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方法文章

利用腺相关病毒（AAV）和2细胞胚胎电穿孔技术对大鼠胚胎进行CRISPR-Cas9基因组编辑

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DOI：

10.3791/66069

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2024年3月15日

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1Animal Modeling Core, University of Missouri, 2Comparative Medicine Program, University of Missouri, 3Rat Resource and Research Center, University of Missouri, 4Department of Veterinary Pathobiology, University of Missouri

本文内容

摘要

本方案介绍了一种优化的遗传修饰大鼠模型制备方法。利用腺相关病毒（AAV）递送DNA修复模板，并通过电穿孔技术将CRISPR-Cas9试剂递送至2细胞期胚胎，以完成基因组编辑过程。

摘要

基因组编辑技术被广泛用于制备转基因动物，包括大鼠。将DNA修复模板和CRISPR-Cas试剂通过胞质或原核显微注射导入胚胎是目前最常用的递送方法。然而，这类显微操作需要使用专业设备，操作繁琐，且要求具备一定的技术水平。此外，显微注射技术常因对胚胎造成机械性损伤而导致胚胎存活率降低。在本实验方案中，我们开发了一种优化的方法，可在无需显微注射的情况下将较大的DNA修复模板递送至胚胎，与CRISPR-Cas9基因组编辑技术协同作用。该方案结合了腺相关病毒（AAV）介导的单链DNA供体模板递送与CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）的电穿孔递送，用于修饰2细胞期胚胎。利用这一新策略，我们已成功构建了携带1.2至3.0 kb大小DNA序列插入的靶向基因敲入大鼠模型，编辑效率介于42%至90%之间。

引言

基于CRISPR的基因组编辑工具的发展极大地加快了我们高效构建新型且更为复杂的遗传工程大鼠模型的能力。将单导向RNA（sgRNA）与Cas9核酸酶结合，可形成核糖核蛋白（RNP）复合物，靶向基因组中特定的DNA序列，并导致双链DNA断裂。由于细胞的DNA修复机制具有易错性，修复过程中会引入插入和缺失（INDELs），从而可能破坏目标基因的功能。当基因组编辑试剂与设计好的工程化DNA序列（修复模板）共同递送时，修复模板会通过一种称为同源定向修复（HDR）的过程插入到含有双链DNA断裂的区域。这是一种构建具有靶向DNA插入/替换（敲入）的动物模型的有效策略。其中一个局限性在于，敲入序列通常较大，已被证明会降低基因编辑效率，从而使所需模型的构建更加困难1。提高敲入效率的策略包括对双链DNA（dsDNA）和单链DNA（ssDNA）修复模板进行线性化处理，以及对DNA修复模板进行化学修饰2,3,4。此外，还尝试了原核显微注射联合HDR促进化合物、显微注射过程中施加电脉冲，以及在特定时间点向2细胞期胚胎进行显微注射等方法5,6,7。尽管其中一些方法已取得一定成功，但将大于1.0 kb的DNA序列整合仍面临较大的技术挑战。

电穿孔是一种将试剂导入培养细胞系的常用方法，也可作为显微注射的替代方案，用于将CRISPR-Cas9组分递送至胚胎中。胚胎电穿孔最初在大鼠胚胎中实现8，此后已成功应用于小鼠9,10,11,12,13、猪14,15及其他动物模型生物16,17,18。将悬浮于含有CRISPR-Cas9试剂培养基中的胚胎置于电穿孔杯或载玻片上两个电极之间，并施加直流电脉冲。该过程会在透明带和胚胎质膜上形成瞬时孔隙，使CRISPR-Cas9组分得以进入胚胎。通常先使用中等强度的电穿孔脉冲（"poring"）形成临时孔隙，随后施加较低强度的电转移脉冲（"transfer pulses"），以促进带负电荷的基因组编辑组分的迁移。胚胎电穿孔效率高、通量大且操作简便。然而，尽管已有研究表明该方法在导入较小（<200 bp）的单链DNA修复模板方面非常成功，但关于成功电穿孔较大（>1.0 kb）修复模板的报道仍较少13,19。这种尺寸限制成为利用胚胎电穿孔构建需要大片段插入的基因敲入动物模型的主要障碍。

在基因治疗领域，腺相关病毒（AAVs）长期以来被用作递送遗传物质的载体，因其对分裂和非分裂细胞均具有高效的体内感染能力，且无致病性，基因组整合频率极低20,21。近年来，越来越多的研究将AAVs与CRISPR-Cas9技术相结合，用于递送DNA修复模板和CRISPR试剂22,23,24。该策略可在无需显微注射技术的情况下递送较大的DNA修复模板。

HDR 通路在细胞周期的 S 期晚期和 G2 期更为活跃25,26在所进行的研究中 体外通过将CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物（RNPs）和DNA修复模板递送至G2期同步化的细胞，或利用Cas9-Geminin融合蛋白将Cas9蛋白的存在限制在S晚期和G2期，显著提高了敲入效率2此外，合子基因组激活（ZGA）的主要事件发生在2细胞期胚胎的延长G2期，且与开放的染色质状态相关。据推测，这使得CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物（RNPs）和修复模板对基因组DNA具有更高的可及性。

我们的目标是结合腺相关病毒（AAV）方法与胚胎电穿孔技术，在胚胎发育的2细胞阶段引入CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物（RNPs），从而在上述所有观察结果的基础上进一步优化基因编辑策略。该策略充分利用了AAV在递送较大DNA修复模板方面的优势、电穿孔技术的操作简便性，以及在胚胎发育过程中2细胞阶段基因组可及性更佳的特点，从而建立一种高效靶向插入DNA序列的基因工程方法。如本实验方案所述，我们优化后的方法能够在无需显微注射技术的情况下，成功构建携带1.2至3.0 kb大小DNA序列插入的靶向敲入大鼠模型。

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方案

所有实验程序均经密苏里大学机构动物护理和使用委员会批准（ACUC方案编号#25580），并依照《实验动物护理和使用指南》中规定的原则进行。

1. 腺相关病毒介导的DNA修复模板递送

  1. 设计DNA载体，使目标敲入序列位于两个同源臂之间。典型的同源臂长度为300-500 bp。通过将载体克隆至合适的质粒骨架中，并包装成重组单链AAV1或单链AAV6（血清型1或6），确保整个DNA修复模板（同源臂 + 目标敲入序列）两侧均被反向末端重复序列（ITRs）所包围。
    注意：如果DNA修复模板中包含sgRNA靶序列，必须引入沉默突变以破坏该序列，从而防止CRISPR-Cas9对已正确靶向的等位基因进行再次编辑。
    警告：重组AAV病毒载体为非整合型，属于生物安全等级1级（BSL-1）。对接触过病毒的胚胎进行移液和操作时，应采用标准的无菌技术。
  2. 将携带DNA修复模板的工程化单链AAV1或单链AAV6加入35 mm培养皿中含矿物油的30 µL KSOM-R培养基中，终浓度为3 × 107 基因组拷贝（GC）/µL。27,28
  3. 将可见原核的受精卵移入含有工程化单链AAV的KSOM-R培养基中。
    注意：采用本方案时无需对透明带进行薄化处理，因为AAV血清型1和6可高效穿透透明带，实现DNA修复模板的有效递送。
  4. 在37 °C、5% CO2及最大湿度条件下孵育18-20小时，以确保充分的病毒感染与转导。

2. 电穿孔准备

  1. 次日，在无菌无RNase的离心管中配制电穿孔混合液，其中包含浓度为100 ng/µL的sgRNA和浓度为100 ng/µL的Cas9蛋白，用Opti-MEM培养基稀释，轻轻混匀。
  2. 室温孵育10分钟，以促进RNP复合物的形成。
  3. 孵育期间，打开电穿孔仪，并将导线连接至间距为1.5 mm的玻璃滑片电极。
  4. 按照表1中所述设置电穿孔参数。

3. 二细胞胚胎电穿孔

  1. 轻柔吹打 5 µL 将CRISPR电穿孔混合液加样至载玻片上两个电极之间，注意避免在溶液中引入气泡。
  2. 将2细胞期胚胎从AAV溶液中取出。将2细胞期胚胎排列在混合液中，避免其接触电极的侧壁，以防止细胞裂解。
  3. 按压 欧姆 按下按钮以测量阻抗。检查并确保阻抗值在0.100至0.300 kΩ之间。反应体积会影响阻抗（增加体积可降低阻抗，减少体积可提高阻抗）。
  4. 按压 开始该过程只需几秒钟即可完成。
  5. 电穿孔后立即取出胚胎，并用新鲜溶液洗涤3次 30 µL KSOM-R 培养基液滴
  6. 将胚胎重新放回 37 °C 5% CO₂ 培养箱2 最大湿度 体外 培养中 500 µL KSOM-R 培养基液滴覆盖石蜡油中。或者，通过手术将胚胎移植至交配后1.5天（dpc）的假孕雌性大鼠体内，以获得活产子代。

基因编辑过程；rAAV DNA递送、胚胎电穿孔、CRISPR、啮齿类动物模型；示意图。
图1：AAV介导的DNA递送与2细胞期胚胎电穿孔在CRISPR-Cas9基因组编辑中的流程示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

按照本方案，通过电穿孔将CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物导入2细胞期胚胎后，可实现腺相关病毒介导的DNA修复模板高效递送，从而在胚胎中实现高效的同源定向修复（HDR）。如视频所示，成功的电穿孔过程会在每个电极上形成气泡（图2C），且阻抗保持在0.100至0.300 kΩ范围内。电穿孔后，胚胎出现肿胀、充满透明带内卵周隙的现象并不少见（图3），这种肿胀通常在培养数小时后逐渐消退。此外，对2细胞期胚胎进行电穿孔后，也可能观察到少量细胞融合事件（比例不超过20%）（图3）。通过谨慎地将胚胎沿电极水平轴方向排列而非垂直轴排列，可能有助于避免细胞融合（图2B）。然而，我们通常在电穿孔后直接弃除所有发生融合的胚胎。

我们采...

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讨论

CRISPR-Cas基因组编辑系统通过在多种动物物种中高效地实现简单和复杂、定制化的遗传修饰，彻底改变了基因工程领域。与基因组编辑相关技术的不断优化和改进进一步提升了其多功能性。本文介绍了一种新方法，即利用ssAAV介导的DNA递送，结合CRISPR-Cas9试剂对2细胞期啮齿类胚胎进行2细胞胚胎电穿孔。我们已证明，这是一种构建靶向敲入动物模型的有效方法。

使用腺相关病毒（AAV）的一个主要优势在于，它能够将较大的DNA修复模板递送至胚胎中，而无需显微注射技术。AAV介导的递送还能在一定程度上克服单独使用电穿孔时对DNA模板大小的限制。然而，使用AAV时也存在一些重要考虑因素。透明带是包绕受精卵的硬化糖蛋白基质，作为一种物理屏障，常常阻碍核酸的递送。对透明带进行减薄是一种常用的技术，以改善对胚胎的可及性。然而，有研究报道，在透明带预先减薄的胚胎中，使用较高剂量（1 × 107 GC/µL 至 1 × 109 GC/µL）的AAV感染会阻碍胚胎发育22。不过，某些AAV血清型能够穿透透明带

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者谨此感谢 Nolan Davis 在视频拍摄和视频编辑方面提供的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
用于电极的鳄鱼夹导线NepaGeneC117
矿物油MilliporeSigmaM5310
NepaGene21 Super Electroporator NepaGeneNEPA21
载玻片上的铂金板电极NepaGeneCUY501P1-1.5
PURedit Cas9 蛋白MilliporeSigmaPECAS9
sgRNA（化学修饰型）SynthegoN/A
ssAAV1 或 ssAAV6 包装的 DNA 修复模板VectorbuilderN/A

参考文献

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