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建立和表征源自良性胃体与胃窦上皮活检组织的患者来源胃类器官

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DOI：

10.3791/66094

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2024年1月26日

 ,  ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology and Hepatology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 2Department of Surgery, Columbia University Irving Medical Center

本文内容

摘要

胃源性患者类器官在研究中的应用日益广泛，但目前尚缺乏从单细胞消化物出发、以标准化接种密度培养人胃类器官的正式方案。本方案提供了一种详细方法，可从上消化道内镜活检组织中稳定地构建胃类器官。

摘要

胃源性患者来源类器官（PDOs）为研究胃生物学和病理学提供了独特的工具，因此这些PDOs在多种研究应用中得到日益广泛的应用。然而，目前尚缺乏从单细胞消化物中制备胃类器官并保持标准化初始细胞接种密度的已发表方法。本方案重点介绍从分离的单个细胞启动胃类器官的建立过程，并提供通过碎片化方式进行类器官传代的技术方法。重要的是，该方案证明，采用标准化的初始细胞接种密度能够稳定地从良性活检组织中获得胃类器官，并实现对类器官生长的标准化定量分析。最后，研究证据支持一项新的发现：胃PDOs的形成速率和生长速度存在差异，具体取决于类器官来源于胃体部还是胃窦部的活检组织。具体而言，与来源于胃体部活检组织的类器官相比，使用胃窦部活检组织启动类器官可在一个20天的观察期内形成更多的类器官，并表现出更快的生长速度。本文所述的方案为研究人员提供了一种及时且可重复的方法，用于成功建立和操作胃源性PDOs。

引言

类器官是微小的三维（3D）细胞结构，其形态和功能类似于来源器官1,2。这些在实验室中培养的模型通过在受控环境中培养干细胞或组织特异性细胞，使细胞能够自我组织并分化为多种细胞类型而获得1,2,3。类器官的一个关键优势在于，与传统的二维（2D）细胞培养相比，它们能更真实地模拟人类生物学特性1,2,3。特别是，人类类器官已被证明能够保留其来源组织的遗传多样性3,4,5。类器官为研究人类器官发育、建立疾病模型以及在受控的实验室环境中测试潜在治疗方法提供了独特的机会。此外，类器官可来源于个体患者的样本，从而支持个性化医疗策略以及个体化治疗方案的潜在开发3,6,7。

研究人员已利用人胃类器官研究胃生物学和病理学的多个方面。其中显著的例子包括利用患者来源的类器官（PDOs）预测胃癌对化疗的反应8,9,10 并建模上皮对 幽门螺杆菌 感染11,12,13人类胃类器官包含胃中发现的多种细胞类型，包括颈细胞、 pit细胞及其他支持细胞11,14胃类器官可由诱导性多能干细胞（iPSCs）或直接从获取的胃组织中分离的干细胞生成 通过 活检样本或胃切除标本11,14从胃组织中分离胃干细胞通常通过分离并培养胃腺，或通过酶消化组织样本以获得单个细胞来实现。9,13,15重要的是，采用这两种技术生成的胃类器官中细胞的分化特征已被证明是相似的13本方案重点介绍单细胞消化方法。

类器官代表了一项科学创新，弥合了传统细胞培养与完整器官之间的差距。随着该领域研究的不断推进，类器官有望为多种应用开发出更有效的治疗手段和疗法。鉴于胃类器官（gastric PDOs）的应用日益增多，建立其标准化生成方法的需求愈发迫切。本文描述了从上消化道内镜检查中获取的良性胃活检组织分离的单个细胞来生成人胃类器官（gastric PDOs）的实验方案。重要且独特之处在于，通过确定标准化数量的单细胞进行接种，可稳定地生成胃类器官，并便于后续的表征分析。利用该技术，可明确展示从胃体或胃窦活检组织所生成的类器官在形成和生长方面的稳定差异。

方案

本方案中使用的所有人体组织均来自通过宾夕法尼亚大学机构审查委员会（IRB #842961）批准的胃组织采集研究项目并签署知情同意书的个体。参与本研究的受试者需因常规诊疗需要接受上消化道内镜检查，年龄至少18岁，并能够提供知情同意。所有研究工作均遵循宾夕法尼亚大学制定的指导方针。

1. 实验准备

  1. 按先前所述方法制备条件培养基L-WRN16。尽管非必需，但可使用市售ELISA试剂盒按照制造商说明检测条件培养基中Wnt-3A、R-spondin和noggin的浓度（参见材料表）。
  2. 配制含抗生素的RPMI培养基（RPMI-ABX）、含抗生素的PBS（PBS-ABX）、含二硫苏糖醇的PBS（PBS-DTT）、消化缓冲液以及胃类器官培养基（具体成分见补充表1）。胃类器官培养基在4 °C下可稳定保存1周。
  3. 对镊子、精细解剖剪刀和1.5 mL离心管进行高压灭菌处理。
  4. 将基底膜基质（Matrigel）置于冰上开始解冻。
  5. 将消化缓冲液和胰蛋白酶-EDTA置于37 °C水浴中开始解冻。
  6. 将培养箱内的轨道摇床预设为37 °C、200 rpm。

2. 从活检组织中分离单个细胞

  1. 根据机构临床方案，在上消化道内镜检查期间采集胃黏膜活检组织17，通常使用大型活检钳。使用钝头针从活检钳中取出组织样本，并将其置于含有 RPMI-ABX 培养基的 15 mL 锥形管中。将管子置于冰上，以便迅速转移至实验室。
    注意：至少应采集 2–4 块活检组织。
  2. 让活检组织在锥形管底部自然沉降。使用移液器吸除上清液，并用 1 mL PBS-ABX 缓冲液清洗活检组织两次。无需离心，因为组织碎片会在锥形管中自然沉降。
  3. 将至少 20 mg 的活检组织转移至含有 1 mL PBS-DTT 的 1.5 mL 管中。
  4. 使用精细解剖剪将组织剪切成 1–2 mm 或更小的碎片。
  5. 使用台式微型离心机离心 15 秒，使组织碎片聚集于管底，尽可能吸除上清液。允许残留少量 PBS-DTT。
  6. 向 50 mL 锥形管中加入 5 mL 新鲜预热的消化缓冲液。为避免转移过程中损失组织，取 500 µL 消化缓冲液加入含有组织的 1.5 mL 管中。随后，用剪刀修剪 1000 µL 移液器吸头的尖端以增大其直径，便于轻松吸取并转移组织碎片至含有消化缓冲液的 50 mL 锥形管中。
  7. 将消化缓冲液与组织混合物在 37 °C、200 rpm 振荡条件下孵育 30 分钟。
  8. 向消化缓冲液中加入 5 mL 预热的含 0.25% EDTA 的胰蛋白酶，继续在 37 °C、200 rpm 振荡条件下孵育 10 分钟。
  9. 通过加入等体积的高级（Adv.）DMEM/F12 培养基中和消化缓冲液和胰蛋白酶，并将溶液通过 70 µm 细胞滤筛过滤。
  10. 在 4 °C 条件下，以 1400 × g 离心 4 分钟收集细胞。根据初始活检组织的大小，可能观察到或未观察到明显的细胞沉淀。
  11. 将细胞沉淀重悬于 1 mL Adv. DMEM/F12 培养基中，使用台盼蓝染色和血细胞计数板计数活细胞数量。
  12. 再次在 4 °C 条件下以 1400 × g 离心 4 分钟收集细胞，并弃去上清液。
    ​注意：图 1 展示了从活检组织中分离单细胞的流程示意图。

3. 将单细胞包埋于基底膜基质中 "穹顶"

  1. 根据计数的活细胞数量，计算所需基底膜基质的体积，以达到每 50 µL 基底膜基质中含有 105 个活细胞的终浓度。
  2. 为防止基底膜基质在接种前发生聚合，请迅速执行以下操作：将已解冻的基底膜基质从冰上取出，加入先前计算好的体积至细胞中，并通过上下吹打约 10 秒轻轻混匀。
    注意：此步骤中务必避免产生气泡。请勿稀释基底膜基质。
  3. 迅速将 50 µL 的基底膜基质/细胞混合物移入 24 孔组织培养板各孔的中央。
  4. 立即盖上 24 孔板，并以单一平稳动作将整块板翻转至倒置状态。将倒置的板放入 37 °C 组织培养孵育箱中孵育 35 分钟，使基底膜基质完成聚合。
    注意：翻转平板对于防止细胞沉降至孔底，并使基底膜基质聚合成三维 "dome" 结构至关重要。
  5. 向每孔中加入 500 µL 预热的胃类器官培养基，确保每个 "dome" 的顶部完全浸没于培养基中。沿每孔侧壁加入培养基，以避免扰动 "dome"。
  6. 每 2–3 天更换一次培养基。

4. 类器官的常规传代  通过 断裂

  1. 当类器官准备传代时，移除每个指定孔中的培养基。
    注意：关于传代的合适时机，请参见代表性结果部分。
  2. 将1 mL预冷的Adv. DMEM/F12培养基直接加入基底膜基质"dome"上。这将迅速促使"dome"解体。持续进行吸液和加液操作，直至所有"dome"碎片从培养板上脱离。
  3. 将培养基和破碎的基底膜基质转移至下一个孔中，并对所有需要传代的孔重复此过程。在拆解最后一个基底膜基质"dome"后，将培养基以及类器官与基底膜基质的混合物转移至1.5 mL离心管中。
  4. 将1000 µL吸头安装在P1000移液器上，然后将该吸头插入一个200 µL吸头内。这样可形成一个直径足够小的移液吸头，既能破碎类器官，又能吸取较大体积的液体。
  5. 用力上下吹打类器官与基底膜基质的混合物约25次，以将类器官破碎成小片段。
  6. 使用台式离心机在4 °C、2000 x g 条件下离心30秒，使破碎的类器官混合物沉淀。此步骤将使破碎的类器官形成沉淀，与基底膜基质和培养基分离。使用移液器吸除上清液（含培养基和基底膜基质），切勿使用真空泵吸除上清，因为沉淀较为松散。
  7. 计算所需新鲜解冻基底膜基质的体积，使孔数/dome数按1:2比例分配（每个dome 50 µL）。加入新鲜基底膜基质，并轻轻吹打混匀，注意避免产生气泡。
  8. 迅速将50 µL类器官片段与基底膜基质的混合物分装至24孔板的各个孔中。
  9. 盖好培养板，倒置放置，并置于37 °C细胞培养箱中孵育35分钟，以使基底膜基质聚合。
  10. 向每孔中加入500 µL预热的胃类器官培养基。
    注意：图2展示了通过机械破碎法传代胃来源患者类器官的示意图。

结果

以下代表性结果来自五名接受上消化道内镜检查患者的胃体和胃窦区域良性上皮组织活检样本。每名患者的胃体和胃窦活检样本分别接种并分析了2至4个“穹顶”/孔。所有五名患者的胃体和胃窦活检组织均成功生成了类器官。平均每个“穹顶”/孔分析了41个类器官。所有图像均使用共聚焦显微镜获取的z轴投影图像，类器官大小和球形度的定量分析采用 commercially available image analysis software（见材料表）进行。

类器官通常在单细胞接种后10天内可被识别（图3A）。至第20天，类器官体积已较大，通常需要进行传代。尽管单细胞接种后形成的类器官数量存在一定变异性，但来自胃体和胃窦活检组织的类器官形成数量的预期结果如图3B所示。胃体和胃窦类器官的数量在接种后第10天达到峰值。虽然差异不显著，但从第10天到第15天以及第15天到第20天，类器官总数开始呈下降趋势。似乎存在一小群在第10天形成的小型类器官，其在随后的10天内停止生长并逐渐死亡，这可以解释该趋势。重要的是，在第10、15和20天，胃窦活检组织形成的类器官数量显著高于胃体活检组织。胃窦类器官的平均数量比胃体类器官高出约2倍。

在图3C中，展示了单细胞接种后第10天至第20天类器官生长的代表性结果。尽管来自幽门和胃体活检组织的类器官在第10天至第20天期间均表现出稳定的生长趋势，但源自幽门活检组织的类器官相比源自胃体活检组织的类器官具有更高的生长速率。特别是在第20天时，幽门类器官的面积几乎是胃体类器官的4倍。

在不同患者中，任何单个“圆顶”/孔内的类器官形态通常表现出多样性（图4A）。一些类器官更接近圆形或球形，而另一些则呈现更不规则的形态。然而，平均而言，球形度——用于衡量类器官接近球形的程度（得分为1表示完美的球体）18——在来自胃体或幽门活检组织的类器官内部及之间均显示出较小的变异（图4B）。因此，尽管生长速率存在差异，但来自胃体或幽门活检组织的类器官之间通常不存在显著的形态学差异。

诱导培养至第20天时，胃类器官通常已准备好进行传代。类器官体积过大（直径≥1500 µm）或内部变暗（提示细胞更新过度）是需要传代的关键信号（图5A）。若超过此阶段继续培养，类器官可能开始退化为二维单层细胞（图5B），此类细胞在传代后无法稳定地重新形成类器官，可能表明其活力或干性已丧失。采用本文所述的碎片化方法对胃类器官进行传代和重新接种后，“穹顶”结构中将包含大量类器官碎片（图5C），这些碎片会自我重组，形成更多数量的类器官，并且生长速度显著快于初始接种的单细胞（图5D）。若在传代时仍需对类器官生长特性进行表征和/或标准化，可按照先前所述方法将胃类器官消化为单细胞19。

活检样本提取、细胞消化、三维穹顶式接种、类器官形成；类器官培养示意图。
图1：胃来源患者类器官的建立。 示意图概述了从良性胃上皮组织活检样本中建立胃来源患者类器官的流程。请点击此处查看该图的放大版本。

类器官培养方法；示意图；培养基分配、吹打、基质混合、滴加成滴培养。
图2：胃来源患者类器官的传代。 通过碎片化方式进行胃来源患者类器官传代的示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。

类器官生长比较；显微镜图像、生长曲线、统计分析；类器官面积、数量
图3胃癌患者来源类器官的形成与生长 (A代表性z轴投影图像，显示胃类器官在单细胞接种后第10、15和20天的生长情况。图像所示类器官来源于同一患者的胃体和胃窦活检组织。比例尺 = 1 mm。B) 单细胞接种后指定时间点胃体和胃窦类器官的平均数（±标准差）。C) 平均值（±标准差）面积（µm2) 胃体和胃窦类器官在单细胞接种后指定时间点的类器官形成效率。每组和每个时间点 n = 5 名患者。* = 差异具有统计学显著性（p ≤ 0.05）。n.s. = 在指定时间点无统计学显著差异。统计学比较采用 通过 双因素方差分析 请点击此处以查看此图的放大版本。

胃类器官发育阶段；比较胃体和胃窦区域的球形度分析图
图 4：胃源性患者类器官形态学特征。 （A）单细胞接种后第15天，来自个体“圆顶”/孔的胃体来源类器官不同形态的代表性z轴投影图像。比例尺 = 200 µm。（B）胃体与胃窦类器官球形度的平均值（±标准差）（数值为1时表示完美球形）。每组及每个时间点n = 5名患者。n.s. = 任意时间点均无统计学显著差异。统计学比较采用双因素方差分析（2-way ANOVA）进行。请点击此处查看该图的放大版本。

随时间变化的细胞培养生长比较；显微镜图像；显示单细胞接种及传代过程中的发育情况。
图5：胃癌患者来源类器官的传代培养。（A）单细胞接种后第20天，准备进行传代的类器官代表性图像。（B）单细胞接种后第25天，已超过传代时间的类器官代表性图像。（C）重新接种后（第1代 - 第0天）破碎的类器官代表性图像。（D）重新接种后5天内（第1代 - 第5天）类器官生长的代表性图像。所有图像均为z轴投影图像。比例尺 = 1 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

补充表1：溶液与培养基配方。 请点击此处下载该文件。

讨论

本文概述了一种从胃体和幽门良性上皮活检组织中分离的单细胞可靠生成人胃类器官的详细方案。该方案的关键步骤涉及时间控制以及对基底膜基质的处理。为保持细胞活性，获取活检组织后应尽快启动实验，目标是在活检后30分钟内开始消化组织。处理基底膜基质也可能具有挑战性：当其在冰上解冻时保持液态，但在温度高于4 °C时会聚合。因此，必须迅速将基底膜基质从冰上取出并与单细胞或类器官片段混合，以制备用于铺板的"穹顶状结构"，因为其在1分钟内即开始聚合。一旦基质在离心管中聚合，便无法再用移液枪头吸取。若发生此情况，可将离心管放回冰上，直至Matrigel重新解聚为液态。在轻柔吹打混匀单细胞或类器官片段与基底膜基质时，也必须避免产生气泡。虽然基底膜基质"穹顶"内的气泡似乎不影响类器官的形成与生长，但会阻碍观察。此外，将基底膜基质/细胞混合物分装至细胞培养板的孔中后，必须将培养板倒置并放入培养箱中。此步骤至关重要，可使基底膜基质聚合形成三维"穹顶"结构，并防止单细胞或类器官片段沉降至孔底。

采用本方案，胃类器官在单细胞接种后10天内即可被识别。经验表明，10天后新形成的胃类器官极少，事实上，类器官的总体数量在第10至20天期间可能略有下降。这一现象在来自胃体和胃窦的类器官中均存在。然而，由胃窦活检组织形成的类器官总数显著高于胃体活检组织。此外，在单细胞接种后的第10至20天期间，胃窦类器官的生长程度远超过胃体类器官。这种差异可能与Wnt信号敏感性的不同有关。最近一项研究表明，胃体PDO在较低Wnt激活条件下表现出更佳的生长，而胃窦PDO则在较高Wnt激活条件下生长更优20。目前文献中通常未明确说明用于生成胃PDO的胃活检组织具体来源部位。在今后利用来自胃不同区域活检组织所生成的胃PDO开展的研究中，应充分考虑此类差异。

该方案的另一个关键方面是确定每孔接种的单细胞标准化数量 "穹顶"/well，用于可靠地生成胃类器官（gastric PDOs）。尽管先前有研究报道了用于类器官生成的标准化胃腺数量，但此前采用单细胞消化法的研究均未提及接种的细胞数量，也未说明不同胃类器官系之间接种细胞数是否一致。若未对接种细胞数量进行标准化，可能导致每孔接种的干细胞数量存在高度变异 "穹顶"/孔。由于干细胞是胃类器官形成的主要来源，这可能导致类器官形成和生长速率的差异。因此，使用非标准化的单细胞数量可能会干扰对不同胃源性PDO细胞系之间形成或生长情况比较的解读。在此，本文证明了将接种细胞数量标准化为10个5 每细胞 "穹顶"/well 可从胃体和胃窦区域的活检组织中稳定地生成胃类器官（gastric PDOs）。

本方案已针对新鲜胃活检组织的使用进行了优化。因此，若使用冷冻组织或其他方式保存的组织，本方案的成功率可能会有所不同。此外，目前尚无关于新鲜活检组织在多长时间内能保持活性的数据，因为活检组织在从患者胃部取出后会尽快进行处理。通常认为，新鲜组织在处理前放置的时间越长，所能分离出的活细胞数量就越少。

胃类器官传代 通过 碎片化传代，如本方案所述，为常规传代提供了一种简便的方法。尽管胃类器官已通过此技术成功传代达4次，但尚未有研究尝试确定其在保持稳定生长和活力的前提下可传代的次数。一些文献报道指出，胃类器官在经过5次或更多次传代后，其生长速度可能会减缓。21,22而其他研究观察到稳定的生长可维持长达10代23.

本方案中使用的胃类器官培养基含有来自L-WRN细胞条件培养基的Wnt-3A、noggin和R-spondin。为制备该条件培养基，采用Miyoshi和Stappenbeck所描述的方案16。 alternatively，Wnt-3A、noggin和R-spondin也可作为重组蛋白单独购买。分别购买各组分有助于避免使用L-WRN细胞条件培养基时可能出现的批次间差异，是更理想的选择。然而，购买重组蛋白价格昂贵，对于频繁使用类器官的研究人员而言，成本可能过高。

鉴于胃类器官在各种应用中的使用日益增多，建立生成良性胃类器官的标准化方法显得及时且必要。本文所述方案为今后利用胃类器官的研究提供了一种可靠的方法。根据我们的经验，该方案在超过90%的情况下成功地从良性胃黏膜活检样本中生成了类器官。

披露

作者无相关披露信息。

致谢

宾夕法尼亚大学基因组医学培训项目 T32 HG009495（KHB），美国国家癌症研究所 R21 CA267949（BWK），男性 & Basser BRCA 研究中心 BRCA 项目（KHB，BWK），DeGregorio 家族基金会资助奖（BWK）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTAGibco25200-056
A83-01R&D Systems2939
Advanced DMEM/F12Gibco12634-010
两性霉素BInvitrogen15290018
B27Invitrogen17504044
BZ-X710Keyencen/a
cellSensOlympusn/a
胶原酶IIIWorthingtonLS004182
分散酶IISigmaD4693-1G
二硫苏糖醇（DTT）EMSCO/FisherBP1725
DPBSGibco14200-075
抗真菌剂（Fungin）InvivoGenNC9326704
胃泌素ISigma AldrichG9145
庆大霉素Invitrogen1570060
GlutamaxGibco35050-061
人EGF（hEGF）PeprotechAF-100-15
HEPESInvitrogen15630080
人FGF-10（hFGF-10）Peprotech100-26
L-WRN细胞系ATCCCRL-3276
MatrigelCorning47743-715
甲硝唑MP Biomedicals155710
N2添加剂Invitrogen17502048
Noggin ELISA试剂盒Novus BiologicalsNBP2-80296
青霉素-链霉素（Pen Strep）Gibco15140-122
RPMI 1640Gibco11875-085
R-Spondin ELISA试剂盒R&D SystemsDY4120-05
Wnt-3a ELISA试剂盒R&D SystemsDY1324B-05
Y-27632Sigma AldrichY0503

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