小鼠结直肠炎癌模型的建立及中药治疗效果评价

摘要

本方案提供了一种由偶氮甲烷联合硫酸葡聚糖钠诱导的溃疡性直肠结肠炎相关性结直肠癌的小鼠模型。该模型用于评价中药复方在结直肠癌预防和治疗中的有效性。

摘要

结直肠癌（CRC）是消化系统常见的恶性肿瘤，已成为全球第三大常见恶性肿瘤，以及恶性肿瘤相关死亡的第二大原因。溃疡性结肠直肠炎（UC）是一种癌前病变，与UC相关的结直肠癌（UC-CRC）是CRC最常见的亚型。因此，建立合理的UC-CRC模型是新药研发的基础和保障。由于疗效良好，中药（TCM）已被广泛用于UC-CRC的治疗。六君子汤（LJZD）作为中药的经典补益方剂，已在UC-CRC治疗中得到广泛应用。本研究通过联合使用偶氮甲烷和葡聚糖硫酸钠建立UC-CRC模型，并给予LJZD干预。实验数据证实，LJZD可通过小鼠体重、结直肠长度、病理学与炎症因子、结直肠屏障功能及癌症标志物等指标，有效抑制UC-CRC的癌变进程。该方案为评价中药在UC-CRC防治中的疗效提供了一个系统性研究体系。

引言

结直肠癌（CRC）是一种常见的消化道恶性肿瘤，为全球第三大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第二大原因，占全球癌症发病总数的10%和癌症相关死亡总数的9.4%^1,2。遗传因素、慢性炎症、高脂饮食、糖尿病以及肠道菌群失调是结直肠癌的危险因素^3,4。其中，炎症性肠病，尤其是溃疡性结直肠炎（UC），是结直肠癌明确的危险因素^5,6。与UC相关的结直肠癌（UC-CRC）是在结直肠慢性炎症基础上，由炎症、异型增生发展为癌症的过程，不同于典型的结直肠癌腺瘤-腺癌发展模型^7,8。与一般人群相比，炎症性肠病患者的结直肠癌风险约高出10至40倍⁹。

目前，手术仍是结直肠癌（CRC）的标准治疗方法，根据肿瘤的位置和分期，可辅以放疗、全身药物治疗或两者联合治疗¹⁰。尽管这些传统治疗手段已取得显著进展，但由于结直肠癌具有高度异质性和高复发率，患者....

方案

动物实验已获得长春中医药大学伦理委员会的批准（记录编号：2021214）。使用特定病原体-free C57BL/6J小鼠（8–10周龄，体重18–22 g），雌雄均有，饲养于独立通风笼具中，环境温度为22 °C，相对湿度为65%。小鼠在适应性喂养7天后开始实验，期间可自由饮水和进食。

1. 药物制备

1. LJZD 的制备
   ​注意：所用中药购自长春中医药大学附属医院，并经鉴定为正品中药（见表1）。
   1. 将党参（12 g）、白术（12 g）、甘草（6 g）、陈皮（12 g）、姜半夏（9 g）放入专用陶瓷锅中（见材料表）。加入 1000 mL 蒸馏水，在室温下浸泡 1 h（见图1A）。
   2. 将 12 g 茯苓用研磨机研成细粉，置于另一容器中，加入 300 mL 蒸馏水，在室温下浸泡 1 h。
   3. 将上述中药混合于专用陶瓷锅中，煮沸后改用中火持续加热，直至药液体积浓缩至 300 mL。使用医用纱布过滤，滤液于室温下保存。
   4. 加入 1000 mL 蒸馏水，重复上述煎煮操作一次，再次用医用纱布过滤。合并两次滤液并加热煮沸，直至剩余体积为 150 mL。
   5. 将浓缩液在 10,000 ×

结果

LJZD汤剂根据方中药物的配伍比例制备 表1 以及中药的煎煮方法 图1A. 根据所指示的时间点 图1B，小鼠在第7天通过腹腔注射1 mg/mL AOM^th 天，小鼠可自由饮用含有 2% DSS 的饮用水^rd, 6^th，和 9^th 周。已成功建立UC-CRC小鼠模型于15^th 周。同时，从第7周到第15周，通过灌胃给予小鼠LJZD治疗。数据显示，与对照组相比，UC-CRC模型组小鼠体重显著下降，而LJZD治疗可缓解该体重下降情况（图2A，P < 0.01）。试验结束时，与UC-CRC模型组相比，LJZD治疗改善了DAI评分（图2B）。与对照组相比，UC-CRC模型组的结直肠长度较短，而经LJZD处理后该长度增加（图.......

讨论

结直肠癌（CRC）是全球最常见的癌症之一，每年约有 1,148,000 例新发病例和超过 576,000 例死亡病例。根据病因不同，CRC 可分为遗传性、散发性和 UC-CRC 三种类型³¹。患有溃疡性结肠炎（UC）等炎症性肠病的患者，其结直肠癌发病率显著高于普通人群。UC 通过炎症-癌症通路促进结直肠癌的发生，这与典型的腺瘤-腺癌通路不同⁶。目前，UC-CRC 的病因尚不明确，主要由长期反复的慢性炎症引起，死亡率高达 60%^32,33。针对 UC-CRC 尚无有效治疗方法，近年来已成为研究热点。阐明 UC-CRC 的分子机制对于其早期发现和精准治疗至关重要。

目前，构建 UC-CRC 动物模型的方法有很多，其成瘤机制各不相同。IL-10 或 Muc2/4 基因敲除可导致上皮屏障缺陷，从而在小鼠中诱发自发性结肠炎，因此常用于构建基于与 .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
偶氮甲烷	Sigma	A5486
5-氨基水杨酸	葵花药业集团佳木斯鹿灵制药有限公司	3819413
C57BL/6J 小鼠	辽宁长生生物技术股份有限公司	NO 210726210100853716
盖玻片	江苏世泰实验器材有限公司	10212432C
DAB 显色试剂盒	江苏世泰实验器材有限公司	2005289
脱水机	武汉俊杰电子有限公司	JJ-12J
葡聚糖硫酸钠	大连美仑生物技术有限公司	MB5535
包埋机	武汉俊杰电子有限公司	JB-P5
苏木精-伊红染液	武汉佰度生物技术有限公司	B1000
IL-6	江苏美因生物科技有限公司	MM-0163M2
异氟烷	RWD 生命科学有限公司	R510-22-10
KI67 一抗	Google 生物科技公司	GB121141
中性树胶	武汉佰度生物技术有限公司	10004160
载玻片	江苏世泰实验器材有限公司	10212432A
Occludin 一抗	Affnity	DF7504
正置光学显微镜	Nikon	Nikon Eclipse CI
病理切片机	上海徕卡仪器有限公司	RM2016
ZO-1 一抗	Abcam	ab221547