识别骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病中的骨髓微环境细胞群

摘要

本文提供了一种详细的实验方案，用于从小鼠模型中分离和表征骨髓增生异常综合征及急性髓系白血病的骨髓微环境细胞群体。该技术可识别疾病进展过程中非造血性骨髓微环境（包括内皮细胞和间充质基质细胞）的变化。

摘要

骨髓微环境由多种不同的细胞群体组成，例如间充质基质细胞、内皮细胞、成骨细胞系细胞和成纤维细胞，这些细胞为造血干细胞（HSCs）提供支持。除了支持正常的造血干细胞外，骨髓微环境还在造血干细胞相关疾病（如骨髓增生异常综合征（MDS）和急性髓系白血病（AML））的发生发展中发挥重要作用。HSCs中与MDS相关的突变会导致分化受阻以及进行性骨髓衰竭，尤其在老年人群中更为显著。MDS常可进展为治疗抵抗性的AML，后者是一种以未成熟髓系原始细胞快速积聚为特征的疾病。已知患有这些髓系肿瘤的患者的骨髓微环境会发生改变。本文介绍了一种从骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病的小鼠模型中分离并进行表型鉴定骨髓微环境细胞的全面实验方案。对骨髓微环境细胞群体的变化进行分离和表征，有助于明确其在疾病起始和进展中的作用，并可能推动针对骨髓基质细胞中促癌性改变的新型治疗策略的开发。

引言

骨髓微环境由造血细胞、非造血性基质细胞以及细胞外基质组成^1,2。该微环境可促进造血干细胞的自我更新，调控谱系分化，并为骨组织提供结构和机械支持^1,2,3,4,5。基质细胞微环境包括成骨谱系细胞、成纤维细胞、神经细胞和内皮细胞⁶，而造血微环境则由淋巴系和髓系细胞群体构成^1,2,3。除了支持正常的造血干细胞外，骨髓微环境还在造血干细胞相关疾病（如骨髓增生异常综合征（MDS）和急性髓系白血病（AML））的发生发展中发挥重要作用^7,8,9,10,11。研究表明，成骨谱系细胞中的突变可促进MDS、AML及其他骨髓增殖性肿瘤的发生发展^10,12,13,14。

骨髓增生异常综合征是一组源于造血干细胞突变的白血病前期疾病。MDS 常伴随造血干细胞分化受阻以及发育异常细胞的产生，这往往可导致骨髓衰竭。MDS 是美国最常诊断的髓系肿瘤，其3年生存率约为35%–45%¹⁵。MDS 通常伴有向急性髓系白血病（AML）转化的高风险。这种并发症可能是致命的，因为由 MDS 衍生的 AML 对大多数治疗具有耐药性且容易复发。由于造血干细胞和祖细胞中的染色体易位或突变而从头发生的 AML 同样常对标准化疗耐药^16,17。由于 MDS 和 AML 主要发生于老年人群，大多数患者诊断时年龄超过60岁，因此多数患者不适合接受根治性骨髓移植。因此，迫切需要鉴定疾病进展过程中的新型调控因子。由于骨髓微环境可为恶性细胞提供支持¹⁴，明确疾病进展过程中骨髓微环境的变化可能有助于发现以抑制肿瘤微环境重塑为靶向的新型治疗策略。因此，迫切需要识别并表征骨髓基质细胞群体在疾病进展中的变化，这些基质细胞可能为恶性细胞提供支持。

已建立多种小鼠急性髓系白血病（AML）和骨髓增生异常综合征（MDS）模型，可用于研究疾病发生和进展过程中骨髓微环境的变化^{6,1,19,20,21,22}。本文描述了利用逆转录病毒诱导的AML小鼠模型^6,20，以及 commercially available Nup98-HoxD13（NHD13）高危MDS向AML转化模型¹⁹，来鉴定骨髓基质细胞群体变化的实验方案。移植了de novo AML细胞的小鼠通常在20–30天内死于该疾病⁶。NHD13小鼠在约15–20周时出现血细胞减少和骨髓发育异常，最终转化为AML，近75%的小鼠在约32周时死于该病。为分析小鼠模型中骨髓微环境的细胞群体，需取材骨骼，通过酶消化法处理骨髓和骨小梁，随后利用磁珠分选富集CD45-/Ter119-非造血细胞群体。尽管此前已有类似分析方法的报道^{11,13,22,23,24,25}，但这些方法通常仅关注骨髓或骨组织，未将来自两种来源的细胞同时纳入分析。结合这些细胞群体的表征与基因表达分析，可全面理解细胞造血微环境在疾病起始和进展过程中所起的支持作用（图1）。尽管下述方案主要聚焦于逆转录病毒诱导的AML模型和遗传性MDS模型，但这些策略可轻松适用于研究任何感兴趣的小鼠模型中骨髓微环境的变化。

方案

所有动物实验均按照罗切斯特大学动物资源委员会批准的方案进行。小鼠在罗切斯特大学的动物饲养设施中繁殖和维持。为建立高危骨髓增生异常综合征（MDS）模型，采用 commercially available NHD13 小鼠模型¹⁹。在此模型中，在疾病发生前的8周龄雌性NHD13小鼠中分析骨髓基质细胞。从头发生的急性髓系白血病（AML）按先前所述方法建立^6,11,20。用于诱导AML的癌基因（如MLL-AF9和NRas）被标记GFP或YFP，从而可通过流式细胞术分析非白血病性的GFP阴性骨髓细胞群。简言之，将10周龄雌性C57BL/6J小鼠移植入表达GFP/YFP的小鼠AML细胞，并在移植后2周采集骨髓。尽管本研究出于示范目的使用雌性小鼠，该方案同样适用于雄性或雌性小鼠。也可使用单侧股骨或全部长骨进行操作。

1. 骨髓采集

注意：有关动物解剖方案的详细信息，请参见 Amend 等人²⁶。

1. 用70%乙醇清洗研钵和研杵，再用预冷的FACS缓冲液（表1）冲洗，并将其置于冰上冷却，以备开始收获前使用。同时，将MACs缓冲液（表1）放置于实验台，使其升至室温。
2. 根据机构动物护理与使用指南及规程实施动物安乐死。
3. 在实验台上，用70%乙醇彻底喷洒小鼠，直至其毛发湿润。使用镊子和弯头剪刀，提起腹部皮肤，在腹部两侧各做一条长约0.5 mm的切口，位置位于腹部外侧。接着，在远离腹部的一端再做一条0.5 mm的切口。向下拉扯，去除小鼠腿部的皮肤和毛发。
4. 将剪刀垂直于骨盆，用镊子向上拉股骨的同时向下按压。股骨头应从骨盆脱离。在髌股关节处分离股骨和胫骨。将骨骼置于盛有FACS缓冲液的6孔板中，并置于冰上。
5. 使用实验室级组织处理工具去除骨骼上的组织，并将清理后的骨骼转移至另一盛有新鲜FACS缓冲液的6孔板中，置于冰上。
6. 将所有骨骼放入研钵中，加入2–5 mL FACS缓冲液，确保所有骨骼完全浸没于缓冲液中（根据处理的骨骼数量调整缓冲液体积）。用研杵以环形运动方式研磨和捣碎骨骼，直至骨髓组织完全释放。
7. 使用3 mL注射器，通过反复吸取和冲入液体的方式，在研钵中均质化骨髓悬液。
8. 使用3 mL注射器从研钵中吸取液体，经70 µm细胞滤网过滤至置于冰上的50 mL离心管中。用FACS缓冲液将滤网上残留的骨组织碎片冲洗回研钵中，并返回步骤1.7，再次进行均质化和过滤。此部分即为骨髓组分。
9. 用FACS缓冲液将研钵中剩余的骨碎片（骨小梁）冲洗回研钵，再用FACS缓冲液将其冲入15 mL离心管中，以确保获得最大细胞得率。此部分即为骨小梁组分。

2. 骨髓消化

1. 在 4 °C 条件下，以 300 x g 离心骨髓 5 分钟。倾去并弃除上清液。
2. 用 2 mL 骨髓消化液混合物（表 1）重悬骨髓，并转移至 15 mL 离心管中。在旋转仪上 37 °C 孵育 45 分钟。
3. 加入 10 mL FACS 缓冲液以终止酶消化反应。将混合物经 70 µm 细胞滤网过滤至新的 50 mL 离心管中。
4. 在 4 °C 条件下，以 400 x g 离心 7 分钟，收集沉淀。
5. 用 1 mL 红细胞裂解缓冲液（见材料表）重悬骨髓沉淀。冰上孵育 4 分钟。
6. 加入 10 mL FACS 缓冲液以终止裂解反应。将混合物经 70 µm 细胞滤网过滤至新的 50 mL 离心管中。
7. 在 4 °C 条件下，以 300 x g 离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 100 µL FACS 缓冲液中。

3. 骨针的消化

1. 涡旋步骤1.9中得到的骨小梁，静置使其沉淀。弃去上清液，保留底部的骨组织。
2. 将骨小梁重悬于1 mL骨小梁消化液混合物中（表1）。
3. 将试管置于旋转仪上，37 °C孵育60分钟。
4. 加入10 mL FACS缓冲液以终止酶消化反应。将混合物经70 µm细胞滤网过滤，收集至含有已裂解红细胞并已完成消化的骨髓的50 mL试管中。

4. 染色

1. 轻轻混匀骨小梁和骨髓细胞悬液。
2. 取 10 µL 细胞悬液，使用 0.4% 台盼蓝染色法在血细胞计数板上计数活细胞数量，操作步骤参照已发表的实验方案²⁷。从细胞悬液中收集 50,000 个细胞作为未染色对照。
3. 将剩余细胞在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，用 100 µL FACS 缓冲液重悬细胞。
   注意：可对抗体进行滴定以确定最佳稀释比例。抗体的选择（表位和荧光染料）可根据需要定制。
4. 进行磁性去除抗体染色时，加入 FC Block（每 25 × 10⁶ 个细胞加 1 µL）、CD45-APC（每 25 × 10⁶ 个细胞加 10 µL）和 Ter119-APC（每 25 × 10⁶ 个细胞加 4 µL）（参见 材料表）。
5. 冰上孵育 20 分钟。用 FACS 缓冲液洗涤，取出约 50 µL（含 50,000 个细胞）作为 APC 染色对照，于 4 °C 以 300 × g 离心 5 分钟，再用 100 µL FACS 缓冲液重悬。
6. 对细胞悬液进行磁性去除用微珠染色时，加入 mIgG（每 25 × 10⁶ 个细胞加 8 µL）和 Anti-APC 微珠（每 25 × 10⁶ 个细胞加 20 µL）（参见 材料表）。
7. 冰上孵育 20 分钟。用 10 mL FACS 缓冲液洗涤，于 4 °C 以 300 × g 离心 5 分钟。

5. 通过磁性分选去除样本

注意：此步骤使用市售的手动磁力架，按照制造商说明书进行操作。此步骤也可使用自动磁力架完成（参见材料表）。

1. 用 2 mL MACs 缓冲液（表 1）洗涤 LD 柱，弃去流出液，并更换收集管。
2. 将最多 1 × 10⁸ 个细胞重悬于 MACs 缓冲液中，并通过带有 35 µm 细胞筛帽的 5 mL 试管过滤。
3. 将 LD 柱置于磁力分离架上，在柱下方放置一个 5 mL 试管以收集流出液。
4. 将细胞悬液加入已准备好的 LD 柱中。让阴性组分流过并进入收集管。用 1 mL MACs 缓冲液洗涤柱子两次，将洗脱液收集至同一试管中。此即为下文步骤 5.6 中所用的阴性组分。
5. 从磁力分离架上取下 LD 柱，将其置于一个新的 5 mL 试管上。使用移液器将 3 mL 缓冲液加入柱中，并用柱塞冲洗出阳性标记的细胞。
6. 将阴性和阳性组分在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。用 100 µL FACS 缓冲液重悬细胞。
7. 用 0.4% 台盼蓝对阴性和阳性组分各取 10 µL 进行细胞计数。后续骨分析/内皮细胞 panel 染色所用体积将基于此细胞计数结果。
8. 从阳性组分中取 50,000 个活细胞用于流式细胞术设门对照。

6. 骨分析/内皮细胞面板染色

注意：补偿步骤应遵循标准的流式细胞术操作规程，包括所有适当的染色和设门对照。

1. 对于CD45/Ter119阴性细胞群的染色（每1 × 10⁶个细胞各加1 µL抗体），加入CD31-PE-Cy7、Sca-1-BV421、CD51-PE和CD140a-PE-Cy5（见材料表）。
2. 冰上孵育20分钟。加入2 mL FACS缓冲液洗涤，然后在4 °C下以300 × g离心5分钟。
3. 加入1 mL FACS缓冲液和1:1000稀释的碘化丙啶（PI）进行活/死细胞染色，随后将样品经装有35 µm细胞滤网帽的5 mL试管过滤。
4. 使用多色流式细胞仪分析细胞。

结果

本文介绍了一种基于流式细胞术的方法，用于分析骨髓增生异常综合征（MDS）和白血病小鼠模型中的骨髓微环境细胞群体，例如内皮细胞和间充质基质细胞。图1). 图2 展示了目标细胞群的设门策略，首先通过前向散射和侧向散射特征，在消化后且经CD45/Ter119耗竭的组分中选择细胞（P1）。图中显示了白血病样本中P1细胞的示例设门结果图 2A）。选择单细胞群并从此分析中排除双细胞群，P2（图2B). 图2C 显示门控以选择碘化丙啶阴性活细胞，P3。为聚焦于非造血基质细胞群体，选择 CD45-/Ter119- 的细胞，P4（APC，Y轴） 与. 选择SSC-A（图 2D此初步设门策略适用于所有待分析样本。

白血病小鼠模型用...

讨论

小鼠白血病模型已被广泛用于鉴定促进侵袭性髓系白血病进展的细胞内在信号和微环境驱动信号^6,19,21。本文介绍了一种基于流式细胞术的综合性实验方案，用于定义骨髓增生异常综合征（MDS）和急性髓系白血病（AML）小鼠模型中骨髓微环境的细胞组成。

在获取实验样本的流式细胞术数据之前，必须仔细校正荧光信号重叠。同时，必须包含所有适当的染色和设门对照。这些步骤可使实验人员确认抗体阳性或阴性染色真实反映了目标细胞标志物的表达情况，而非荧光光谱重叠或自发荧光所致的人为假象。尽管本方案仅描述了部分选定的细胞表面标志物，但可根据实验需求扩展抗体组合。例如，可加入CD144（Ve-Cadherin） 体内 在收获小鼠之前即可作为内皮细胞的另一个特异性标志物^5,29尽管此处指示的荧光染...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 移液器吸头	Genesee Scientific	24-165RL
1.7 mL 微量离心管	AVANT	L211511-CS
10 µL型移液器吸头	Genesee Scientific	24-140RL
10 mL 单独包装无菌血清移液管	Globe Scientific	1760
1000 mL 真空过滤瓶	NEST	344021
15 mL 离心管	VWR	10026-076
2 mL 吸液移液管	NEST	325011
200 µL型移液器吸头	Genesee Scientific	24-150-RL
25 mL 单独包装无菌血清移液管	Globe Scientific	1780
5 mL 单独包装无菌刻度吸管	Globe Scientific	1740
5 mL 聚苯乙烯圆底管  12 x 75 mm 规格	Falcon	352054
5 mL 聚苯乙烯圆底试管，带细胞滤网帽，12 x 75 mm 型号	Falcon	352235
50 mL 离心管	NEST	602052
6孔，平底，低蒸发盖	Falcon	353046
带防水防潮层的吸水垫	VWR	56616-031
APC 微珠	Miltenyi	130-090-855
autoMACS Pro 分离仪	Miltenyi Biotec GmBH	4425745
BD Pharmingen 纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32（小鼠 BD Fc 封闭抗体）	BD 生物科学	553141	0.5 mg/mL
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7906	66.000 g/mol
Brilliant Violet 421 抗小鼠 Ly-6A/E (Sca-1) 抗体 (D7)	Invitrogen	404-5981	0.2 mg/mL
C57BL/6J 小鼠	杰克逊实验室	664
二氧化碳气体钢瓶	Airgas	CD50
CD31（PECAM-1）单克隆抗体（390），PE-Cyanine7	Invitrogen	25-0311-82	0.2 mg/mL
CD45单克隆抗体（30-F11），APC	Invitrogen	17-0451-82	0.2 mg/mL
细胞滤网 70 µm 尼龙	Falcon	352350
Cole-Parmer Essentials 玛瑙研钵和研杵；125 mL	Cole-Parmer	EW-63100-62
胶原酶来自 Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C5138-500MG
I型胶原酶	STEMCELL	7415
康宁迷你离心机	CORNING	6770
康宁 Stripettor Ultra 移液控制器	康宁	4099
牛胰脱氧核糖核酸酶 I	Sigma-Aldrich	D4513
Dispase II，粉末	Gibco	117105041
DPBS 10x	gibco	14200-075
eBioscience 1x 红细胞裂解缓冲液	Invitrogen	00-4333-57
无水乙醇，KOPTEC，符合英国药典（BP）、欧洲药典（Ph. Eur.）、美国药典（USP）分析规格（200 Proof）	VWR	89125-174
精细剪刀 - 锋利	Fine Science Tools	14061-10
Foundation B 胎牛血清	GeminiBio	900-208
Gilson PIPETMAN L 移液器入门套装	FisherScientific	F167370G
格劳费镊子	Fine Science Tools	11051-10
Hank's 平衡盐溶液 (HBSS) 10x	gibco	14185-052
血细胞计数板	Fisher	02-671-10
培养箱	BINDER	C150-UL
Kimwipes	KIMTECH	K222101
LABGARD II级A2型生物安全柜	Nuaire	NU-425-400
LD 柱	Miltenyi Biotec GmBH	130-042-901
LSE 漩涡混合器	CORNING	6775
LSRII/Fortessa/Symphony A1	Becton, Dickinson and Company	647800L6
MACS 多功能支架	Miltenyi Biotec GmBH	130-042-303
MACsmix 管式旋转仪	Miltenyi Biotec GmBH	130-090-753
mIgG	Millipore-Sigma	18765-10mg	2 mg/mL
Nup98-HoxD13 (NHD13) 小鼠	杰克逊实验室	010505
PE 抗小鼠 CD51 抗体（RMV-7）	Biolegend	104106	0.2 mg/mL
PE/Cy5 抗小鼠 CD140a 抗体（仅供研究使用）	Biolegend	135920	0.2 mg/mL
青霉素-链霉素	Gibco	15140122	10,000 U/mL
Plastipak 3 mL 注射器	Becton, Dickinson and Company	309657
碘化丙啶 - 1.0 mg/mL 水溶液	赛默飞世尔科技	P3566
QuadroMACS  分离器	Miltenyi Biotec GmBH	130-090-976
Sorvall X Pro / ST Plus 系列离心机	赛默飞世尔科技	75009521
TER-119 单克隆抗体（TER-119），APC	Invitrogen	17-5921-82	0.2 mg/mL
0.4% 台盼蓝溶液	Gibco	15-250-061
超纯 0.5 M EDTA，pH 8.0	Invitrogen	15575-038