使用低成本染料可视化糖原积累和肠道完整性 秀丽隐杆线虫

摘要

通过实验教学可以使生物学课程对学生更具吸引力。本文介绍了两种不同但互补的实验方案，可在课堂教学中用于鼓励学生提出并验证与高热量饮食、饥饿和衰老相关的假设。

摘要

Caenorhabditis elegans（秀丽隐杆线虫）是一种透明的非寄生性线虫，其生物学结构简单，因此非常适合通过细胞或其分子成分的染色来开展生命科学教学。卢戈氏碘液（碘-碘化钾溶液）在生物化学中被广泛用于染色糖原储存。通过该染色方法，可以观察到饲喂与饥饿状态下线虫之间的差异，以及不同条件（如不同饮食和氧气水平）的影响。刺蓝（Erioglaucine）是一种蓝色染料，可用于指示肠道屏障完整性的丧失。当肠道屏障完整时，蓝色染料局限于肠腔内；而当屏障完整性被破坏时，染料会渗漏至体腔中。教师可利用体视显微镜或普通显微镜展示这些生理和生化变化，也可引导学生提出科学问题，并利用上述染色方法进行假设的构建与验证。本实验方案描述了学生可轻松操作的两种针对C. elegans的染色技术。

引言

高中阶段的生物科学教学一直面临持续的挑战。值得注意的是，技术的获取与应用已在教与学过程中带来了重要进展，然而，诸如人工智能聊天机器人等工具由于提供了易于获得（有时却是错误的）回答，使得理性思考和证据寻求变得更加困难¹。因此，在课堂教学中采用以探究式学习为导向的科学方法并结合实践性实验，是培养学生或激发学生批判性思维、创造力和技术能力的重要策略²。

在此背景下，自由生活的线虫 秀丽隐杆线虫 已成功用于教学实验³ 因其具有特定优势：它不是寄生生物，且 大肠杆菌 用于喂养的生物安全等级为1级，因此生物危害几乎为零；其运动方式优雅且可量化，便于学生观察；此外，该生物体透明，既可直接观察器官，也可用染料染色以指示生物分子的存在或生理变化的发生⁴因此，可以在课堂上对与生物化学和生理变化（如衰老）相关的简单假设进行假说提出和实验验证。

糖原是一种储存性碳水化合物，由葡萄糖分子通过葡萄糖基残基以(1→4)-α糖苷键形成线性连接，并在分支点处通过(1→6)-α糖苷键连接而成的长链且高度分支的结构，对肌肉收缩、细胞分化以及血糖稳态维持具有重要作用⁵。进食后，胰岛素激活糖....

方案

注意：Escherichia coli OP50（E. coli OP50）菌株和Bristol N2野生型线虫可从美国明尼苏达大学的秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）获取，或由C. elegans实验室赠送。为确保研究人员的安全，必须使用个人防护装备。尽管次氯酸钠和氢氧化钠等试剂的浓度较低，但仍需佩戴文中强调推荐的个人防护装备，以最大限度降低与这些化学品相关的潜在风险。

1. 糖原含量

1. 测试平板的制备
   1. 为每种线虫品系准备六个 60 mm × 15 mm 的 NGM 琼脂平板²⁰（每个平板含 10 mL 按照补充表 1所述配制的线虫生长培养基琼脂，NGM），在室温下干燥 1 天。保持平板封闭以防止污染。
   2. 在超净工作台中，向每种品系的四个 60 mm × 15 mm NGM 平板中各加入 200 µL 的 E. coli OP50 液体培养物（光密度 = 0.600，波长约为 600 nm），接种后将平板封闭，在 37 °C 下孵育 1 天后使用。
      注意：准备六个平板（步骤 1.1），但仅用 E. coli OP50 细菌接种其中四个。将剩余两个平板储存在 4 °C，用于后续饥饿条件下的实验。本分析....

结果

糖原含量检测为筛选多种测试条件提供了一种可靠且快速的方法，例如比较不同菌株对糖原合成或降解影响的研究。在本研究中，L4期线虫被分为三种不同的测试条件：禁食组、喂养组和葡萄糖富集组。该检测共进行了三次，每次检测中每种条件均设置两个重复；代表性图像显示于 图3每次实验后，使用卢戈氏碘溶液染色的线虫在体视显微镜下进行观察，并对各组线虫的染色情况进行定性比较。从肉眼观察来看，饥饿组（禁食）线虫的染色强度较喂食组线虫弱。 E. coli OP50（常规）以及饲喂有 E. coli OP50 和 D-葡萄糖（高葡萄糖）。此外，以大肠杆菌 OP50 和 D-葡萄糖（高葡萄糖）喂养的线虫表现出最强的染色信号。

讨论

综上所述，本实验方案利用卢戈氏碘染色法对单个秀丽隐杆线虫（C. elegans）的糖原含量进行定性评估：这是一种操作简便、结果可靠且快速的检测方法。卢戈氏碘染色是一种无标记且非侵入性的技术，可在亚细胞分辨率下获取分子数据，从而实现对单条线虫体内糖原含量变化的监测¹⁰。此外，该方法因所需设备极少而具有显著的成本优势。仅需使用显微镜或体视显微镜即可采集图像，且只要保持所有照片的光照/亮度/曝光设置一致，甚至可以使用手机摄像头轻松完成成像。同时，通过某些操作步骤的优化可进一步提升本方案的效果。例如，可使用酒精灯和重力沉降替代更复杂的实验设备（如超净工作台和离心机）。这些替代方案使该方法更加经济实惠，并便于广大研究人员使用。除科研人员外，教育工作者也可将该检测方法应用于学校教学，以直观展示与糖原储存及其生物合成相关的生理变化。

尽管传统的酶学检测方法可以定量糖原水平，但卢戈氏碘染色法在评估秀丽隐杆线虫（C. elegans）体内糖原储存方面展现出高灵敏度、准确性、低成本以及高通量的潜力。在本研究中，数据揭示.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	本地供应商	-
37度培养箱	KS 4000i	97014-816
50 mL 一次性塑料离心管	本地供应商	-
6 cm 培养皿	本地供应商	-
细菌学用琼脂	丁â云母石í云母 Contemporânea Ltda.	9002-18-0
秀丽隐杆线虫 Bristol N2（野生型）	美国明尼苏达秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC，美国明尼苏达州）	-
CaCl₂	丁â云母石í云母 Contemporânea Ltda.	10035-04-8
胆固醇	Sigma-Aldrich 巴西有限公司	57-88-5
D-(+)-葡萄糖无水物	霓虹	50-99-7
蒸馏水	本地供应商	-
二钠盐亮蓝	Sigma-Aldrich 巴西有限公司	3844-45-9
大肠杆菌 OP50	美国明尼苏达州秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）	-
超净工作台	Mylabor
培养箱	北美松下医疗公司，MIR-254-PA	-
KH2PO4	丁â云母石í云母当代ânea Ltda.	7778-77-0
盐酸左旋咪唑	RIPERCOL L 150F	-
卢戈氏碘液	Sigma-Aldrich 巴西有限公司	L6146
MgSO4	合成	S1063-01-AH
微型离心机	Centrifuge 5425R Eppendorf SE，德国
Na2HPO4	丁â云母 Quí云母 Contemporânea Ltda.	7558-79-4
NaCl	丁â云母石í云母当代ânea Ltda.	7647-14-5
制霉菌素	Sigma-Aldrich 巴西有限公司	N6261
蛋白胨细菌学	êxodo científica	91079-38-8
体视显微镜	Leica S8 Apo 体视显微镜 (Sã巴西圣保罗
硫酸链霉素	Estreptomax	-