识别骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病中的骨髓微环境细胞群

Christina M. Kaszuba; Benjamin J. Rodems; Sonali Sharma; Edgardo I. Franco; John M. Ashton; Laura M. Calvi; Jeevisha Bajaj

doi:10.3791/66093

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方法文章

识别骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病中的骨髓微环境细胞群

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DOI：

10.3791/66093

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2023年11月10日

Christina M. Kaszuba¹^,² , Benjamin J. Rodems¹^,³ , Sonali Sharma¹^,³ , Edgardo I. Franco¹^,² , John M. Ashton¹^,³^,⁴ , Laura M. Calvi¹^,⁵ , Jeevisha Bajaj¹^,³

¹Wilmot Cancer Institute, University of Rochester Medical Center, ²Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, ³Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center, ⁴Genomics Research Center, University of Rochester Medical Center, ⁵Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, University of Rochester Medical Center

本文内容

摘要

本文提供了一种详细的实验方案，用于从小鼠模型中分离和表征骨髓增生异常综合征及急性髓系白血病的骨髓微环境细胞群体。该技术可识别疾病进展过程中非造血性骨髓微环境（包括内皮细胞和间充质基质细胞）的变化。

摘要

骨髓微环境由多种不同的细胞群体组成，例如间充质基质细胞、内皮细胞、成骨细胞系细胞和成纤维细胞，这些细胞为造血干细胞（HSCs）提供支持。除了支持正常的造血干细胞外，骨髓微环境还在造血干细胞相关疾病（如骨髓增生异常综合征（MDS）和急性髓系白血病（AML））的发生发展中发挥重要作用。HSCs中与MDS相关的突变会导致分化受阻以及进行性骨髓衰竭，尤其在老年人群中更为显著。MDS常可进展为治疗抵抗性的AML，后者是一种以未成熟髓系原始细胞快速积聚为特征的疾病。已知患有这些髓系肿瘤的患者的骨髓微环境会发生改变。本文介绍了一种从骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病的小鼠模型中分离并进行表型鉴定骨髓微环境细胞的全面实验方案。对骨髓微环境细胞群体的变化进行分离和表征，有助于明确其在疾病起始和进展中的作用，并可能推动针对骨髓基质细胞中促癌性改变的新型治疗策略的开发。

引言

骨髓微环境由造血细胞、非造血性基质细胞以及细胞外基质组成¹^,²。该微环境可促进造血干细胞的自我更新，调控谱系分化，并为骨组织提供结构和机械支持¹^,²^,³^,⁴^,⁵。基质细胞微环境包括成骨谱系细胞、成纤维细胞、神经细胞和内皮细胞⁶，而造血微环境则由淋巴系和髓系细胞群体构成¹^,²^,³。除了支持正常的造血干细胞外，骨髓微环境还在造血干细胞相关疾病（如骨髓增生异常综合征（MDS）和急性髓系白血病（AML））的发生发展中发挥重要作用⁷^,⁸^,⁹^,

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方案

所有动物实验均按照罗切斯特大学动物资源委员会批准的方案进行。小鼠在罗切斯特大学的动物饲养设施中繁殖和维持。为建立高危骨髓增生异常综合征（MDS）模型，采用 commercially available NHD13 小鼠模型¹⁹。在此模型中，在疾病发生前的8周龄雌性NHD13小鼠中分析骨髓基质细胞。从头发生的急性髓系白血病（AML）按先前所述方法建立⁶^,¹¹^,²⁰。用于诱导AML的癌基因（如MLL-AF9和NRas）被标记GFP或YFP，从而可通过流式细胞术分析非白血病性的GFP阴性骨髓细胞群。简言之，将10周龄雌性C57BL/6J小鼠移植入表达GFP/YFP的小鼠AML细胞，并在移植后2周采集骨髓。尽管本研究出于示范目的使用雌性小鼠，该方案同样适用于雄性或雌性小鼠。也可使用单侧股骨或全部长骨进行操作。

1. 骨髓采集

注意：有关动物解剖方案的详细信息，请参见 Amend 等人²⁶。

用70%乙醇清洗研钵和研杵，再用预冷的FACS缓冲液（表1

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结果

本文介绍了一种基于流式细胞术的方法，用于分析骨髓增生异常综合征（MDS）和白血病小鼠模型中骨髓微环境细胞群，例如内皮细胞和间充质基质细胞图1). 图2 展示了目标细胞群的设门策略，首先通过前向散射和侧向散射特征，在消化后并去除CD45/Ter119阳性细胞的组分中选择细胞（P1）。图中显示了白血病样本中P1细胞的示例设门结果图2A). 选择单细胞而排除双联体进行此分析，P2（图2B). 图 2C 显示门控以选择碘化丙啶阴性活细胞，P3。为聚焦于非造血基质细胞群体，选择 CD45-/Ter119- 的细胞，P4（APC，Y轴）与. 选择 SSC-A（图 2D）。此初始设门策略适用于所有待分析样本。

小鼠白血病模.......

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讨论

小鼠白血病模型已被广泛用于鉴定促进侵袭性髓系白血病进展的细胞内在信号和微环境驱动信号⁶^,¹⁹^,²¹。本文介绍了一种基于流式细胞术的综合性实验方案，用于定义骨髓增生异常综合征（MDS）和急性髓系白血病（AML）小鼠模型中骨髓微环境的细胞组成。

在获取实验样本的流式细胞术数据之前，必须仔细校正荧光信号重叠。同时，必须包含所有适当的染色和设门对照。这些步骤可使实验人员确认抗体阳性或阴性染色真实反映了目标细胞标志物的表达情况，而非荧光光谱重叠或自发荧光所致的人为假象。尽管本方案仅描述了部分选定的细胞表面标志物，但可根据实验需求扩展抗体组合。例如，可加入CD144（Ve-Cadherin）体内在收获小鼠之前即可作为内皮细胞的另一个特异性标志物⁵^,²⁹尽管此处指示的荧光染.......

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致谢

我们感谢罗切斯特大学医学中心流式细胞术核心实验室的支持。本研究由美国血液学会学者奖、白血病研究基金会奖以及授予 J.B. 的美国国立卫生研究院资助项目 R01DK133131 和 R01CA266617 资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 移液器吸头	Genesee Scientific	24-165RL
1.7 mL 微量离心管	AVANT	L211511-CS
10 µL型移液器吸头	Genesee Scientific	24-140RL
10 mL 单独包装无菌血清移液管	Globe Scientific	1760
1000 mL 真空过滤瓶	NEST	344021
15 mL 离心管	VWR	10026-076
2 mL 吸液移液管	NEST	325011
200 µL型移液器吸头	Genesee Scientific	24-150-RL
25 mL 单独包装无菌血清移液管	Globe Scientific	1780
5 mL 单独包装无菌刻度吸管	Globe Scientific	1740
5 mL 聚苯乙烯圆底管 12 x 75 mm 规格	Falcon	352054
5 mL 聚苯乙烯圆底试管，带细胞滤网帽，12 x 75 mm 型号	Falcon	352235
50 mL 离心管	NEST	602052
6孔，平底，低蒸发盖	Falcon	353046
带防水防潮层的吸水垫	VWR	56616-031
APC 微珠	Miltenyi	130-090-855
autoMACS Pro 分离仪	Miltenyi Biotec GmBH	4425745
BD Pharmingen 纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32（小鼠 BD Fc 封闭抗体）	BD 生物科学	553141	0.5 mg/mL
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7906	66.000 g/mol
Brilliant Violet 421 抗小鼠 Ly-6A/E (Sca-1) 抗体 (D7)	Invitrogen	404-5981	0.2 mg/mL
C57BL/6J 小鼠	杰克逊实验室	664
二氧化碳气体钢瓶	Airgas	CD50
CD31（PECAM-1）单克隆抗体（390），PE-Cyanine7	Invitrogen	25-0311-82	0.2 mg/mL
CD45单克隆抗体（30-F11），APC	Invitrogen	17-0451-82	0.2 mg/mL
细胞滤网 70 µm 尼龙	Falcon	352350
Cole-Parmer Essentials 玛瑙研钵和研杵；125 mL	Cole-Parmer	EW-63100-62
胶原酶来自 Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C5138-500MG
I型胶原酶	STEMCELL	7415
康宁迷你离心机	CORNING	6770
康宁 Stripettor Ultra 移液控制器	康宁	4099
牛胰脱氧核糖核酸酶 I	Sigma-Aldrich	D4513
Dispase II，粉末	Gibco	117105041
DPBS 10x	gibco	14200-075
eBioscience 1x 红细胞裂解缓冲液	Invitrogen	00-4333-57
无水乙醇，KOPTEC，符合英国药典（BP）、欧洲药典（Ph. Eur.）、美国药典（USP）分析规格（200 Proof）	VWR	89125-174
精细剪刀 - 锋利	Fine Science Tools	14061-10
Foundation B 胎牛血清	GeminiBio	900-208
Gilson PIPETMAN L 移液器入门套装	FisherScientific	F167370G
格劳费镊子	Fine Science Tools	11051-10
Hank's 平衡盐溶液 (HBSS) 10x	gibco	14185-052
血细胞计数板	Fisher	02-671-10
培养箱	BINDER	C150-UL
Kimwipes	KIMTECH	K222101
LABGARD II级A2型生物安全柜	Nuaire	NU-425-400
LD 柱	Miltenyi Biotec GmBH	130-042-901
LSE 漩涡混合器	CORNING	6775
LSRII/Fortessa/Symphony A1	Becton, Dickinson and Company	647800L6
MACS 多功能支架	Miltenyi Biotec GmBH	130-042-303
MACsmix 管式旋转仪	Miltenyi Biotec GmBH	130-090-753
mIgG	Millipore-Sigma	18765-10mg	2 mg/mL
Nup98-HoxD13 (NHD13) 小鼠	杰克逊实验室	010505
PE 抗小鼠 CD51 抗体（RMV-7）	Biolegend	104106	0.2 mg/mL
PE/Cy5 抗小鼠 CD140a 抗体（仅供研究使用）	Biolegend	135920	0.2 mg/mL
青霉素-链霉素	Gibco	15140122	10,000 U/mL
Plastipak 3 mL 注射器	Becton, Dickinson and Company	309657
碘化丙啶 - 1.0 mg/mL 水溶液	赛默飞世尔科技	P3566
QuadroMACS 分离器	Miltenyi Biotec GmBH	130-090-976
Sorvall X Pro / ST Plus 系列离心机	赛默飞世尔科技	75009521
TER-119 单克隆抗体（TER-119），APC	Invitrogen	17-5921-82	0.2 mg/mL
0.4% 台盼蓝溶液	Gibco	15-250-061
超纯 0.5 M EDTA，pH 8.0	Invitrogen	15575-038

参考文献

Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
Boulais, P. E., Frenette, P. S. Making sense of hematopoietic stem cell niches. Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).
Pinho, S., Frenette, P. S.

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