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方法文章

利用人皮肤成纤维细胞展示自组装细胞片培养及手动构建类肌腱/韧带三维类器官 关键词：自组装细胞片，三维类器官，人皮肤成纤维细胞，肌腱样组织，韧带样组织

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DOI：

10.3791/66047

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2024年6月21日

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1Department of Musculoskeletal Tissue Regeneration, Orthopaedic Hospital König-Ludwig-Haus, University of Würzburg, 2Laboratory for Experimental Trauma Surgery, Department of Trauma Surgery, University Hospital Regensburg, 3Department of Orthopaedics, Orthopaedic Hospital König-Ludwig-Haus, University of Würzburg

本文内容

摘要

本文展示了一种三步法类器官模型（二维[2D]扩增、二维[2D]刺激、三维[3D]成熟），该模型为肌腱基础研究提供了一种有前景的工具，也为肌腱组织工程提供了一种潜在的无支架方法。

摘要

肌腱和韧带（T/L）是强韧的、具有层级结构的组织，连接着 的 肌肉骨骼系统。这些组织具有严格排列的胶原类型 富含I型胶原的细胞外基质（ECM）及T/L系细胞主要呈平行排列。损伤后，T/L组织修复过程耗时较长，失败风险高，且常导致不理想的修复结果。尽管近年来在T/L生物学研究方面取得了进展，但该领域仍面临一个未解决的挑战：目前尚缺乏能够模拟T/L形成过程的标准化分化方案。 体外例如，间充质前体细胞向骨和脂肪的分化仅需标准的二维（2D）细胞培养及特定诱导培养基的添加。而向软骨分化则需要三维（3D）团块培养并补充TGFß。然而，细胞向肌腱分化需要一种高度有序的三维培养模型，理想情况下还应能够接受动态力学刺激。我们已建立一种三步法（扩增、诱导和成熟）类器官模型，可通过自组装细胞片形成具有棒状结构的三维组织，该结构可提供包含自身细胞外基质（ECM）、自分泌和旁分泌因子在内的天然微环境。这些棒状类器官在富含ECM的环境中具有多层细胞结构，并可方便地用于施加静态力学应变。本文中，我们以 commercially available dermal fibroblasts（商品化皮肤成纤维细胞）为例，展示了该三步法操作流程。结果表明，此类细胞可形成结构稳定且富含ECM的类器官。所述实验流程可在培养基成分方面进一步优化，并可进一步发展为施加动态轴向力学刺激的培养体系。同样，也可测试其他细胞来源是否具有形成肌腱/韧带（T/L）类器官的潜力，从而实现T/L方向的分化。综上所述，所建立的三维T/L类器官模型可用于肌腱基础研究，甚至可用于无支架的T/L组织工程。

引言

肌腱和韧带（T/L）是肌肉骨骼系统的重要组成部分，为身体提供必要的支撑和稳定性。尽管它们具有关键作用，但这些结缔组织容易发生退变和损伤，导致疼痛和活动能力受限1此外，由于其血液供应有限且愈合能力较弱，可能导致慢性损伤，而年龄增长、重复性动作以及不恰当的康复等因素会进一步增加退变和损伤的风险。2传统的治疗方法，如休息、物理治疗和手术干预，均无法完全恢复T/L的结构与功能。近年来，研究人员一直致力于深入理解T/L复杂的特性，以寻求治疗T/L疾病的有效方法3,4,5T/L 通过一种层次化组织、以细胞外基质（ECM）为主的结构进行区分，该结构主要由 I 型胶原纤维和蛋白聚糖组成，这一特征难以复制 体外6传统的二维（2D）细胞培养模型无法模拟T/L组织特有的三维（3D）结构，限制了其在T/L再生领域的转化潜力，也阻碍了该领域的创新进展。

近年来，三维类器官模型的发展为推进各类组织的基础研究及无支架组织工程提供了新的可能性7,8,9,10,11,12,13例如，为了研究肌腱结合部，Larkin 等人（2006）开发了三维骨骼肌结构，并结合由大鼠尾腱衍生的自组织肌腱片段10此外，Schiele 等人（2013）利用微加工的纤维连接蛋白包被的生长通道，引导人真皮成纤维细胞自组装形成细胞纤维，无需三维支架的辅助，该方法能够捕捉胚胎肌腱发育的关键特征。11在Florida等人2016年的研究中，首先将骨髓基质细胞扩增分化为骨和韧带谱系，随后用于生成自组装的单层细胞片，进而构建出模拟天然前交叉韧带的多相骨-韧带-骨结构，该模型旨在增进对韧带再生机制的理解12为阐明肌腱的力传导机制，Mubyana 等人（2018）采用了一种无支架方法，通过该方法构建单根肌腱纤维并施加机械负荷方案。13类器官是能够自我组织的三维结构，可模拟组织的天然结构、微环境及功能。三维类器官培养体系为研究组织和器官的生物学及其病理生理过程提供了更具生理相关性的模型。此类模型还可用于诱导不同类型干细胞/前体细胞向特定组织分化。14,15因此，在T/L生物学和组织工程领域采用3D类器官模型成为一种极具吸引力的研究策略9,16可采用其他细胞来源进行类器官组装，并诱导其向腱系分化。本研究中用于示范的一种相关细胞类型是皮肤成纤维细胞。7,17,18这些细胞可通过皮肤活检获取，相较于骨髓穿刺或吸脂术，该方法侵入性更小，并且由于其良好的增殖能力，可在较短时间内扩增至较大数量。相比之下，更为特化的细胞类型（如T/L区驻留成纤维细胞）的分离与扩增则更具挑战性。因此，真皮成纤维细胞也被用作细胞重编程技术的起始材料，以诱导生成多能性胚胎干细胞。19将真皮成纤维细胞置于特定的三维培养条件和信号刺激下，例如转化生长因子-β3（TGFß3）——据报道称该因子可作为多种细胞过程的关键调节因子，包括T/L的形成与维持，可增强其 体外 向腱系分化，导致腱特异性基因的表达以及腱/韧带典型细胞外基质的沉积20,21.

在此，我们描述并演示了一种先前已建立并实施的三步法类器官培养方案（二维扩增、二维诱导和三维成熟），该方案采用市售的正常成人人类皮肤成纤维细胞（NHDFs）作为细胞来源，为研究提供了有价值的模型 体外 成腱分化7尽管该模型并不等同于 体内 T/L 组织，它仍提供了一个更具生理相关性的系统，可用于研究细胞分化机制，模拟 T/L 的病理生理学过程 体外以及建立个性化的T/L医学和药物筛选平台。此外，未来的研究可进一步评估3D类器官是否可通过进一步优化，适用于无支架的T/L工程，并可用于开发大规模、力学性能强的构建体，使其在尺寸以及结构和生物物理特性上更接近天然T/L组织。

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方案

注意：所有步骤必须使用无菌技术进行。

1. NHDFs 的培养与预扩增

  1. 将含有成人冷冻保存的正常人真皮成纤维细胞（NHDFs，1 × 106 个细胞）的冻存管在 37 °C 快速解冻，直至几乎完全融化。
  2. 缓慢加入 1 mL 预热至 37 °C 的成纤维细胞生长培养基 2（即用型试剂盒，包含基础培养基、2% 胎牛血清（FCS）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和胰岛素），并添加 1% 青霉素/链霉素（pen/strep）（NHDF 培养基），加入细胞中。
  3. 将细胞转移至 15 mL 离心管中，在室温（RT）下以 300 × g 离心 5 分钟。
  4. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 12 mL 预热的 NHDF 培养基中。
  5. 将细胞转移至 T-75 培养瓶中，轻轻横向振荡混匀，随后将 T-75 培养瓶置于 37 °C、5% CO2 的湿化培养箱中培养。
  6. 每 2 天更换一次培养基，在显微镜下观察 NHDFs，直至细胞融合度达到 70%–80%。

2. 二维扩增

  1. 从培养箱中取出T-75培养瓶，弃去NHDF培养基。用预热的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
  2. 向细胞中加入3 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液。将细胞置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育，直至细胞从培养瓶表面脱落（约3分钟）。
  3. 加入6 mL预热的NHDF培养基以中和胰蛋白酶作用。将细胞转移至15 mL离心管中。
  4. 在室温下以300 x g 离心5分钟，弃去上清液。
  5. 用预热至37 °C的含10%胎牛血清（FBS）、1x MEM氨基酸和1%青霉素-链霉素的低糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）重悬细胞沉淀。
  6. 以8 x 103 NHDFs/cm2的密度（每10 cm培养皿总共接种4.4 x 105 NHDFs）将NHDF细胞接种至10 cm贴壁细胞培养皿中。轻轻呈十字形摇晃培养皿使细胞分布均匀。
  7. 将10 cm细胞培养皿置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养，每2天更换一次培养基。
  8. 在显微镜下观察细胞生长情况，直至细胞达到100%汇合度（约5天）。

3. 二维刺激

  1. 从培养箱中取出含有 NHDFs 的 10 cm 细胞培养皿（来自步骤 2.6 和 2.7），弃去培养基，并用预热的 PBS 洗涤细胞。
  2. 加入 10 mL 含 10% FBS、50 µg/mL 抗坏血酸和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 高糖培养基，培养基预先在 37 °C 下预热。
  3. 将培养皿置于 37 °C、5% CO2 的湿化环境中培养，每 2 天更换一次培养基。
  4. 在 14 天内定期在显微镜下观察 NHDFs 的生长情况。

4. 三维成熟

  1. 从培养箱中取出10 cm细胞培养皿，弃去DMEM高糖培养基。
  2. 用细胞刮棒轻柔且迅速地将形成的细胞片从培养皿上剥离。在剥离的同时，将细胞片卷成一个三维棒状类器官。
  3. 将NHDF类器官拾取并置于10 cm非细胞黏附性培养皿中。使用此类培养皿可防止类器官中的细胞向塑料表面迁移。
  4. 在此时间点或一天后（3D 成熟的第 0 天或第 1 天），收集部分类器官用于进一步分析，例如湿重测定、组织学评估（第 1 类器官更适合作为研究材料（因其结构更为紧凑），可用于RNA和蛋白质的分离。
  5. 用金属针按如下方式固定类器官的边缘：
    1. 用镊子小心夹住类器官的一侧，用另一把镊子轻轻施加约10%轴向伸长的手动拉伸。为估算10%的轴向伸长，可使用毫米纸或直尺。
    2. 接下来，用镊子夹取一根金属针，手动将其从类器官边缘垂直压入塑料培养皿中以固定。重复此操作，用第二根针固定类器官的另一边缘。
  6. 加入10 mL DMEM高糖培养基，其中添加10% FBS、1× MEM氨基酸、50 µg/mL抗坏血酸、10 ng/mL TGFß3和1%青霉素-链霉素，培养基预先在37 °C预热。
  7. 将10 cm培养皿置于37 °C、5% CO₂的培养箱中2 湿润的环境中培养，每2天更换一次培养基。
  8. 定期监测类器官，持续14天。
    注意：固定针可能会松动，因此需按照步骤 4.5 中所述的相同方法重新固定。
  9. 14天后，移除类器官中的高糖DMEM培养基，用预热的PBS洗涤类器官。
  10. 在第0天和第14天使用精密天平测量类器官的湿重。
    1. 将一个空的10 cm培养皿放在天平上，去皮归零，以确保仅测量类器官的重量。完全移除10 cm培养皿中的培养基，逐一测量类器官的湿重。
      注意：本研究中，在第0天每名供体称重3个类器官，第14天每名供体称重2个类器官。
  11. 根据研究目的，将部分NHDF类器官用于进一步的组织学分析，或立即使用无菌无DNA/RNA的试管在液氮中冷冻，以备后续进行DNA、RNA和蛋白质的提取，随后于-80 °C保存。
  12. 用于组织学检测时，将每个类器官置于5 mL预冷（4 °C）的4%多聚甲醛PBS溶液（调节至中性pH）中，冰上固定45分钟，随后在室温下用PBS洗涤（2次） 每次5分钟。
  13. 使用蔗糖梯度对固定后的类器官进行冷冻保护，将类器官置于用于组织学的玻璃瓶中。将类器官在4 °C下于含10%蔗糖的PBS溶液中孵育2小时，随后在20%蔗糖/PBS中4 °C孵育2小时，最后在30%蔗糖/PBS中4 °C过夜孵育。更换蔗糖溶液时，先用移液器吸出旧溶液，再加入新溶液。
  14. 将类器官包埋于冷冻介质中。
    1. 将铜板置于泡沫箱内的干冰上，冷却10分钟。
    2. 接下来，将预先装有冷冻介质的塑料冷冻模具放置在铜板上，用镊子轻轻将类器官压入冷冻模具底部。待冷冻介质完全冻结后即可。
    3. 对于较长的类器官，首先用手术刀将其切成两半，并将两半并排置于冷冻模具中。每个拟进行组织学分析的类器官均重复此操作。
  15. 将样品保存在 -20 °C，直至进行冷冻切片。
  16. 使用冷冻切片机将类器官纵向切成10 µm厚的切片，并进行组织学染色，如苏木精和伊红（H&E）采用标准方案8.

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结果

3D T/L 类器官模型此前已建立，本研究通过使用商业购买的人类正常皮肤成纤维细胞（NHDF，n=3，每位供体3个类器官，NHDF使用代次为5-8代）进行了验证。该模型的工作流程总结于图1中。图2展示了NHDF在T-75培养瓶中预扩增阶段（图2A），以及在10 cm细胞培养皿中进行2D扩增步骤初期和培养5天后的代表性相差显微图像（图2B）。图2C（代表性相差显微图像）展示了NHDF在10 cm细胞培养皿中培养14天后2D刺激阶段的融合状态。随后，细胞片被手动剥离并同时卷曲形成3D棒状类器官（第0天，类器官长度约为6 cm，宽度约为0.4 cm），并在10%静态张力条件下培养14天（图3，第0天和第14天，代表性宏观图像）。在3D成熟过程的第14天，类器官呈现出闪亮的白色外观，发生收缩...

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讨论

本研究的结果为建立和表征用于研究T/L组织的NHDF三维类器官模型提供了有价值的见解。该三步法方案可形成具有典型T/L微环境特征的棒状三维类器官。此模型先前已在Kroner-Weigl等. 20237中报道，并在本文中得到详细展示。

在图2中展示的相差显微图像显示了NHDF在扩增和刺激阶段中汇合度及细胞片形成的过程。通过将细胞片手动卷曲成类杆状的三维类器官，进行三维成熟过程，并在静态张力条件下培养14天。到第14天时，类器官呈现出闪亮的白色外观，并且密度增加，提示类器官内部发生了收缩和结构重组。这表明成熟期对于获得更有序且模拟肌腱/韧带（T/L）组织结构至关重要。

此外，重量分析显示类器官在第0天至第14天之间湿重显著下降，再次表明类器官在成熟过程中发生了明显的收缩和细胞外基质（ECM）重组。值得注意的是，由于操作过程以及类器官内部或培养皿中残留培养基的影响，不同实验之间的湿重测量值可能存在差异。此外，...

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披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

D.D. 和 S.M.-D. 感谢德国联邦教育与研究部（BMBF）资助项目"CellWiTaL：用于药物研究的可重复细胞系统——三维细胞结构中高特异性单细胞的无载体激光打印"，项目编号 13N15874。D.D. 和 V.R.A. 感谢欧盟 MSCA-COFUND 资助项目 OSTASKILLS "下一代骨关节炎研究人员的综合培训"，资助协议编号 GA Nr. 101034412。所有作者感谢 Beate Geyer 女士提供的技术协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗坏血酸  Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany  A8960
10 cm 贴壁细胞培养皿Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany CLS430167
10 cm 非贴壁培养皿 Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany CLS430591
冻存液Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands  4583
标准冷冻模具 Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands4557
D(+)-蔗糖 AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, GermanyA2211
DMEM 高糖培养基 Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany DMEM-HA
DMEM 低糖培养基Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany  DMEM-LPXA
胎牛血清Anprotec, Bruckberg, Germany AC-SM-0027
成纤维细胞生长培养基 2 PromoCell, Heidelberg, Germany  C-23020
H&E 染色试剂盒Abcamab245880
配备高分辨率相机的倒置显微镜ZeissNAZeiss Axio Observer 配置  Axiocam 506
MEM 氨基酸 Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany  NEAA-B
金属针 EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic 04.31
正常人真皮成纤维细胞 PromoCell, Heidelberg, Germany C-12302
多聚甲醛AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany A3813
青霉素/链霉素 Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany15140122
磷酸盐缓冲液 Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany P4417
TGFß3 R&D Systems, Wiesbaden, Germany  8420-B3
0.05% 胰蛋白酶-EDTA DPBS Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany  TRY-1B

参考文献

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