Dunkin-Hartley 豚鼠是骨关节炎研究中一种成熟的动物模型。由于多种原因，此类研究可能受益于关节内注射，包括研究新型药物或治疗疾病。本文描述了一种在豚鼠中进行膝关节关节内注射的方法，以及随后通过显微计算机断层扫描分析评估与关节炎相关的膝关节变化。
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本文内容
摘要
摘要
本实验方案旨在指导研究人员在豚鼠中实施基于触诊引导的膝关节内注射技术，并利用微型计算机断层扫描（micro-computed tomography）进行评估。Dunkin-Hartley 豚鼠是骨关节炎研究的可靠模型，因其会自发性地在膝关节中发展出骨关节炎。关节内药物递送是一种在活体（in vivo）条件下研究试验性药物效应的常用方法。在人类中，通过关节内注射给予的治疗剂可缓解疼痛并延缓骨关节炎的进一步进展。与所有物种一样，将针头插入关节腔可能造成损伤，从而导致疼痛、跛行或感染。此类不良事件可能影响动物福利，干扰研究结果，并需要额外动物以达成研究目标。因此，建立正确的注射技术以预防并发症至关重要，尤其是在需要多次重复关节内注射的长期研究中。根据本方案所述方法，五只豚鼠在全身麻醉下接受了双侧膝关节注射。注射后七天，动物被实施人道安乐死，以分析骨关节炎的严重程度。在麻醉或膝关节注射后未发生任何不良事件，包括跛行、疼痛或感染。膝关节的X射线微型计算机断层扫描分析可检测与骨关节炎相关的病理变化。微型计算机断层扫描数据显示，年龄较大的动物骨关节炎更为严重，表现为骨矿物质密度和小梁厚度随年龄增加而升高。这些结果与组织学变化以及改良Mankin评分一致，后者是评估这些动物关节炎严重程度的既定且广泛应用的评分系统。本方案可用于优化豚鼠的关节内注射技术。
引言
骨关节炎（OA）影响着3250万美国成年人。该病由关节软骨进行性丧失、关节内及周围组织轻度炎症以及骨赘和骨囊肿形成为病因1,2。症状通常在疾病晚期才出现，目前的治疗方法仅能提供姑息性缓解，且存在全身性副作用。由于对疾病根本机制的认识不足，尚无能够改变疾病进程的药物3。因此，临床上迫切且持续需要更有效的骨关节炎治疗药物。
目前已建立多种骨关节炎（OA）的动物模型，用于研究该疾病不同方面的病理过程4。尽管存在多种手术模型，例如前交叉韧带切断术和内侧半月板失稳术，但这些方法具有侵入性，且需要较高的技术操作水平5。化学诱导模型则相对侵入性较小，通常用于研究OA的疼痛机制6。其中一种广泛应用的小鼠模型是通过向膝关节内注射单碘乙酸钠（MIA）来诱导OA。该模型可产生可重复、显著且快速出现的疼痛样表型，并可通过调整MIA剂量进行表型分级7。该模型的建立技术细节已有文献报道7。由于解剖结构的差异，将该技术应用于豚鼠等体型较大的啮齿类动物较为困难。这些差异包括豚鼠邻近骨骼和关节周围肌肉组织更发达....
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方案
本文所述所有方法均已获得南卡罗来纳医科大学动物护理与使用机构委员会的批准。本研究遵循3R原则。
1. 关节内注射的准备工作
- 在开始实验前，让 Dunkin-Hartley 豚鼠在设施中适应至少一周时间。
注：使用了 5 月龄（n=2）、9 月龄（n=1）和 12 月龄（n=2）的雄性豚鼠。雄性豚鼠表现出更加快速的骨关节炎发展进程以及更严重的表型。 - 使用电动剃须刀剃除膝关节区域的毛发。
注：注意内侧的乳头区域。 - 将豚鼠置于异氟烷麻醉舱中，使用含 3–5% 异氟烷的 O2 混合气体（流速 2.5 L/min）进行麻醉，随后将豚鼠转移至连接非重复呼吸麻醉回路的鼻罩。在注射过程中调整异氟烷浓度以维持外科麻醉深度，通常氧流量为 0.5–1 L/min，异氟烷浓度为 1–3%。
注：关节内注射会引起轻微且短暂的疼痛。动物在操作过程中处于麻醉状态，以避免感知疼痛刺激并提高注射准确性。在本研究中，使用镇痛药物（包括非甾体抗炎药）会干扰骨关节炎的进展21。由于疼痛仅为短暂性，且麻醉已提供保护作用，同时考虑到镇痛药物可能对模型造成干扰，因此除非动物在注射后出现跛行或触诊关节时表现出疼痛迹象等不良反应，否则不给予镇痛药。研究人员在常规注射时应考虑使用镇痛药。当出现不良反应时，建议使用镇痛药。....
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结果
在对活体动物进行关节内注射之前，先在三只大鼠尸体上练习上述操作步骤，以确保注射位置正确。练习过程中， 50 µL 向两个膝关节内注射了70%的新亚甲蓝染料，注射方法采用上文所述方案，相当于进行了六次练习注射。注射后，通过在髌骨远端、关节间隙的前侧切开并穿过髌韧带的方式解剖膝关节，以暴露关节腔，并确认染料沉积的位置。由于新亚甲蓝染料呈亮蓝色溶液，其沉积部位可直接通过肉眼观察。尸体标本注射的代表性图像包含于下文 图1. 图1A 显示染料存在于关节腔内，表明注射位置正确且技术得当。在这些练习过程中，膝关节在全部六次尝试中均注射成功（成功率为100%）。出于演示目的，文中还包含了注射位置错误的示例 图1B- C. 如果注射进入皮下组织，液体会积聚并在皮肤下形成隆起的水疱，如图所示 图1B如果未将关节腔注入造影剂，则膝关节内将无染料存在，如图所示。
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讨论
尽管骨关节炎（OA）的症状治疗已取得近期进展，但目前仍完全缺乏能够预防OA发病或延缓其进展的治疗药物24。目前，严重OA的唯一治疗方法是关节置换术，但该方法成本高昂、具有侵入性，且可能导致患者出现并发症甚至死亡25。因此，迫切需要继续利用OA动物模型开展研究，并持续开发新型治疗手段。已有多种动物模型可用于研究OA的不同方面，包括自发性模型以及化学或手术诱导的模型。化学物质注射方法（如MIA小鼠模型）对于疼痛研究至关重要，但无法使研究者追踪OA发展的进程，并在疾病发展过程中特定时间点进行干预26。手术方法需要侵入性操作，且不能真实模拟人类OA的起始过程27。Dunkin-Hartley豚鼠可自然发生OA，因此是一种广泛可用的自发性OA动物模型28。该自发性模型非常适合用于研究OA发生机制的转化医学研究，因其无需人为干预，且其病理改变与人类OA高度相似6。既.......
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致谢
本研究得到了南卡罗来纳州SmartState®药物发现讲席基金（PMW）的资助， 南卡罗来纳医科大学实验动物资源部及南卡罗来纳医科大学药物发现核心中心。本出版物还获得了美国国立卫生研究院转化科学促进国家中心资助号 TL1 TR001451 的支持 & UL1 TR001450，以及美国国家牙科与颅面研究所 & 美国国立卫生研究院口腔与颅面研究所，资助号 R01DE029637。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 200 证明乙醇 | Decon Laboratories | 2701 | 消毒剂 |
| 3D.SUITE 软件 | Bruker | μ-CT 分析软件 | |
| Betadine 外科洗手液 | Avrio Health | 67618-151-16 | 消毒剂 |
| 带针头的胰岛素注射器 | Ulticare | 91008 | 用于注射 |
| 异氟烷 | Piramal | 803249 | 动物麻醉 |
| 中性缓冲福尔马林 | Fisher Scientific | 23-427098 | 组织固定 |
| Nrecon 软件 | Bruker | μ-CT 重建软件 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Cytiva | SH30258.01 | 对照和稀释剂 |
| SkyScan 1176 | Bruker | 用于扫描样品 |
参考文献
- Callahan, L. F., Cleveland, R. J., Allen, K. D., Golightly, Y. Racial/Ethnic, socioeconomic, and geographic disparities in the epidemiology of knee and hip osteoarthritis. Rheum Dis Clin North Am. 47 (1), 1-20 (2021).
- Mandl, L. A. Oste....
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重印与许可
