该方案描述了一种评估三唑类农药代谢物在植物中整体细胞毒性的新方法。
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本文内容
摘要
摘要
由于人类活动，多种有机污染物被释放到环境中。这些污染物可被农作物吸收，通过食物链对生态系统和人类健康造成潜在威胁。污染物在植物体内的生物转化会产生一系列代谢产物，其毒性可能高于母体化合物，这意味着在进行毒性评估时应考虑这些代谢产物。然而，植物中污染物的代谢产物极为复杂，难以全面获取所有代谢产物的毒理学信息。本研究提出一种策略，在毒理学测试中将污染物代谢产物作为一个整体进行处理，以评估其综合细胞毒性。三唑类农药是一类广谱杀菌剂，已广泛应用于农业生产中，其在农田中的残留污染问题日益受到关注。因此，本研究选取氟硅唑、烯唑醇、戊唑醇和丙环唑四种三唑类农药作为受试污染物。通过用上述三唑类农药处理胡萝卜愈伤组织，生成相应的代谢产物。处理72小时后，提取胡萝卜愈伤组织中的农药代谢产物，并利用Caco-2细胞系进行毒理学测试。结果显示，受试农药在胡萝卜愈伤组织中的代谢产物对Caco-2细胞活力无显著抑制作用（P>0.05），表明这些农药代谢产物无明显细胞毒性。该方法为评估植物中污染物代谢产物的细胞毒性提供了新途径，有望为精准毒性评估提供有价值的科学数据。
引言
农田中生长的农作物可能暴露于源自人类活动的各种有机污染物中1,2。这些污染物可被植物吸收，并通过食物链进一步对生态系统和人类健康造成威胁3,4。植物体内的外源性物质可能经历一系列生物转化过程，例如I相和II相代谢5，从而生成多种代谢产物。根据植物中的“绿色肝脏”概念，植物代谢能够降低外源性物质的毒性6,7。然而，已有研究表明，某些代谢产物的毒性可能高于其母体化合物。例如，四溴双酚A（TBBPA）的脱溴产物和双酚A（BPA）的O-甲基化产物已被证实比其母体化合物更具毒性8,9，而脱溴和O-甲基化正是植物中主要的I相代谢途径。因此，仅基于植物中外源污染物母体的毒性评估并不准确，还应考虑其相应的代谢产物。
植物中外源性物质的代谢产物极为复杂10,11，难以....
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方案
1. 胡萝卜愈伤组织的分化
注意：胡萝卜愈伤组织分化的详细实验方案已在先前的研究中描述过12。以下是简要说明。
- 将春化处理的种子用75%乙醇表面灭菌20分钟，随后用20% H2O2处理20分钟，再用蒸馏水至少洗涤3次。
- 将种子播种于不含激素的琼脂固化（1% w/v）Murashige和Skoog（MS）培养基（pH = 5.8，121 °C高压灭菌）上，在26 °C、16小时光照周期（光强350 µmol/m2s）条件下培养15天，以获得幼苗。
- 将幼苗的下胚轴和子叶切割成约0.5 cm的小段作为外植体，置于含有1 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸（生长素类似物）和0.5 mg/L 6-苄氨基嘌呤（细胞分裂素）的MS培养基中，在26 °C避光条件下培养3至4周，以诱导愈伤组织形成。
- 用解剖刀和镊子收集直径约1 cm、质地致密的愈伤组织。
2. 农药处理胡萝卜愈伤组织
- 在无菌MS培养基中分别溶解10 mg的氟硅唑、啶菌恶唑、戊唑醇和丙环唑，定容至100 mL，终浓度为100 mg/L（pH值为5.6–7.0）。
注....
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结果
图1 表示在胡萝卜愈伤组织中生成、提取及评估农药代谢物的示意图。在 图2 中，展示了受试农药的吸收与代谢动力学曲线，从中可以看出，培养基中农药浓度呈指数下降，而胡萝卜愈伤组织中的浓度则开始上升，在4或8小时达到峰值，随后逐渐下降。这些结果表明，农药可被胡萝卜愈伤组织快速吸收并转化。愈伤组织培养体系中农药的时间回收率如 图3 所示。经过72小时的培养后，仅剩余8.3%-11.0%的农药，表明大部分农药已被转化为代谢物。
根据受试农药的吸收与代谢动力学（图2），在72 h孵育后，提取液中残留的农药母体浓度低于10 mg/L。图4显示了Caco-2细胞在暴露于受试农药后的剂量-反应曲线。因此，提取液中的农药母体不会影响细胞活力。
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讨论
本方案旨在通过结合植物愈伤组织和人类细胞模型，评估三唑类农药代谢物对植物的整体细胞毒性。该方案的关键步骤是植物愈伤组织和Caco-2细胞的培养。关于植物愈伤组织培养中最困难的部分及相关建议，我们已在先前的研究中提供12。此处需特别指出，Caco-2细胞培养中最困难的部分是细胞维持，因为细胞容易受到污染。因此，必须确保细胞实验中使用的所有试剂和材料均经过高压灭菌和紫外照射灭菌，且所有操作均应在超净工作台内进行。
在植物中评估污染物的风险时若忽略其相应的代谢产物，可能导致风险被低估。然而，植物中污染物的代谢产物极为复杂，因此难以全面获取其毒理学信息。鉴于这些代谢产物在植物中共同存在，并且在食物链传递过程中会共同暴露于动物或人类，本研究将所有代谢产物视为一个整体。通过结合植物愈伤组织与人类细胞模型，实现了对植物中污染物代谢产物整体细胞毒性的评估，避免了鉴定和分离植物代谢产物的复杂步骤。然而，该方法仍存在一些局限性。目前仅开展了细胞活力检测，未来还需进一步探索氧化应激、炎症效应和内分泌干扰效应等其他毒理学测试。此外，本方法仅测试了胡萝卜愈伤组.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究受到国家自然科学基金（21976160）和浙江省公益技术应用研究项目（LGF21B070006）的资助。
....
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2,4-二氯苯氧乙酸 | WAKO | 1 mg/L | |
| 20% H2O2 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10011218-500ML | |
| 6-苄氨基嘌呤 | WAKO | 0.5 mg/L | |
| 75% 乙醇 | 国药集团化学试剂有限公司 | 1269101-500 mL | |
| 96孔板 | Thermo Fisher | ||
| 乙腈 | Sigma-Aldrich | ||
| 人工气候培养箱 | 宁波东南实验室设备有限公司 | RDN-1000A-4 | |
| 高压灭菌器 | STIK | MJ-Series | |
| Caco-2 细胞 | 诺阳生物科技有限公司 | ||
| CCK8 试剂 | 南京建成生物工程研究所，中国 | G021-1-3 | |
| 离心机 | Thermo Fisher | ||
| CO2 培养箱 | Labtrip | HWJ-3-160 | |
| 二甲基亚砜 | Solarbio 生命科学 | D8371 | |
| 烯唑醇，98.7% | J&K Scientific | 83657-24-3 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Solarbio 生命科学 | 11965-500 mL | |
| 电子天平 | 上海精密仪器有限公司 | FA1004B | |
| 胎牛血清 | Cellmax | ||
| 荧光分光光度计 | Tecan | Infinite M200 | |
| 氟硅唑，98.5% | J&K Scientific | 85509-19-9 | |
| 冷冻干燥机 | SCIENTZ | ||
| 高通量组织研磨仪 | SCIENTZ | ||
| 倒置显微镜 | Leica Biosystems | DMi1 | |
| Milli-Q 超纯水系统 | Millipore | MS1922801-4L | |
| MS 培养基（Murashige & Skoog 培养基） | HOPEBIO | HB8469-7 | |
| 氮吹浓缩仪 | 奥盛 | MD200-2 | |
| PBS | Solarbio 生命科学 | P1022-500 mL | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Solarbio 生命科学 | P1400-100 mL | |
| 丙环唑，100% | J&K Scientific | 60207-90-1 | |
| Research plus 移液器 | Eppendorf | 10-1000 μL | |
| 小手指胡萝卜种子（Daucus carota var. sativus） | 寿光种业有限公司 | ||
| 摇床培养箱 | 上海博迅医疗设备有限公司 | THZ-98AB | |
| 戊唑醇，100% | J&K Scientific | 107534-96-3 | |
| 胰蛋白酶-EDTA 溶液 | Solarbio 生命科学 | T1300-100 mL | |
| 超声波清洗机 | ZKI | UC-6 | |
| 紫外灭菌超净工作台 | AIRTECH | ||
| 涡旋振荡器 | 无锡莱普仪器设备有限公司 | BV-1010 |
参考文献
- Fan, Y., et al. Uptake of halogenated organic compounds (HOCs) into peanut and corn during the whole life cycle grown in an agricultural field. Environ Pollut. 263, 114400(2020).
- Wu, Q., et al.
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