老年邓金-哈特利豚鼠膝关节内注射后膝关节的微型计算机断层扫描分析

摘要

Dunkin-Hartley 豚鼠是骨关节炎研究中一种成熟的动物模型。由于多种原因，此类研究可能受益于关节内注射，包括研究新型药物或治疗疾病。本文描述了一种在豚鼠中进行膝关节关节内注射的方法，以及随后通过显微计算机断层扫描分析评估与关节炎相关的膝关节变化。

摘要

本实验方案旨在指导研究人员在豚鼠中实施基于触诊引导的膝关节内注射技术，并利用微型计算机断层扫描（micro-computed tomography）进行评估。Dunkin-Hartley 豚鼠是骨关节炎研究的可靠模型，因其会自发性地在膝关节中发展出骨关节炎。关节内药物递送是一种在活体（in vivo）条件下研究试验性药物效应的常用方法。在人类中，通过关节内注射给予的治疗剂可缓解疼痛并延缓骨关节炎的进一步进展。与所有物种一样，将针头插入关节腔可能造成损伤，从而导致疼痛、跛行或感染。此类不良事件可能影响动物福利，干扰研究结果，并需要额外动物以达成研究目标。因此，建立正确的注射技术以预防并发症至关重要，尤其是在需要多次重复关节内注射的长期研究中。根据本方案所述方法，五只豚鼠在全身麻醉下接受了双侧膝关节注射。注射后七天，动物被实施人道安乐死，以分析骨关节炎的严重程度。在麻醉或膝关节注射后未发生任何不良事件，包括跛行、疼痛或感染。膝关节的X射线微型计算机断层扫描分析可检测与骨关节炎相关的病理变化。微型计算机断层扫描数据显示，年龄较大的动物骨关节炎更为严重，表现为骨矿物质密度和小梁厚度随年龄增加而升高。这些结果与组织学变化以及改良Mankin评分一致，后者是评估这些动物关节炎严重程度的既定且广泛应用的评分系统。本方案可用于优化豚鼠的关节内注射技术。

引言

骨关节炎（OA）影响着3250万美国成年人。该病由关节软骨进行性丧失、关节内及周围组织轻度炎症以及骨赘和骨囊肿形成为病因^1,2。症状通常在疾病晚期才出现，目前的治疗方法仅能提供姑息性缓解，且存在全身性副作用。由于对疾病根本机制的认识不足，尚无能够改变疾病进程的药物³。因此，临床上迫切且持续需要更有效的骨关节炎治疗药物。

目前已建立多种骨关节炎（OA）的动物模型，用于研究该疾病不同方面的病理过程⁴。尽管存在多种手术模型，例如前交叉韧带切断术和内侧半月板失稳术，但这些方法具有侵入性，且需要较高的技术操作水平⁵。化学诱导模型则相对侵入性较小，通常用于研究OA的疼痛机制⁶。其中一种广泛应用的小鼠模型是通过向膝关节内注射单碘乙酸钠（MIA）来诱导OA。该模型可产生可重复、显著且快速出现的疼痛样表型，并可通过调整MIA剂量进行表型分级⁷。该模型的建立技术细节已有文献报道⁷。由于解剖结构的差异，将该技术应用于豚鼠等体型较大的啮齿类动物较为困难。这些差异包括豚鼠邻近骨骼和关节周围肌肉组织更发达，以及腓骨与胫骨之间为关节连接，而小鼠则表现为远端融合⁸。Dunkin-Hartley豚鼠是一种广泛可得的豚鼠品系，作为公认的OA动物模型，因其可自然发生该疾病，从而为研究通过关节内注射给药的新型治疗手段对疾病进展的影响提供了可靠的模型系统⁹。Dunkin-Hartley豚鼠从三个月龄开始出现OA，雄性个体表现出更快的疾病进展和更严重的表型¹⁰。在豚鼠中，OA随年龄增长而进展，至12个月龄时，影像学上已可观察到相关病理改变¹¹。像Dunkin-Hartley模型这样的自发性OA模型无需人为干预即可诱导OA，因此能够更好地模拟人类OA的发病与进展过程，具有较强的转化研究价值¹⁰。此外，OA的自发性发展使得在单个动物的一侧膝关节单侧给药新型治疗药物时，可将对侧作为内部对照。这种内部对照设计可减少个体间差异对数据分析的影响，并有助于降低实验所需的总体动物数量。

X射线显微计算机断层扫描（µCT）分析是一种强大的工具，可用于对骨关节炎（OA）严重程度进行定量评估¹²。µCT通过扫描获取多个高分辨率X射线图像，这些图像是在样品旋转或X射线源与探测器旋转过程中获得的¹³。随后，三维（3D）体数据以堆叠图像切片的形式重建¹⁴。由于矿化骨组织在µCT中具有良好的对比度，因此该技术可用于评估3D结构特征，并对与OA相关的改变进行定量分析^15,16,17。与更常用的组织病理学和步态分析等方法相比，µCT具有多项优势。与仅对一两个组织切片进行组织学评估不同，µCT可扫描整个关节，从而对OA病变提供更为全面的整体评估¹⁸。虽然步态分析能够识别关节功能随时间推移出现的症状性变化，但关节结构的改变往往在OA相关功能变化出现之前就已长期存在。µCT可在跛行症状出现之前更敏感地检测OA的发展。其中两个特别相关的定量测量指标是骨矿物质密度和骨小梁厚度，二者在OA进展过程中均会增加^19,20。将分析分别针对软骨下骨板和骨小梁进行，有助于获得更可靠和精确的测量结果与比较，因为这两部分具有不同的结构特征。

本方法的总体目标是帮助研究人员成功地在豚鼠身上进行关节内注射。本方案使用了5月龄（n=2）、9月龄（n=1）和12月龄（n=2）的完整雄性Dunkin-Hartley豚鼠；该操作流程可推广至其他需要进行膝关节内注射的豚鼠品系和年龄阶段。在自发性骨关节炎模型（如Dunkin-Hartley模型）中，疾病进展及对连续治疗的反应通常需要数周至数月的长期监测⁹。这种长期实验方案涉及多次关节内注射，因此掌握正确的注射技术至关重要，以避免疼痛、跛行或感染等不良事件的发生，这些不良事件可能影响动物福利，并干扰研究结果，进而导致需要增加实验动物数量。本方案详细描述了豚鼠关节内注射的操作方法以及后续的µCT数据分析流程。

方案

本文所述所有方法均已获得南卡罗来纳医科大学动物护理与使用机构委员会的批准。本研究遵循3R原则。

1. 关节内注射的准备工作

1. 在开始实验前，让 Dunkin-Hartley 豚鼠在设施中适应至少一周时间。
   注：使用了 5 月龄（n=2）、9 月龄（n=1）和 12 月龄（n=2）的雄性豚鼠。雄性豚鼠表现出更加快速的骨关节炎发展进程以及更严重的表型。
2. 使用电动剃须刀剃除膝关节区域的毛发。
   注：注意内侧的乳头区域。
3. 将豚鼠置于异氟烷麻醉舱中，使用含 3–5% 异氟烷的 O₂ 混合气体（流速 2.5 L/min）进行麻醉，随后将豚鼠转移至连接非重复呼吸麻醉回路的鼻罩。在注射过程中调整异氟烷浓度以维持外科麻醉深度，通常氧流量为 0.5–1 L/min，异氟烷浓度为 1–3%。
   注：关节内注射会引起轻微且短暂的疼痛。动物在操作过程中处于麻醉状态，以避免感知疼痛刺激并提高注射准确性。在本研究中，使用镇痛药物（包括非甾体抗炎药）会干扰骨关节炎的进展²¹。由于疼痛仅为短暂性，且麻醉已提供保护作用，同时考虑到镇痛药物可能对模型造成干扰，因此除非动物在注射后出现跛行或触诊关节时表现出疼痛迹象等不良反应，否则不给予镇痛药。研究人员在常规注射时应考虑使用镇痛药。当出现不良反应时，建议使用镇痛药。镇痛方案应在研究开始前与机构兽医讨论，并获得实验动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。
4. 通过检查脚趾夹捏反应缺失，确认豚鼠已达到适当的麻醉深度。
5. 在双眼涂抹无菌眼用润滑剂，以防止角膜干燥和损伤。
6. 用无菌水将聚维酮碘稀释至 10%。
7. 用无菌水将 200 proof 乙醇稀释至 70% 乙醇。
8. 在生物安全柜中配制注射用溶液，以保持无菌状态。在本方案中，使用无菌载体溶液（1× 磷酸盐缓冲液）对双侧膝关节进行注射。可根据研究目的调整所用溶液。
   注：每次注射前应立即新鲜配制稀释液，以确保无菌。每次注射结束后，未使用的溶液应予以丢弃。
9. 用一次性无菌胰岛素注射器抽取注射溶液。注意尽量使用最小可行体积，以避免因液体体积过大而过度填充关节腔。在本研究中，使用 50 µL 注射体积。
10. 将豚鼠及其鼻罩放置在带有加热垫的清洁表面上，头部下方垫高以略微抬高头部，提供热支持。
11. 在执行注射操作时穿戴手术服、头帽、无菌手套和口罩。
12. 将 10% 聚维酮碘倒在棉球上，擦拭双侧膝关节区域。
13. 将 70% 乙醇倒在棉球上，擦拭双侧膝关节区域。
14. 重复步骤 1.12 和 1.13 两次。
    注：出于演示目的，相应视频仅展示使用 10% 聚维酮碘和 70% 乙醇各清洁一次膝关节及注射部位。随后采用环形擦拭方式再清洁两次，交替使用上述两种溶液。推荐采用三种连续擦洗程序，交替使用消毒液和酒精，以实现无菌操作技术。

2. 关节内注射

1. 在整个操作过程中，将豚鼠保持仰卧位。
2. 戴上一副新的无菌手套，触诊膝关节。
   注意：在本方案及视频中使用了经高压灭菌的丁腈手套。为实现无菌操作，应使用无菌手套，包括经高压灭菌的丁腈手套或外科手套。
3. 手动将膝关节屈曲至90°。
4. 将手指移至髌骨远端，通过屈伸后肢来定位关节腔远端的沟槽。
   注意：在此位置可触诊到髌骨，表现为位于关节腔正上方的小而坚实的结构。胫骨可被感知为位于髌骨远端的骨性结构。确定胫骨与髌骨的位置后，关节腔即位于二者之间，髌骨远端、胫骨近端，触感为一条沟槽。
5. 将胰岛素针头小心地沿中线、在髌骨远端插入关节腔内。针头应刺入皮肤下方1-2 mm以进入关节腔。
   注意：当膝关节屈曲时，关节腔最大的穿刺窗口位于肢体前侧中线、髌骨正下方。沿中线从前向后方向注射有助于准确进入关节腔，避免穿刺骨性结构。虽然也可采用从外侧向内侧的进针方式准确注射至关节腔，但该路径的可操作窗口较窄，尤其在膝关节屈曲时更为受限。
6. 缓慢向关节腔内注射50 µL溶液。确保针头顺利进入，且注射过程无阻力。
   注意：切勿将针头插入过深，以免造成关节或骨骼损伤，引发不必要的炎症和/或疼痛。若未能准确定位对应关节腔的沟槽，针头可能穿入股骨、髌骨或胫骨。因此，准确触诊出对应关节腔的沟槽至关重要，可避免关节周围注射或穿刺骨性结构所致的损伤。若注射部位皮下出现气泡，说明进针过浅，液体已进入皮下间隙。根据所用试剂的性质，药物可能通过扩散进入关节腔，或需重新进行注射。
7. 操作完成后，将针头丢弃至锐器盒中。
   注意：为练习和培训目的，可在大小相似的啮齿类动物或豚鼠尸体的关节腔内注射含染料的液体，随后解剖关节以确认注射位置。
8. 通过数次屈伸关节的方式按摩膝关节，以促进药物在关节腔内的扩散。
9. 在对侧肢体重复步骤2.1–2.5，注射1x PBS溶液一次。

关节内注射后的恢复

1. 关闭异氟烷，改用100%氧气持续通气，直至动物恢复意识。
2. 将动物置于加热垫上以提供体温支持，直至其能够自主活动。
3. 用纸巾作为隔离层，在膝关节处敷冰袋30秒，以帮助减轻注射引起的肿胀。
4. 在将动物送回饲养区前，评估其自主活动时的步态。
   注意：若发现任何步态异常，可能需要给予镇痛药物和支持性护理。建议在麻醉恢复后数小时再次评估其步态，以确保运动功能正常。

4. 微型计算机断层扫描（µCT）

1. 进行组织收获时，使用100%氧气与5%异氟烷混合气体建立手术麻醉平面。
2. 通过夹捏脚趾无反应确认动物已达到外科麻醉平面，随后人道处死动物 通过 根据机构政策和批准的动物使用方案，静脉内给予戊巴比妥钠 ≥ 150 mg/kg。
   注意：在本实验方案中，每只豚鼠的双膝各接受一次注射。注射一周后，对动物实施麻醉并人道安乐死。
3. 解剖分离皮肤与周围肌肉组织，取下双侧后肢。
4. 接下来，使用咬骨钳在股骨中段及踝关节近端处分离后肢。
   注意：所使用的扫描床和样品架无法容纳成年豚鼠的整个后肢。市场上有适用于较大样品尺寸的大型样品架。
5. 将组织置于中性缓冲甲醛溶液中固定72小时，然后进行µCT扫描。
6. 打开微型计算机断层扫描（µCT）软件，将含有福尔马林的样本放入与µCT样本架兼容的容器中，确保组织位于视野范围内。
7. 根据制造商建议，对µCT仪器进行暗场和亮场曝光校准。
8. 使用 Al+Cu 滤光片以 18 µm 扫描样品。采用偏移相机，旋转步长 0.7°，扫描 360°。
   注意：扫描将自动保存。

5. 用于评估骨微结构参数的图像处理

1. 下载并安装用于重建 µCT 图像的 µCT 重建软件。
2. 选择软件文件夹，然后双击打开软件。
3. 通过单击图像切片，从µCT图像中选择一个切片。
4. 选择重建文件的保存位置。选择 浏览 并创建一个名为 Recon 的新文件夹。所选文件格式应为 BMP(8)。
5. 检查 错位补偿.
   注意：通常情况下，估算结果接近准确，但可手动调整以移动重叠的图像，使左右边缘尽可能对齐。
6. 下 设置，应用 平滑、束硬化、CS旋转，以及 环形伪影 算法
   注意：选择预览图像以在重建前确定清晰度会很有帮助。微调设置也有助于确定最佳参数设置。
7. 选择 开始 开始处理重建。

6. 从重建图像中采集微结构数据

1. 下载并安装 Dataviewer。
2. 选择 VOI ，并调整样本方向，使其垂直对齐，以便后续分析更方便。
3. 将编辑后的 VOI 保存为一个新文件夹。
4. 下载并安装 CTAnalyser，用于微结构参数的骨特性分析。
   注意：CTAnalyser 的免费版本功能有限，建议获取完整授权版本。
5. 通过将图像保存为不同的图像范围，将分析分为软骨下骨板和小梁骨两部分。
   注意：分割分析并非必需，但由于软骨下骨板与小梁骨具有不同的特征，分别分析有助于获得更可靠的测量结果和比较。
6. 选择要分析的图像范围，从软骨下骨板开始，点击希望起始分析的图像切片。
7. 为每幅图像选择感兴趣区域，确保该区域包含全部骨组织，点击“感兴趣区域”标签进行设置。
8. 选择 二值化选择（Binary Selection） 标签。调整直方图，使背景与骨组织完全分离。
9. 选择 骨矿物密度（BMD） 标签。将该数据保存到一个新的分析数据文件夹中。
10. 选择 自定义处理（Custom Processing），然后进入 内部（Internal） 标签页。
11. 首先执行 阈值分割（Thresholding），选择 自动 Otsu（Automatic Otsu），然后点击 运行（Run）。
12. 接着选择 去噪（Despeckle），选择 去除黑色斑点（Remove black speckles），然后点击 运行（Run）。
13. 再次执行 去噪（Despeckle），选择 去除白色斑点（Remove white speckles），然后点击 运行（Run）。
14. 选择 三维分析（3D analysis），并勾选 基本参数（Basic values） 和 附加参数（Additional values）。
15. 重复步骤 6.2.2–6.4.5，重置图像以进行小梁骨分析。
    注意：确保输出文件位于一个新文件夹中，且文件与 BMD 数据文件相同。

结果

在对活体动物进行关节内注射之前，先在三只大鼠尸体上练习上述操作步骤，以确保注射位置正确。练习过程中， 50 µL 向两个膝关节内注射了70%的新亚甲蓝染料，注射方法采用上文所述方案，相当于进行了六次练习注射。注射后，通过在髌骨远端、关节间隙的前侧切开并穿过髌韧带的方式解剖膝关节，以暴露关节腔，并确认染料沉积的位置。由于新亚甲蓝染料呈亮蓝色溶液，其沉积部位可直接通过肉眼观察。尸体标本注射的代表性图像包含于下文 图1. 图1A 显示染料存在于关节腔内，表明注射位置正确且技术得当。在这些练习过程中，膝关节在全部六次尝试中均注射成功（成功率为100%）。出于演示目的，文中还包含了注射位置错误的示例 图1B- C. 如果注射进入皮下组织，液体会积聚并在皮肤下形成隆起的水疱，如图所示 图1B如果未将关节腔注入造影剂，则膝关节内将无染料存在，如图所示。

讨论

尽管骨关节炎（OA）的症状治疗已取得近期进展，但目前仍完全缺乏能够预防OA发病或延缓其进展的治疗药物²⁴。目前，严重OA的唯一治疗方法是关节置换术，但该方法成本高昂、具有侵入性，且可能导致患者出现并发症甚至死亡²⁵。因此，迫切需要继续利用OA动物模型开展研究，并持续开发新型治疗手段。已有多种动物模型可用于研究OA的不同方面，包括自发性模型以及化学或手术诱导的模型。化学物质注射方法（如MIA小鼠模型）对于疼痛研究至关重要，但无法使研究者追踪OA发展的进程，并在疾病发展过程中特定时间点进行干预²⁶。手术方法需要侵入性操作，且不能真实模拟人类OA的起始过程²⁷。Dunkin-Hartley豚鼠可自然发生OA，因此是一种广泛可用的自发性OA动物模型²⁸。该自发性模型非常适合用于研究OA发生机制的转化医学研究，因其无需人为干预，且其病理改变与人类OA高度相似⁶。既...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
200 证明乙醇	Decon Laboratories	2701	消毒剂
3D.SUITE 软件	Bruker		μ-CT 分析软件
Betadine 外科洗手液	Avrio Health	67618-151-16	消毒剂
带针头的胰岛素注射器	Ulticare	91008	用于注射
异氟烷	Piramal	803249	动物麻醉
中性缓冲福尔马林	Fisher Scientific	23-427098	组织固定
Nrecon 软件	Bruker		μ-CT 重建软件
磷酸盐缓冲液	Cytiva	SH30258.01	对照和稀释剂
SkyScan 1176	Bruker		用于扫描样品