晶状体自动压缩测试

摘要

我们提出了一种利用压缩试验自动表征眼晶状体有效弹性模量的方法。

摘要

晶状体的生物力学特性对其作为可变屈光力光学元件的功能至关重要。这些特性在人眼晶状体中会随年龄显著变化，导致一种称为老视的近视力丧失。然而，这些变化的具体机制仍不清楚。晶状体压缩测试提供了一种相对简单的方法，可定性评估晶状体的生物力学刚度，若结合适当的分析技术，还可用于量化其生物力学特性。迄今为止已开展多种晶状体压缩实验，包括手动和自动方法，但这些方法在生物力学测试的关键要素（如预加载处理、加载速率以及测量间隔时间）的应用上存在不一致。本文介绍一种完全自动化的晶状体压缩测试方法，其中电动载物台与相机同步，以在预设的加载程序过程中连续记录晶状体的力、位移和形态。随后可基于这些数据计算出特征弹性模量。尽管本研究以猪晶状体为例进行演示，但该方法适用于任何物种晶状体的压缩测试。

引言

晶状体是眼睛中一种透明且富有弹性的器官，可通过改变其屈光力来实现对不同距离物体的聚焦，这种能力称为调节。屈光力的改变源于睫状肌的收缩与舒张。当睫状肌收缩时，晶状体增厚并向前移动，从而增加其屈光力^1,2。屈光力的增加使晶状体能够聚焦于近处物体。随着人类年龄增长，晶状体会逐渐变硬，调节能力也随之逐渐丧失；这一状况被称为老视。晶状体硬化的确切机制尚不明确，部分原因在于晶状体生物力学特性表征存在技术困难。

已有多种方法被用于评估晶状体的刚度及其生物力学特性。这些方法包括晶状体旋转^3,4,5、声学方法^6,7,8、光学方法（如布里渊显微镜技术）⁹、压痕法^10,11以及压缩法^12,13。其中，压缩法是最易于实现的实验技术，因其仅需简单的仪器（例如玻璃盖玻片^14,15）或单一的电机化载物台即可完成。我们此前已证明，如何通过压缩实验严格估算晶状体的生物力学特性¹⁶。然而，该过程在技术上具有挑战性，且需要使用专业软件，而这类软件对于仅关注相对刚度测量的晶状体研究人员而言往往难以获取。因此，在本研究中，我们聚焦于在考虑晶状体尺寸的前提下，易于实现的晶状体弹性模量估算方法。弹性模量是一种与材料可变形性相关的固有材料属性：弹性模量越高，材料越刚硬。

该测试本身为平行板压缩试验，因此可在合适的商用力学测试系统上进行。此处构建了一台定制仪器，由电机、线性平台、运动控制器、载荷传感器和放大器组成。这些部件通过定制软件进行控制，同时以固定时间间隔记录时间、位移和载荷。猪晶状体虽无调节能力，但易于获取且成本低廉¹⁷。以下方法旨在对晶状体进行逐级压缩，并量化其弹性模量。该方法易于重复，将有助于晶状体刚度的研究。

方案

猪眼取自当地屠宰场。无需伦理委员会批准。

1. 晶状体解剖（图1）

1. 去除猪眼周围的所有组织以及巩膜上的多余肌肉，直至仅留下视神经。使用弯头镊子和小型解剖剪完成此操作。在解剖过程中，可利用视神经作为固定点来握住眼球。
2. 使用手术刀在角膜缘处做一个短的环形切口，然后在赤道部再做另一个环形切口。
   注意：此步骤按此顺序进行，以避免损伤晶状体及其囊膜。
3. 将显微剪插入角膜缘切口，用精细的钝头镊子提起角膜，同时沿角膜周缘剪切，将其完整移除。
4. 用钝头镊子提起虹膜，并用显微剪将其剪除。
5. 将解剖剪插入赤道部切口，沿整个赤道部做环形剪切，直至将巩膜完全分为两半。
6. 完成切口后，移除巩膜的后部。用镊子轻柔地去除玻璃体，仅保留少量残留物，以避免损伤晶状体。如有需要，可冠状面剪切玻璃体，以便后部组织从晶状体和眼前段分离。
7. 使用显微剪从眼前段至后段方向，沿子午线方向穿过巩膜做一切口。
8. 从巩膜新的子午线切口开始，用显微剪将悬韧带从晶状体上剪断。在轻微拉开晶状体与巩膜时，利用晶状体自身重量或解剖皿边缘轻柔拉伸悬韧带，使显微剪可在晶状体与睫状体之间、穿过悬韧带，并沿晶状体周缘进行剪切。若操作正确，此步骤可在不损伤晶状体囊膜的前提下将晶状体完整分离。
9. 如需要，可用镊子在晶状体囊膜赤道部穿刺，再用两把镊子将囊膜剥离移除。
10. 将晶状体置于磷酸盐缓冲液（PBS）中。在进行力学测试前，目视检查晶状体是否存在任何损伤。

2. 晶状体压缩（含/不含晶状体囊膜）（图2）

注意：此处所有步骤中，除步骤 2.1 和 2.4 外，其余均由计算机控制。

1. 获取或构建一个具有50克力容量传感器的平行板压缩装置，并能够测量约1 µm量级的位移。
2. 对电机驱动平台进行编程并加载，以执行如下所述的加载程序（例如，补充文件1）。
3. 用PBS几乎装满一个尺寸为1 5/8英寸×1 5/8英寸的方形容器，并将其放置在压缩平台上。
4. 将上板下降至与下板接触，以确定运动的下限位置和绝对间隙高度。
5. 将上板抬高约15 mm。
6. 将晶状体居中放置于容器内，注意使其赤道平面保持水平。
7. 将上板缓慢下移至接近晶状体上表面，但尚未接触的位置。
8. 启动运动，使上板接触晶状体，采用力反馈控制，接触力阈值设为3 mN。
9. 在确认接触后开始数据记录，以500 Hz频率记录时间、上板相对于下板的位置以及作用力。
10. 进行预加载处理：以1%/s的速率，先将晶状体压缩至其初始高度的2.5%，重复3次；然后压缩至5%，重复3次；再压缩至7.5%，重复3次。
11. 预加载完成后，保持上板位置恒定1分钟。
12. 以1%/s的速率施加15%的压缩，随后以相同速率卸载。
13. 继续卸载运动，直至上板相对于未加载状态下的晶状体厚度再向上移动2%，以确保晶状体完全脱离上板。

3. 晶状体模量的估算

1. 根据仪器在接触点处的间隙估算晶状体的厚度。或者，在测试前拍摄照片，并通过图像分析测量厚度。
2. 使用赫兹模型（平行板间球体压缩模型）计算弹性模量 E（公式[1]；补充文件 2）。
        (1)
   其中 R 为接触点处的曲率半径（假设等于晶状体厚度的一半）；F 为载荷传感器报告的压缩力； 为泊松比（假设为 0.5，对应不可压缩材料）；u 为上部平台从接触点开始的向下位移。需注意，弹性模量和泊松比是材料属性，分别表示晶状体的本征刚度和相对可压缩性。
   注意：该方法忽略了晶状体囊膜的作用，但大致考虑了晶状体尺寸，从而允许在不同物种间进行比较。

结果

对六个猪晶状体进行了压缩测试，首先在囊膜完整的情况下进行，然后在仔细去除囊膜后再次进行。囊膜完整晶状体的厚度为 7.65 ± 0.43 mm，去囊膜晶状体的厚度为 6.69 ± 0.29 mm（均值 ± 标准差）。典型的加载过程如图3所示。所得的力-位移曲线与赫兹模型拟合良好（即力与位移的1.5次方成正比；图4）。该结果在囊膜完整和去囊膜晶状体中均成立。

首先对囊膜完整的晶状体施加相当于其无负载厚度15%的轴向压缩，随后在去除囊膜后再次进行相同程度的压缩。先前研究表明，对初始厚度进行15%的轴向压缩不会对晶状体缝合结构造成损伤¹⁸。去囊膜导致有效弹性模量显著降低（n = 6；p = 0.0138；图5）。

图 1：解剖技术。（A）去除眼外组织。（B）在角膜缘处做环形切口。（C）在赤道部做环形切口。（D）移除角膜。（E）移除虹膜。（F）在赤道部将眼球一分为二，然后（G）去除玻璃体，留下（H）一个环形结构，其中晶状体、睫状体和悬韧带仍附着于巩膜上。（I）通过巩膜做一条子午线切口，以（J）暴露悬韧带，（K）将其切断，从而留下（L）带囊的晶状体。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：压缩测试装置。（A）透镜压缩装置的示意图和（B）实物照片。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：封装猪晶状体的施加载荷历史。 上图：位移历史；下图：力历史。请点击此处查看此图的放大版本。

图 4：采用赫兹模型拟合的典型力-位移数据。 左图：封装状态下猪晶状体的数据。右图：同一晶状体去囊膜后的压缩数据。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：猪晶状体在包膜完整与去包膜状态下的有效弹性模量的箱须图。 包膜完整晶状体的有效模量显著高于去包膜晶状体（p = 0.013），表明包膜的存在可显著改变晶状体的有效刚度。数据来自六个晶状体。请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件 1：用于控制透镜压缩装置的 MATLAB 应用程序。 请点击此处下载该文件。

补充文件 2：用于从力-压缩数据估算弹性模量的 MATLAB 函数。 请点击此处下载该文件。

讨论

透镜压缩是一种用于评估透镜刚度的多功能方法。上述描述的实验步骤可用于比较不同物种及不同尺寸透镜之间的力学特性。所有形变均相对于透镜尺寸进行了归一化处理，且弹性模量的计算在近似程度上已考虑了透镜尺寸的影响。有效模量明显高于此前报道的猪眼透镜模量^4,7,11,19，部分原因在于本研究采用的是透镜厚度而非曲率半径作为参数：猪眼透镜的极向曲率半径显著大于其厚度的一半²⁰。

本文所介绍的简单分析方法（即赫兹模型的应用）存在若干关键局限性。首先，该方法未考虑晶状体囊膜的存在。已有研究表明，囊膜的存在可能显著改变晶状体的生物力学特性^16,21。因此，该方法最适合应用于去囊膜的晶状体。当比较不同物种时，若其囊膜在厚度或生物力学特性方面存在显著差异，则这一点尤为重要。此外，该方法假设晶状体在力学上是均质的，而我们及其他研究者先前已证明，猪和人晶状体通常并不满足这一条件^{4,5,6,10,11,22}。因此，最好将所计算出的弹性模量值视为一种有效模量，该模量可能与晶状体内空间变化模量的体积平均值相关。赫兹模型假设晶状体为线弹性材料，但实际上晶状体具有黏弹性；因此，本文提出的简化分析方法无法提供有关晶状体黏弹性的信息。先前的研究还表明，测试前晶状体的保存方法和保存时间可能会影响其力学特性⁴；因此，所有猪晶状体均在解剖后送达实验室的第一时间立即进行测试。

力-位移测量值的差异源于载荷传感器放大器的噪声：去除囊膜后，测得的力显著降低，因此信噪比也随之降低。推导赫兹模型时的重要假设之一是球体为均质材料；因此，当囊膜存在时，所得到的有效弹性模量实际上是对晶状体及其囊膜变形能力的一种综合平均。这使得不同物种之间以及不同年龄之间的比较尤为困难，因为猪晶状体的囊膜厚度约为 60 µm，而小鼠或人晶状体的囊膜厚度则在 5–15 µm 范围内。囊膜的弹性模量也可能随物种和年龄变化，但这些依赖关系目前尚不明确。因此，尽管保留囊膜时可能获得噪声更小的拟合结果，但囊膜的存在本身会干扰比较的准确性——这正是我们建议在去除囊膜的情况下进行测试的原因。

最后，假设曲率半径等于晶状体厚度的一半，据此计算有效模量。该假设仅适用于球形晶状体；而猪晶状体明显为非球面，因此若采用实际曲率半径，所得有效模量值将显著高于当前结果。这一假设可通过测量曲率半径加以改进，但因晶状体下表面始终与下压板接触而呈平面，其曲率测量较为复杂。对于更接近球形的晶状体（如小鼠晶状体），该假设的影响则较小。更优的方法是采用逆向有限元分析来确定晶状体的力学特性¹⁶。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
弯曲中型尖头通用镊子	Fisherbrand	16-100-110
Galil COM 库	Galil Motion Control
高精度手术刀柄	Fisherbrand	12-000-164
直线位移平台	McMaster-Carr	6734K4 0.125"
测力传感器	FUTEK	LSB200-FSH03869
测力传感器放大器	FUTEK	IAA300-FSH03931
MATLAB	The Mathworks, Inc.
微探针	Surgical Design	22-079-740
微型自开式精密剪刀	Excelta	63042-004
运动控制器	Galil Motion Control	DMC-31012
电机	Galil Motion Control	BLM-N23-50-1000-B
直型止血钳	Fine Science	NC9247203	不锈钢，14 cm