们选择大鼠构建此干眼模型，与其他动物模型相比具有更多优势19。例如，兔的体型较大，需要更高剂量的药物或更频繁的注射才能达到预期效果。此外，兔的成本略高，会增加实验开支。小鼠也常用于眼科研究，但通常用于构建干燥综合征模型20，这些模型主要通过比较器官炎症和淋巴细胞浸润来探讨免疫病理机制。小鼠体型小，泪腺解剖结构复杂，且泪液分泌量低，难以准确反映泪液生成情况。大鼠动物模型作为干眼模型更为合适，因其便于给药注射，饲养条件相对简单，适用于临床和实验研究，同时在成本方面也具有优势，是研究ADDE的理想动物模型。
我们应用胆碱能受体阻滞剂东莨菪碱，以抑制大鼠体内的胆碱能受体，减少泪腺分泌，并改变泪腺细胞的病理结构，从而在根本上模拟干眼症患者泪腺的状态。与其他方法相比，该方法能更好地模拟泪腺在自然状态下受损的情况。其他方法，如使用苯扎氯铵滴眼液21，或改变外部环境条件（如降低湿度、增加眼表蒸发）4,8，仅破坏眼表环境，而不会改变泪腺的功能状态，因此不适合用于长期、慢性的干眼症研究。
在测量大鼠泪液分泌量时，我们对Schirmer泪液试纸条进行了改良。首先，将人用泪液试纸条沿中线剪开。然后，将顶端修剪成圆弧形，并在顶部轻轻向后折叠，以便于顺利插入大鼠的下结膜囊。需要注意的是，大鼠活动性强，难以在5分钟内保持安静以完成测量。将Schirmer泪液试纸条插入大鼠下结膜囊后，我们手动闭合大鼠的眼睑，以提高其舒适度，避免因长时间测量过程中挣扎而影响测量结果。
在提取泪腺时，首先需要定位泪腺。泪腺的定位点位于耳前缘与内眦之间的中点。然后，在毛皮下切开皮肤组织，尽量减少碎毛进入，并减少后续操作过程中的处理步骤。在提取过程中，还需及时清理碎毛。特别是在分离泪腺时，应使用磷酸盐缓冲液（PBS）或生理盐水反复冲洗，避免混入可能影响切片结果的其他组织。
所建立的干眼动物模型的优势在于，该方案将不同药物浓度与泪腺损伤的不同程度相关联，为研究泪腺功能障碍的治疗提供了实验依据。我们优化了建模过程中的部分操作步骤，为研究人员提供了更为详尽的参考材料。此外，我们增加了干眼动物模型的分析指标，纳入了角膜、结膜和泪腺的形态学指标，进行了结膜细胞计数，并对泪腺损伤程度进行评分。我们从炎症、水肿和萎缩等方面评估了泪腺功能。我们选择了最全面、经济高效且准确的分析方法，以反映干眼症及泪腺功能障碍的程度。
然而，我们的方法也存在一定的局限性。由于构建动物模型的过程较为漫长，实验人员需要反复进行注射。尽管目前已有部分方法可替代人工注射，例如药物泵或透皮贴剂，但这些方法在使用中仍存在一些并发症。如何应用更优的方法以减少给药频率、避免并发症的发生，并确保剂量的准确性，是我们下一步的目标。综上所述，我们改进了由东莨菪碱注射引起的干眼动物模型，为针对ADDE中泪腺功能障碍的研究提供了实验依据。
披露
作者与本实验所用药物和材料无任何潜在的利益冲突。
致谢
本研究由广东省高水平临床重点专科（SZGSP014）和深圳市自然科学基金（JCYJ20210324125805012）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.9% 氯化钠溶液 | SJZ No.4 制药厂 | H13023201 | |
| 4% 多聚甲醛 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | G1113 | |
| 无水乙醇 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10009218 | |
| 荧光素钠眼科试纸条 | 天津伊诺新康医疗器械科技有限公司 | YN-YG-I | |
| 苏木精和伊红 | 南京建成生物工程研究所 | D006 | |
| 中性树胶 | 北京索莱宝科技有限公司 &科技有限公司 | G8590 | |
| 石蜡 | 北京索莱宝科技有限公司 &科技有限公司 | YA0012 | |
| 过碘酸-雪夫染色试剂盒 | 碧云天生物技术 | C0142S | |
| Schirmer 泪液检测试纸条 | 天津银诺新康医疗器械科技有限公司 | YN-LZ-I | |
| 氢溴酸东莨菪碱 | 上海麦克林生化有限公司 | S860151 | |
| 小型动物显微镜 | Head Biotechnology Co,. Ltd | ZM191 | |
| 二甲苯 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10023418 |
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