用于大规模制造细胞球体的三维声学组装装置

摘要

细胞球体已被视为生物应用领域中一种潜在的模型。本文介绍了一种利用三维声学组装装置可扩展地生成细胞球体的实验方案，该方法能够高效、稳健且快速地制备均一的细胞球体。

摘要

细胞球是具有前景的三维（3D）模型，在许多生物学领域中已获得广泛应用。本方案介绍了一种利用三维声学组装装置，通过可操控的步骤制备高质量、高通量细胞球的方法。该声学组装装置由三个锆钛酸铅（PZT）换能器组成，分别布置在方形聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）腔室的X/Y/Z平面。当施加三个信号时，该构型能够产生悬浮声学节点（LANs）的三维点阵图案。因此，明胶甲基丙烯酰胺（GelMA）溶液中的细胞可被驱动至LANs位置，形成三维空间内均匀的细胞聚集体。随后，通过紫外光照射使GelMA溶液发生光交联固化，作为支持细胞聚集体生长的支架。最后，在温和条件下依次溶解GelMA支架，即可获得并回收大量成熟的细胞球。这种新提出的三维声学细胞组装装置将有助于实现细胞球甚至类器官的大规模制备，为生物学领域提供极具潜力的技术手段。

引言

与传统的二维培养模型相比，三维体外（in vitro）培养模型具有更接近体内（in vivo）环境的结构和形态特征，已被公认为在组织工程、疾病建模和药物筛选等多种生物医学应用中具有广阔前景的系统^1,2,3。作为一类三维培养模型，细胞球（cell spheroids）通常指细胞聚集形成的三维球状结构，其特征是细胞间以及细胞与基质间的相互作用显著增强^4,5,6。因此，构建细胞球已成为开展多种生物学研究的有力工具。

已开发出多种技术用于获得球状体，包括悬滴法⁷、非黏附培养板⁸或微孔装置⁹。原则上，这些方法通常通过利用重力等物理力来促进细胞自组装，同时尽量减少细胞与基底之间的相互作用。然而，这些方法往往操作繁琐、生产效率低，并且在控制球状体尺寸方面存在挑战^10,11。重要的是，为满足特定的生物学应用需求，大量制备尺寸合适且均一的球状体至关重要。与上述方法相比，声波作为一种外力驱动技术^12,13,14，基于通过外力增强细胞聚集的原理，在高质量、高通量大规模制造细胞球状体方面展现出潜力^15,16,17,18。与电磁力或磁力不同，基于声学的细胞操控技术具有非侵入性和无需标记的优点，能够实现生物相容性优异的球状体形成^19,20。

通常，基于驻波表面声波（SAWs）和体声波（BAWs）的装置已被开发用于生成球形细胞聚集体，其利用相应驻波声场产生的声节点（ANs）^21,22,23。特别是基于BAWs的声学组装装置，因其制造简便、操作容易且具有优异的可扩展性，在构建细胞球体方面受到广泛关注^24,25。我们近期开发了一种简便的基于BAWs的声学组装装置，能够高通量地生成细胞球体²⁶。该装置由一个方形聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）腔室构成，腔室在X/Y/Z三个方向上分别安装有锆钛酸铅（PZT）换能器。该结构可形成悬浮声节点（LANs）的三维点阵模式，从而驱动细胞组装。与此前报道的仅能形成一维或二维声节点阵列的BAWs或SAWs装置相比^27,28,29，本装置可在明胶甲基丙烯酰胺（GelMA）溶液中实现三维点阵式LANs，从而快速形成细胞聚集体。随后，在光交联的GelMA支架中培养三天后，细胞聚集体发育为具有高存活率的球形结构。最终，可从GelMA支架中轻松获得大量尺寸均一的细胞球体，用于后续应用。

方案

1. 三维声学组装装置的制备

1. 首先通过激光切割制备四块厚度为 1 mm 的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）板材³⁰，然后将它们粘合在一起，形成一个内宽为 21 mm、高为 10 mm 的方形腔室。
2. 接着，将另一块厚度为 1 mm 的 PMMA 板材粘接在腔室底部，作为生物墨水的承载基底。
3. 小心地将三个锆钛酸铅（PZT）换能器（每个尺寸为长 20 mm、宽 10 mm、厚 0.7 mm，主共振频率为 3 MHz，参见材料表）分别粘附在腔室三个正交侧壁的外表面。确保底部 PZT 换能器位于腔室正下方中心位置。
4. 将导线焊接到每个 PZT 换能器的两个导电区域上。
5. 最后，将装置固定在一个中空底座上，以防止底部 PZT 与其他台面接触。

2. 建立声学组装系统

1. 首先将声学装置安装到显微镜载物台上，以便从顶部观察腔室内部。
2. 将数字显微镜置于未安装PZT换能器的一侧，以实现对腔室内部的侧向观察。
3. 将三个PZT换能器的导线分别串联连接至三个功率放大器和函数发生器的三个输出通道（参见材料表）。
4. 在函数发生器上为每个PZT换能器设置参数，包括正弦波形、频率和振幅等。
5. 为确保无菌，先用75%酒精充满声学装置的腔室并作用5分钟，随后用无菌PBS溶液彻底清洗；接着在超净工作台中用紫外光照射腔室至少1小时。

3. 细胞培养与收获步骤

1. 使用添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），在T25细胞培养瓶中培养人肝细胞癌细胞系C3A细胞（见材料表）。
2. 当C3A细胞融合度达到约80%时，进行细胞传代：首先，用PBS洗涤培养瓶底部两次。然后，向细胞培养瓶中加入2 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，并在37 °C孵育以促进细胞脱落。加入2 mL完全培养基以终止消化过程。
3. 将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在室温下以200 × g离心5分钟，获得细胞沉淀。

4. 生物墨水的制备

1. 通过将0.3 g GelMA和0.025 g LAP（见材料表）溶解于5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制含0.5% (w/v) 二苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂（LAP）的6% (w/v) GelMA溶液。将混合物置于47 °C水浴中静置1小时。
2. 在与细胞混合前，将GelMA溶液经0.22 µm滤膜（见材料表）过滤以实现灭菌。
3. 将上述步骤（步骤3.3）中提到的细胞沉淀重悬于细胞培养基中。取少量细胞与0.4%台盼蓝溶液染色，随后使用洁净的血细胞计数板进行细胞计数。
4. 根据上述获得的细胞密度计算所需C3A细胞量，并将其与灭菌后的GelMA溶液混合，制备细胞密度为2 × 10⁶ 个细胞/mL的生物墨水。
5. 为便于观察组装后的细胞球体，可预先将C3A细胞与2 µM细胞示踪剂（DiO染料，见材料表）在37 °C孵育20分钟进行染色。随后用新鲜细胞培养基洗涤标记后的细胞三次，再投入使用。

5. 使用声学装置组装细胞球体

1. 将超过 1 mL 的生物墨水移液至已灭菌的腔室中。确保液面与腔室底部之间的面对面距离为声波半波长的整数倍。
   注意：可通过调节加入的生物墨水量来控制该距离。声波波长（λ）可使用公式 λ = c/f 估算，其中 c 表示介质中的声速，f 表示 PZT 换能器的频率。
2. 开启信号发生器和功率放大器，以启动各个 PZT 换能器的驱动。
   注意：建议首先单独驱动每个 PZT 换能器，以获得最佳的平行线状细胞图案。可通过在每个 PZT 换能器的主共振频率附近进行步长为 0.001 MHz 的频率扫描来实现。随后，将这些最优信号同时施加到全部三个 PZT 换能器上，以获得预期的三维点状细胞图案。在施加每个输入信号前，需轻轻搅动使细胞在生物墨水中均匀分散。
3. 使用蓝光（405 nm，60 mW/cm²，30 s）对生物墨水进行交联，形成包裹声学组装细胞聚集体的三维水凝胶支架。随后，关闭信号发生器和功率放大器。
4. 小心地将三维水凝胶支架从腔室转移至培养皿中，并使用洁净的刀片将其切割成小块（例如 2 mm × 2 mm × 2 mm）。
5. 加入细胞培养基进行培养。
   ​注意：请记得每天更换培养基。

6. 收集细胞球体

1. 首先使用倒置显微镜观察细胞球在支架不同层面的形成情况。
2. 培养 3 天后，移除培养基，并用 PBS 将水凝胶支架彻底清洗两次。
3. 将支架与含有细胞培养基按 1:200 稀释的 GelMA 裂解缓冲液（体积超过 2 mL）在细胞培养箱中孵育 30 分钟，以溶解水凝胶支架。
4. 将上一步所得溶液转移至离心管中，在室温下以 200 × g 离心 5 分钟，获得细胞球沉淀。
5. 弃去上清液，并将沉淀重悬于新鲜培养基中，用于后续实验操作。

7. 类球体活力分析

1. 使用活/死细胞染色试剂盒（见材料表）评估水凝胶支架内或回收的细胞球体的存活率。
2. 在不同培养时间点，将样品与含1 µL钙黄绿素-AM（Calcein-AM）和2 µL碘化丙啶（PI）的1 mL PBS溶液于37 °C孵育15分钟。
3. 对于水凝胶支架内的样品，直接用PBS洗涤两次；对于回收的球体，于室温下以200 × g离心5分钟，获得球体沉淀，观察前洗涤两次。
4. 使用荧光显微镜观察样品并采集荧光图像。
5. 使用ImageJ计算被Calcein-AM染色的面积占Calcein-AM与PI总染色面积的比例，以确定球体的存活率。

结果

本研究设计了一种用于大规模制造细胞球体的三维声学组装装置。该声学装置包含一个方形腔室，腔室外表面的X平面和Y平面各连接一个PZT换能器，腔室底部还设有一个PZT换能器（图1A、B）。两个信号发生器的三个输出通道分别连接至三个功率放大器，以产生三个独立的正弦信号，驱动PZT换能器（图1C）。

用于驱动安装在腔室X/Y/Z平面上的三个PZT换能器的最佳共振频率分别为3.209 MHz、3.283 MHz和3.215 MHz。三个PZT换能器的最佳振幅均为10峰峰值输出电压（Vpp），由示波器测量得到。图2A展示了利用三维声学组装装置生成细胞聚集体的工作机制。当施加信号时，细胞在声辐射力（ARF）的作用下被驱动至声学节点位置。为观察细胞球体，实验前使用2 µM DiO（绿色荧光）对细胞进行预染色。声学细胞组装完成后，采用共聚焦显微镜观察三维声学组装形成的细胞聚集体。这些细胞聚集...

讨论

利用3D声学组装装置等技术高效、稳定且高通量地制备细胞球体，在推动生物医学工程和药物筛选方面具有广阔前景^1,2,3。该方法通过简化的操作流程，实现了细胞球体的大规模生产。

然而，在使用该声学装置时，有一些关键因素需要考虑。形成驻波对于构建三维点阵声场至关重要。在该装置中，每个维度仅有一个PZT换能器，作为声波激发源。因此，在每个维度上，PMMA腔室相对壁面之间或PMMA与水面之间的面对面距离必须为半波长的整数倍。我们所用PZT换能器的主频率为1 MHz，这使得在水或生物墨水中的波长约为500 µm。因此，在水平方向上，声学装置中PMMA腔室两个相对壁面之间的面对面距离被设定为21 mm，该数值已考虑了PZT换能器本身的尺寸。在垂直方向上，底部PMMA壁面与水面之间的面对面距离可通过调节生物墨的体积进行调整，以满足驻波形成的条件。在实验操作过程中，可能需要进行微小的频率调节，以补偿距离上的偏差。此外...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22-μm 滤膜	Merck	SLGSM33SS	用于 GelMA 溶液的灭菌
35 mm 细胞培养皿	Corning	430165	用于细胞培养
共聚焦显微镜	Nikon	A1RHD25	荧光细胞观察
DiO 染料	Beyotime	C1038	用于细胞染色的染料
DMEM	Gibco	12430054	细胞培养基
FBS	Gibco	10099141C	细胞培养基添加剂
函数发生器	Rigol	DG5352	用于射频信号生成
GelMA	Regenovo	无	用于制备生物墨水
GelMA 裂解缓冲液	EFL	EFL-GM-LS-001	用于溶解 GelMA 支架
倒置显微镜	Nikon	Ti-U	细胞观察
LAP	Sigma-Aldrich	900889	用作光引发剂
活/死细胞检测试剂盒	Beyotime	C2015M	细胞活力分析
PBS	Gibco	10010002	用作缓冲液
青霉素-链霉素	Gibco	15070063	防止细胞培养污染
功率放大器	Minicircuit	LCY-22+	增加射频信号的电压幅度
PZT 换能器	烟台兴之文商贸有限公司	PZT-41	声学组装装置的功能单元
T25 细胞培养瓶	Corning	430639	用于细胞培养
台盼蓝	Gibco	15250061	细胞计数
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200056	细胞解离酶