使用人真皮成纤维细胞自组装细胞片培养和手动生成 3D 肌腱/韧带样类器官的演示

Summary

在此，我们展示了一种三步类器官模型（二维[2D]扩展、二维刺激、三维[3D]成熟），为肌腱基础研究提供了一种有前途的工具，并为肌腱组织工程提供了一种潜在的无支架方法。

Abstract

肌腱和韧带 （T/L） 是连接肌肉骨骼系统的坚固、层次分明的结构。这些组织具有严格排列的富含 I 型胶原的细胞外基质 （ECM） 和 T/L 谱系细胞，主要分布在平行行中。损伤后，T/L需要很长时间进行康复，故障风险高，修复结果往往不尽如人意。尽管 T/L 生物学研究最近取得了进展，但仍然存在的挑战之一是 T/L 领域仍然缺乏能够概括体 外 T/L 形成过程的标准化分化方案。例如，间充质前体细胞的骨和脂肪分化只需要标准的二维 （2D） 细胞培养和添加特定的刺激培养基。为了分化到软骨，需要三维 （3D） 颗粒培养和补充 TGFß。然而，细胞分化为肌腱需要一个非常有序的 3D 培养模型，理想情况下，该模型也应该能够受到动态机械刺激。我们已经建立了一个 3 步（扩增、刺激和成熟）类器官模型，以从自组装细胞片中形成 3D 棒状结构，该细胞片提供具有自身 ECM、自分泌和旁分泌因子的自然微环境。这些棒状类器官在丰富的 ECM 中具有多层细胞结构，并且可以很容易地处理暴露于静态机械应变。在这里，我们通过使用市售的真皮成纤维细胞演示了 3 步方案。我们可以证明，这种细胞类型形成了健壮且富含ECM的类器官。所描述的程序可以在培养基方面进一步优化，并针对动态轴向机械刺激进行优化。同样，可以测试替代细胞来源形成 T/L 类器官的潜力，从而进行 T/L 分化。综上所述，建立的3D T/L类器官方法可作为肌腱基础研究的模型，甚至可以作为无支架T/L工程的模型。

Introduction

肌腱和韧带 （T/L） 是肌肉骨骼系统的重要组成部分，为身体提供必要的支撑和稳定性。尽管这些结缔组织起着关键作用，但它们容易退化和受伤，导致疼痛和行动障碍¹。此外，他们的血液供应有限和愈合能力缓慢会导致慢性损伤，而衰老、重复运动和康复不当等因素则进一步增加了退化和受伤的风险².常规治疗，如休息、物理治疗和手术干预，无法完全恢复 T/L 结构和功能。在过去的几年中，研究人员一直在努力更好地了解 T/L 的复杂性，以便寻求 T/L 疾病的有效治疗方法 ^3,4,5。T/L 的特点是层次结构合理、以细胞外基质 （ECM） 为主的结构，主要由 I 型胶原纤维和蛋白聚糖组成，这一特征在体外难以复制 ⁶。传统的二维（2D）细胞培养模型无法捕捉T/L组织的特征性三维（3D）组织，限制了其转化潜力，并阻碍了T/L再生领域的创新进展。

最近，3D类器官模型的发展为推进各种^{组织类型的基础}研究和无支架组织工程提供了新的可能性7,8,9,10,11,12,13。例如，为了研究肌腱连接处，Larkin等人，2006年开发了3D骨骼肌结构以及源自大鼠尾部肌腱¹⁰的自组织肌腱段。此外，Schiele 等人，2013 年，通过使用微机械纤连蛋白包被的生长通道，指导人真皮成纤维细胞的自组装形成细胞纤维，而无需 3D 支架的帮助，这种方法可以捕捉胚胎肌腱发育的关键特征¹¹。在 Florida 等人 2016 年的研究中，骨髓基质细胞首先被扩解为骨骼和韧带谱系，然后用于生成自组装的单层细胞片，然后实施这些细胞片以创建模仿天然前交叉韧带的多相骨-韧带-骨结构，该模型旨在提高对韧带再生的理解¹².为了阐明肌腱机械转导过程，Mubyana 等人，2018 年使用了一种无支架方法，通过该方法，创建单肌腱纤维并经受机械加载协议¹³。类器官是自组织的 3D 结构，模仿组织的天然结构、微环境和功能。3D 类器官培养为研究组织和器官生物学以及病理生理学提供了更具生理相关性的模型。此类模型还可用于诱导不同干细胞/祖细胞类型的组织特异性分化^14,15。因此，在 T/L 生物学和组织工程领域实施 3D 类器官模型成为一种非常有吸引力的方法 ^9,16。可以为类器官组装实施替代细胞来源，并刺激其实现硬原分化。本研究中用于演示的一种相关细胞类型是真皮成纤维细胞 ^7,17,18。这些细胞很容易通过皮肤活检程序获得，与骨髓穿刺或吸脂术相比，皮肤活检程序的侵入性较小，并且由于其良好的增殖能力，可以相当快地繁殖到大量细胞。相比之下，更特化的细胞类型，如T/L驻留成纤维细胞，在分离和扩增方面更具挑战性。因此，真皮成纤维细胞也被用作细胞重编程技术的起点，以达到诱导多能胚胎干细胞¹⁹。将真皮成纤维细胞置于特定的 3D 培养条件和信号信号线索下，例如转化生长因子-β 3 （TGFß3），据报道，TGFß3 是各种细胞过程的关键调节因子，包括 T/L 的形成和维持，可以增强其体外致肌腱分化，导致肌腱特异性基因的表达和 T/L 典型 ECM²⁰ 的沉积^，21.

在这里，我们描述并演示了先前建立和实施的 3 步（2D 扩增、2D 刺激和 3D 成熟）类器官方案，使用市售的正常成人真皮成纤维细胞 （NHDF） 作为细胞源，为研究 体外 肌张力生成提供了有价值的模型⁷。尽管该模型并不等同于 体内 T/L组织，但它仍然提供了一个生理学上更相关的系统，可用于研究细胞分化机制，在 体外模拟T/L病理生理学，以及建立T/L个性化医疗和药物筛选平台。此外，在未来，研究可以通过进一步优化来评估 3D 类器官是否适合于无支架 T/L 工程，以及可用于开发与天然 T/L 组织的尺寸、结构和生物物理特性非常相似的放大机械鲁棒结构。

Protocol

注意:所有步骤都必须使用无菌技术进行。

1. NHDF的培养和预扩增

1. 在37°C下快速解冻含有成体冷冻保存的正常人真皮成纤维细胞（NHDF，1 x 10⁶ 个细胞）的冻存瓶，直到它们几乎解冻。
2. 缓慢加入1mL预热的成纤维细胞生长培养基2（即用型试剂盒，包括基础培养基，2%胎牛血清（FCS），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和胰岛素），补充有1%青霉素/链霉素（pen/strep）（NHDF培养基），在37°C下预热到细胞中。
3. 将细胞转移到 15 mL 离心管中。在室温（RT）下以300× g 离心细胞5分钟。
4. 取出上清液。将细胞沉淀重悬于 12 mL 预热的 NHDF 培养基中。
5. 将细胞转移到 T-75 烧瓶中，并以交叉方式短暂摇动。将T-75烧瓶在37°C下置于5%CO₂ 加湿培养箱中。
6. 每 2 天更换一次培养基。在显微镜下观察NHDF，直到它们达到70%-80%汇合度。

2. 2D扩展

1. 取出培养箱的 T-75 烧瓶并取出 NHDF 培养基。用预热的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞。
2. 向细胞中加入 3 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA。将细胞在37°C下在5%CO₂ 湿化培养箱中孵育，直到细胞从烧瓶中分离（约3分钟）。
3. 加入 6 mL 预热的 NHDF 培养基以中和胰蛋白酶作用。将细胞转移到 15 mL 离心管中。
4. 在室温下以300× g 离心细胞5分钟，并除去上清液。
5. 将细胞沉淀重悬于补充有10%胎牛血清（FBS），1x MEM氨基酸，1%笔/链球菌的Dulbecco改良Eagles培养基（DMEM）低葡萄糖中，在37°C预热。
6. 将NHDFs铺在10cm贴壁细胞培养皿中，密度为8×10^3NHDF /^{cm 2} （总共，每10cm培养皿4.4×10^5NHDF ）。以交叉方式轻轻摇晃。
7. 将10cm细胞培养皿置于37°C的5%CO₂ 加湿培养箱中。每 2 天更换一次培养基
8. 在显微镜下监测细胞，直至达到100%汇合度（约5天）。

3. 2D刺激

1. 从培养箱中取出含有NHDF（来自步骤2.6和2.7）的10cm细胞培养皿。取出培养基，用预热的PBS洗涤细胞。
2. 加入补充有10%FBS，50μg/ mL抗坏血酸和1%pen / strep的DMEM高葡萄糖培养基，在37°C下预热。
3. 将培养皿置于37°C的5%CO₂ 加湿气氛中。每 2 天更换一次培养基。
4. 在显微镜下监测NHDFs14天。

4. 3D成熟

1. 从培养箱中取出 10 cm 细胞培养皿，取出 DMEM 高葡萄糖培养基。
2. 用细胞刮刀轻轻快速地将形成的细胞片从培养皿中分离出来。在分离时，同时将细胞片卷成 3D 棒状类器官。
3. 拾取NHDF类器官并将其置于10cm非粘附（用于细胞）培养皿中。这种培养皿类型用于避免细胞从类器官迁移到塑料。
4. 在此时间点或之后的一天（3D 成熟的第 0 天或第 1 天），收集一些类器官进行进一步分析，例如湿重、组织学评估（第 1 天类器官更可取，因为它们变得更加紧凑）、RNA 和蛋白质分离。
5. 用金属销固定类器官的边缘，如下所示:
   1. 用镊子小心地握住类器官的一侧，然后用另一个镊子轻轻地手动拉伸大约 10% 的轴向伸长率。要估计 10% 的轴向伸长率，请使用毫米纸或尺子。
   2. 接下来，用镊子拿起一根金属针，然后手动将类器官边缘向下压入塑料盘以固定它。重复此过程，将第二个引脚钉在类器官的第二个边缘上。
6. 加入10mL补充有10%FBS，1x MEM氨基酸，50μg/ mL抗坏血酸，10ng / mL TGFß3和1%pen / strep的DMEM高葡萄糖培养基，在37°C下预热。
7. 将10厘米的培养皿置于37°C的5%CO₂ 加湿气氛中。每 2 天更换一次培养基。
8. 定期监测类器官 14 天。
   注意: 销钉可能会松动，因此请使用步骤 4.5 中所述的相同技术重新修复。
9. 14 天后，从类器官中取出 DMEM 高葡萄糖培养基。用预热的PBS洗涤类器官。
10. 使用精密秤在第 0 天和第 14 天测量类器官的湿重。
    1. 将一个 10 厘米的空培养皿放在秤上，将重量去皮至零，以确保仅测量类器官的重量。从10cm培养皿中完全取出培养基，并逐个测量类器官湿重。
       注:在这项研究中，在第 0 天，每个供体称重三个类器官，在第 14 天，称量每个供体两个类器官。
11. 根据研究目的，在进一步的组织学分析中实施一些 NHDF 类器官，或立即使用无菌 DNA/RNA 管将它们冷冻在液氮中，用于后续的 DNA、RNA 和蛋白质分离，然后将它们储存在 -80 °C 下。
12. 对于组织学研究，将每个类器官固定在5mL预冷（4°C）4%多聚甲醛的PBS（调节至中性pH）冰上45分钟，然后在室温下洗涤PBS（每次2×5分钟）。
13. 通过将类器官放入玻璃罐中进行组织学检查，使用蔗糖梯度对固定的类器官进行冷冻保护。将类器官在4°C的PBS溶液中的10%蔗糖中孵育2小时，然后在4°C下孵育20%蔗糖/ PBS2小时，最后在4°C下将30%蔗糖/ PBS孵育过夜。 通过首先移出，然后用新溶液填充来改变蔗糖溶液。
14. 将类器官嵌入冷冻培养基中。
    1. 将铜板放在聚苯乙烯泡沫塑料盒中的干冰上，冷却10分钟。
    2. 接下来，将预装冷冻培养基的塑料冷冻模具放在铜板上，然后使用镊子将类器官轻轻按压到冷冻模具的底部。等到冷冻介质完全冷冻。
    3. 对于长类器官，首先用手术刀切成两半，然后将两半彼此平行放入冷冻模具中。对打算进行组织学分析的每种类器官重复该过程。
15. 将样品储存在-20°C直至冷冻切片。
16. 使用冷冻组，将类器官纵向切割成 10 μm 厚的切片，并使用标准方案⁸ 进行组织学染色，例如苏木精和伊红 （H&E）。

Results

3D T/L 类器官模型之前是通过实施商业购买的 NHDF 建立并演示的（n=3，每个供体 3 个类器官，在第 5-8 次传代使用 NHDF）。 图 1 总结了模型工作流。 图2 显示了在T-75烧瓶中预扩增期间NHDF培养物的代表性相差图像（图2A），以及在10cm细胞培养皿中的2D扩增步骤中培养5天开始和5天后（图2B）。 图 2C （代表性相差图像）显示了在 10 cm 细胞培养皿中培养 14 天后，NHDF 在 2D 刺激过程中的汇合。随后，将细胞片手动分离并同时卷成 3D 棒状类器官（在第 0 天，类器官长度约为 6 cm，宽度约为 0.4 cm），在 10% 静态张力下培养 14 天（图 3，第 0 天和第 14 天，代表性宏观图像）。到 3D 成熟过程的第 14 天，类器官呈现出闪闪发光的白色外观、收缩并且看起来比最初的类器官更致密。在形成时（第 0 天）测量类器官的湿重，并在 3D 成熟步骤的第 14 天再次测量（图 4）。观察到湿重显着降低，表明在该协议步骤的时间跨度内类器官内发生收缩和 ECM 结构重组。除了体重变化外，由于收缩，类器官长度也减少了（在第14天，类器官长度约为3.5厘米，宽度约为0.3厘米）。在这个过程中，金属销松动了，必须重新固定;因此，在 3D 成熟的 14 天内，我们建议经常监测类器官。为了评估类器官的形态，从3D成熟步骤的第1天和第14天收集的NHDF类器官中获得纵向切片，并进行H&E染色（图5）。在第 1 天，类器官显示出不相连的层，主要由被少量 ECM 包围的细胞组成。此外，类器官层内的细胞没有沿用作施加静态拉伸载荷方向的纵向类器官轴对齐。NHDF细胞核呈圆形，大小和形状各不相同。第 14 天类器官的 H&E 分析显示，曙红信号明显增加，表明 ECM 在 3D 成熟过程中沉积。在这个时间点，类器官表现出融合层，其中区域包含对齐的细胞。细胞经常成组;然而，它们在某些地方也被组织成单元格行。大多数细胞核具有相似的大小，偶尔被拉长。

图 1:3D T/L 类器官模型的卡通，由 3 个步骤组成:2D 扩增、2D 刺激和 3D 成熟。 最初，NHDF 在 T-75 烧瓶中预扩增，直到它们达到 70%-80% 汇合。随后，使用 Dulbecco 改良的 Eagles 培养基 （DMEM） 低葡萄糖培养基在 10 cm 细胞培养皿中培养 NHDF 5 天（2D 扩增）。然后用补充有抗坏血酸的 DMEM 高葡萄糖培养基刺激细胞，培养 14 天（2D 刺激）。随后，将 NHDF 从 10 cm 贴壁培养皿中分离，卷成 3D 棒状类器官，转移并固定在 10 cm 非贴壁细胞培养皿中，该培养皿装有补充有抗坏血酸和转化生长因子 β 3 （TGFß3） 的 DMEM 高葡萄糖培养基 14 天（3D 成熟）。形成的 3D 类器官可以在不同的时间点（例如第 0、1 和 14 天）进行湿重评估、组织学评估、RNA 和蛋白质分离以及其他分析（例如，透射电子显微镜、生物力学测量）。动画片是在BioRender软件中生成的。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 2:NHDF 在预扩增、2D 扩增和 2D 刺激步骤中的代表性相差图像。 （A） 在 T-75 烧瓶中预扩增期间的 NHDF。（B） 在 10 cm 细胞培养皿中 2D 扩增步骤的第 1 天和第 5 天的 NHDF。（C） 在 10 cm 细胞培养皿中 2D 刺激步骤的第 1 天和第 14 天的 NHDF。比例尺:200μm。图像是用配备高分辨率相机的倒置显微镜拍摄的。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 3:NHDF 3D 类器官的大体形态。 NHDF 类器官在 3D 成熟步骤第 0 天和第 14 天的代表性宏观图像。比例尺:1厘米。图像是用手机摄像头拍摄的。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 4:NHDF 3D 类器官的湿重分析。 类器官的湿重测量在第 0 天和第 14 天，即 3D 成熟过程的结束。该图显示了平均值和标准偏差（NHDF n = 3，第 0 天有 3 个类器官/供体，第 14 天有 2 个类器官/供体，因为第 1 天有 1 个类器官/供体进行组织学检查），每个点代表单个类器官，而每个彩色形状代表不同的个体供体。数据以平均值±标准差表示，并使用不成对的参数 t 检验。统计差异:**p ≤0.01。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 5:NHDF 3D 类器官的组织学分析。 在第 1 天和第 14 天的 3D 成熟过程中，NHDF 类器官的苏木精和伊红 （H&E） 染色切片的代表性图像。右图 - 低放大倍率图像，左图 - 放大视图，指示器如下:黄色箭头 - 断开连接的层;黄色箭头 - 具有不同大小和形状的原子核;黑色箭头 - 融合层和 ECM 沉积;黑色箭头 - 细胞行，具有相似大小和伸长率的细胞核;黑色星星 - 成群结队的细胞。比例尺: 100 μm. 请点击这里查看此图的较大版本.

Discussion

本研究结果为NHDF 3D类器官模型的建立和表征提供了宝贵的见解，用于研究T/L组织。3 步方案导致 3D 杆状类器官的形成，这些类器官表现出 T/L 生态位的典型特征。该模型之前在 Kroner-Weigl 等人 2023⁷ 中报道，并在此处进行了非常详细的演示。

图 2 中显示的相差图像显示了在扩增和刺激步骤期间 NHDF 汇合和片状形成的进展。3D成熟过程是通过手动将细胞片卷成3D棒状类器官来进行的，然后在静态张力下培养14天。到第14天，类器官显示出闪闪发光的白色外观和密度增加，表明类器官内部存在收缩和结构重组。这表明成熟期对于实现更有组织和 T/L 组织模拟结构至关重要。

此外，重量分析显示，在第 0 天和第 14 天之间，类器官的湿重显着降低，再次表明在成熟过程中类器官内部存在显着收缩和 ECM 重组。重要的是，由于处理和类器官或培养皿中的残留培养基，实验之间的湿重测量值可能会有所不同。此外，类器官在开始时可能含有更多的培养基，因为如下所述，在第 0 天，由细胞片滚动形成的层被分离并且没有融合。随着时间的流逝，这些层连接在一起并变得更加紧凑，因此，介质可能会被挤出。

通过H&E染色进行形态学评估为类器官结构特征提供了额外的见解。在第 1 天，类器官表现出不相连的层，主要由具有圆形细胞核的细胞组成，周围环绕着薄的细胞周 ECM。缺乏平行于拉伸载荷轴线的细胞对齐表明，需要进一步成熟以实现类器官的更有组织的细胞和 ECM 结构。尽管在第 1 天和第 14 天之间出现收缩和类器官重量和尺寸减小，但 H&E 染色显示曙红阳性区域增加，表明 ECM 沉积增强。此外，不再有可见的层，偶尔，细胞具有细长的细胞核并放置在平行的细胞行中。这表明类器官内的细胞通过改变自身的排列以及 ECM 沉积、结构和对齐来进行自组织，从而模仿天然 T/L 组织形成的行为。

总体而言，这些发现强调了 NHDF 类器官模型作为研究 T/L 生物学、 体外 肌腱生成，甚至进一步发展无支架 T/L 工程的宝贵工具的潜力。然而，成功处理 3D 类器官模型有三个关键步骤:1） 在方案的 2D 刺激阶段形成紧密的细胞片。当使用原代细胞时，这主要取决于供体细胞的特性;因此，同时评估多个捐献者非常重要;2）电池片的手工卷制。这需要快速滚动，但同时要轻轻地使用细胞刮刀对细胞片进行滚动。因此，建议规划初始类器官以首先训练此过程;3）针脚稳定固定在类器官边缘。这种固定确保了类器官的轴向伸长，并防止畸形以及坍缩成块状结构。此外，在 3D 成熟阶段，由于类器官经历了 ECM 的重塑，因此引脚可能会突然脱落，因此，经常监测每个类器官并重新固定引脚非常重要。

目前的模型尚未达到 体内模拟T /L组织的水平，并且存在许多局限性。例如， 每个 类器官需要大量细胞以及 35 天才能完成该过程，而大多数分化方案（例如 3D 软骨生成颗粒模型）设置为 21 天²²。方案程序中的洗涤步骤应优选使用生理平衡的洗涤缓冲液进行，例如，Hanks平衡盐溶液（HBSS）或Earles平衡盐溶液（EBSS），而不是PBS，PBS可能对 体外培养的原代人类细胞产生代谢后果。关于类器官中 2D 刺激和 3D 成熟阶段使用的培养基，已选择 DMEM 加 10% FBS 制剂，因为这是广泛接受的分化方案的基础，并且旨在标准化和比较不同细胞类型之间的类器官生成特性²³.在不同实验室环境中，3步类器官方案的复制可能受到所用细胞类型、细胞质量和传代以及供体依赖性细胞特性的影响。设备的变化，特别是在 2D 刺激阶段使用的 10 cm 细胞培养皿²⁴ 的质量上，可能会影响细胞片形成的稳健性。此外，由于 ECM 在 3D 成熟过程中收缩， 通过 引脚的类器官轴向固定可能会松动;因此，如上所述，建议经常进行监测。在直径和强度方面测试和选择不同的销钉也可以降低销钉脱落的风险²⁵.然而，使用销钉进行手动拉伸并不坚固，并且容易出现处理可变性;因此，在后续研究中开发一种用于固定类器官边缘的夹紧机构非常重要，这不仅可以导致该步骤的标准化，而且还可以允许类器官的动态拉伸。一般来说，研究两种类器官模型修饰方法会很有意义，一种是缩小尺度 - 减少 每个 类器官的细胞数量和程序时间，从而使其更加用户友好，特别是对于 体外 研究;第二次放大 - 增加类器官的尺寸，以便在大型动物模型中测试它们的行为，作为潜在的肌腱替代策略。

这里展示的模型可以提供一个平台，用于研究肌腱发育、病理生理学以及如果类器官与不同细胞类型结合并发生微破裂，可能还会进行修复和再生的机制。值得一提的是，Kroner-Weigl 等人 2023⁷ 年的研究确定了 NHDF 细胞类型的几个局限性，即 NHDF 形成的类器官比来自 T/L 细胞的类器官更大、细胞更多，因此控制细胞增殖和行为具有挑战性。关于细胞凋亡，基于末端脱氧核苷酸转移酶 dUTP 缺口末端标记 （TUNEL） 的测定在第 14⁷ 天未显示整个类器官存在死细胞的证据，这表明在 3D 成熟步骤中营养物质、废物和氧气适当扩散。有趣的是，尽管存在形态学差异，但通过定量 PCR 对许多 T/L 相关基因（包括不同的胶原类型、硬化 （SCX）、莫霍克 （MKX） 等）进行初步筛选表明，NHDF 和 T/L 类器官之间的基因表达相当⁷，这一发现应该进一步研究，也应该在蛋白质水平上得到验证。因此，对于这种细胞类型，需要进一步优化以支持 T/L 分化，并且可以基于调整 2D 刺激和 3D 成熟步骤中使用的培养基（例如，血清浓度、生长因子、维生素）、延长成熟时间甚至使类器官进行动态机械拉伸。改进该方案可以进一步改善类器官的组成、结构和功能特性，从而使模型能够更好地模拟复杂的 体内 T/L 组织生态位。此外，可以研究替代细胞来源形成 T/L 类器官的能力以及它们是否可以进行 T/L 分化。Yan et al. 2020⁹， 采用 3D 类器官模型，使用年轻/健康和老年/退化的肌腱干/祖细胞 （Y-TSPCs） 来研究 3D 细胞行为以及肌腱形成能力是否随着 T/L 老化而变化。他们报告说，A-TSPC 3D类器官表现出较差的组织形态，其中的细胞增殖率较低，但凋亡率较高，同时与衰老相关标志物水平升高有关^9。因此，T/L 3D类器官模型是研究肌腱老化参与的分子和细胞机制的一个有前途的平台，并可用于测试肌腱修复和再生的新型药物疗法。Chu 等人 2021 年在 3D 类器官模型中实施了牙泡细胞 （DFC），以评估它们的韧带生成分化。这种细胞类型形成了组织非常好的类器官，因此表明 DFC 是在牙周韧带 （PDL） 组织中分化的有吸引力的细胞来源，这反过来可以开发一种有前途的牙周炎治疗策略⁸。

未来，通过包含不同的细胞类型（例如，肌成纤维细胞、巨噬细胞），该模型可能会变得更加复杂，这可能为类器官内的细胞特异性行为和细胞串扰提供新的见解，并有助于更全面地理解 T/L 生物学、生理学和病理生理学 8,9,16,26。

3D类器官模型在组织工程和再生医学应用中具有多项优势。它们密切模仿人体组织的细胞组成和组织以及细胞间和细胞间基质的相互作用，从而为研究疾病机制和药物反应提供了生理学相关的平台²⁷。类器官可以用作高通量筛选平台，以评估不同药物的有效性和潜在的副作用，并提供可靠且低成本的动物试验替代方案。此外，它们能够直接比较健康和患病状况，从而发现与各种病理相关的关键分子和细胞变化，识别用于早期疾病检测的生物标志物，以及促进对疾病机制的深入理解，以及靶向疗法的开发^28,29。

综上所述，我们非常详细地展示了先前建立的 3D T/L 类器官模型的步骤，该模型为研究 T/L 组织生物学和各种细胞类型的 体外 快速生成过程提供了一个有前途的平台。强烈鼓励该模型的进一步实施、优化和研究，因为它们可能会导致推进无支架 T/L 工程策略，这反过来有助于改进 T/L 疗法。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
抗坏血酸	Sigma-Aldrich， 陶夫基兴，德国	A8960
10 cm 贴壁细胞培养皿	Sigma-Aldrich， Taufkirchen，德国
10 cm 非粘附培养皿	Sigma-Aldrich， 陶夫基兴，德国
Cryo-medium	Tissue-Tek， Sakura Finetek， Alphen aan den Rijn， Netherlands	4583
Cryomold 标准	Tissue-Tek， Sakura Finetek， Alphen aan den Rijn， 荷兰	4557
D（+）-蔗糖	AppliChem Avantor VWR International GmbH， 德国达姆施塔特	A2211
DMEM 高葡萄糖培养基	Capricorn Scientific，德国 Ebsdorfergrund	DMEM-HA
DMEM低葡萄糖	Capricorn Scientific，德国Ebsdorfergrund	DMEM-LPXA
胎牛血清	Anprotec，德国布鲁克贝格	AC-SM-0027
成纤维细胞生长培养基 2	PromoCell， 德国海德堡	C-23020
H& 型E 染色套件	Abcam	ab245880
带高分辨率相机的倒置显微镜	Zeiss	NA	Zeiss Axio Observer 带 Axiocam 506
MEM 氨基酸	Capricorn Scientific，德国 Ebsdorfergrund	NEAA-B
金属销	EntoSphinx， Pardubice， 捷克共和国	04.31
正常人真皮成纤维细胞	PromoCell， 德国海德堡	C-12302
多聚甲醛	应用，Sigma-Aldrich，陶夫基兴，德国	A3813
青霉素/链霉素	Gibco，Thermo Fisher Scientific，德国达姆施塔特	15140122
磷酸盐缓冲盐水	Sigma-Aldrich， 陶夫基兴， 德国	P4417
TGFß3	研发&D Systems，德国威斯巴登	8420-B3
胰蛋白酶-EDTA 0.05% DPBS	Capricorn Scientific，德国 Ebsdorfergrund	TRY-1B