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方法文章

通过纳秒脉冲电场调控雪旺细胞生长以促进体外周围神经再生

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DOI：

10.3791/66097

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2024年5月3日

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1Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital, College of Medicine, Zhejiang University, 2College of Medicine, Zhejiang University, 3Department of Orthopedics, The Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, 4Department of Orthopedic Physical Therapy, Faculty of Physical Therapy, Nahda University in Beni Suef, 5Plastic & Cosmetic Center, The First Affiliated Hospital, College of Medicine, Zhejiang University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

此处，我们介绍一种应用纳秒脉冲电场（nsPEF）刺激施万细胞的实验方案 体外相关因子的合成与分泌能力以及细胞行为的变化验证了采用纳秒脉冲电场（nsPEF）刺激的成功。该研究对周围神经再生方法持积极评价。

摘要

施万细胞（Schwann cells, SCs）是周围神经系统的髓鞘形成细胞，在周围神经再生过程中发挥关键作用。纳秒脉冲电场（Nanosecond Pulse Electric Field, nsPEF）是一种新兴的神经电刺激方法，已被证明可有效促进细胞增殖及其他生物学过程。为评估施万细胞在nsPEF作用下是否发生显著变化，并探索其在新型周围神经再生方法中的潜力，本研究对培养的RSC96细胞施加了5 kV和10 kV的nsPEF刺激，随后继续培养3至4天。之后检测了施万细胞表达的一些相关因子，以验证刺激的有效性，包括特异性标志蛋白、神经营养因子、转录因子以及髓鞘形成调控因子。代表性结果表明，nsPEF显著增强了施万细胞的增殖与迁移能力，并提高了其合成有利于周围神经再生相关因子的能力。同时，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达水平降低，提示周围神经损伤具有良好的预后。上述结果表明，nsPEF通过刺激施万细胞，在治疗周围神经损伤方面具有广阔的应用前景，是一种极具潜力的高效干预手段。

引言

每年，都有数百万人受到周围神经系统（PNS）和中枢神经系统（CNS）神经损伤的影响1。研究表明，神经损伤后，CNS的轴突修复能力非常有限，而PNS由于施万细胞（SCs）具有显著的可塑性，表现出更强的修复能力2。然而，实现周围神经损伤后的完全再生仍然十分困难，持续对人类健康构成重大挑战3,4。目前，尽管自体移植存在供体部位并发症和来源有限等缺点5，仍是常见的治疗方法。这一现状促使研究人员探索替代疗法，包括材料学方法6、分子因子7以及电刺激（ES）。作为一种促进轴突生长和神经再生的因素，选择合适的电刺激方法并探究电刺激与施万细胞之间的关系变得至关重要8。

施万细胞（SCs）是周围神经系统（PNS）中的主要胶质细胞，在PNS再生过程中发挥关键作用9,10。周围神经损伤后，SCs会迅速活化并经历广泛的重编程2, ，从形成髓鞘的状态转变为支持生长的形态，以引导神经再生2。在损伤神经的远端，SCs发生显著增殖，同时远端残端的SCs通过增殖和伸长形成布恩纳带（Bungner's band），这对于引导轴突向靶器官生长至关重要11。此外，来自近端和远端神经残端的SCs会迁移至神经桥接区域，形成SC索状结构，促进轴突再生12。进一步研究表明，在周围神经再生过程中，SCs相关因子的合成与分泌发生改变，包括转录因子13、神经营养因子14以及髓鞘形成调控因子13。这些变化也为评估SCs活性提供了指标。基于上述机制，促进SCs的增殖、迁移及其相关因子的合成与分泌，已成为改善周围神经再生的重要研究方向15。

既往研究表明，电刺激（ES）可用于神经再生1。一种被广泛接受的解释是，电刺激可诱导细胞膜去极化，改变膜电位，并通过改变这些生物分子上的电荷分布影响膜蛋白功能1。然而，广泛使用的强脉冲电场（Intense PEF）可能引起剧烈疼痛、不自主的肌肉收缩以及心室纤维性颤动8。它还会增加肌酸激酶（CK）活性，降低肌肉力量，并诱发迟发性肌肉酸痛（DOMS）的发展16。纳秒脉冲电场（nsPEF）是一种新兴技术，通过纳秒级脉冲持续时间内的高压电场刺激实验对象，正逐渐应用于细胞水平的研究17,18。既往研究报道，nsPEF促进细胞增殖和细胞器活性的可能机制在于膜纳米孔的形成以及离子通道的激活，从而导致胞质内Ca2+浓度升高19。nsPEF利用脉冲功率技术对细胞膜充电，产生具有持续时间短、上升速度快、功率高和能量密度低特征的脉冲20。这些特性表明，nsPEF可能是一种刺激副作用最小的优选模式8。此外，与外科干预相比，nsPEF具有微创性、可逆性、可调节性以及对神经组织无破坏性等优势。nsPEF在生物医学领域的一个主流研究方向是利用高能电场刺激实现肿瘤组织消融21,22,23。一些研究结果表明，12-nsPEF可在不造成损伤的情况下刺激周围神经24。然而，目前关于nsPEF在神经再生领域应用的证据仍十分有限。此外，使用nsPEF刺激施万细胞（SCs）尚属开创性尝试，有助于推动后续的体内（in vivo）和临床研究。本研究旨在探讨nsPEF对SCs的刺激是否能够促进神经再生，从而为今后深入而系统的科学研究提供可靠依据。

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方案

1. 冻存RSC96细胞的解冻

  1. 将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37 °C水浴中快速振荡解冻，然后加入含有4-6 mL完全培养基的离心管中，充分混匀。
  2. 以1000 × g 离心3-5分钟，弃上清液，将细胞重悬于3 mL完全培养基中。
  3. 将细胞悬液加入含有6-8 mL完全培养基的培养瓶（或培养皿）中，于37 °C孵育过夜。
  4. 次日，在显微镜下观察细胞生长状态和密度。

2. 细胞传代：

注意：当细胞密度达到 80%–90% 时，即可进行传代。

  1. 弃去培养基，用不含钙、镁离子的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞1-2次。
  2. 向培养瓶中加入0.25% (w/v) 胰蛋白酶-0.53 mM EDTA（T25培养瓶加1-2 mL，T75培养瓶加2-3 mL），于37 °C孵育1-2分钟。
  3. 在显微镜下观察细胞脱落情况。若大部分细胞变圆并脱落，立即将培养瓶移回操作区，轻轻敲击培养瓶，加入含10% FBS的培养基3-4 mL以终止消化。
  4. 混匀后吸取溶液，于1000 × g 离心5分钟。弃去上清液，加入1-2 mL新鲜培养基，轻轻吹打重悬细胞。
  5. 按1:2比例将细胞悬液转移至新的T25培养瓶中，并加入7 mL培养基。

3. 纳秒脉冲电场设备的操作

  1. 将 RSC96 细胞重悬于 1 mL DMEM 培养基中，并转移至两侧带有电极的比色培养皿中。
  2. 打开电源开关。
  3. 通过旋转仪器上的旋钮调节参数，以改变电场强度。本研究设定的电场强度分别为 5 kV/cm、10 kV/cm、20 kV/cm 和 40 kV/cm。
  4. 缓慢旋转电极，直至出现火花，使细胞根据预设的电场强度接受 5 次纳秒脉冲电场（nsPEF）处理，随后立即分开两个电极。处理后，将接受 nsPEF 处理的实验组细胞与未处理的对照组细胞分别进行后续第 4–6 步操作，在一定时间的细胞培养后（本实验为 1 天）进行分析。

4. 细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测

  1. 从经电刺激的RSC96细胞中制备特定浓度的细胞悬液。将100 µL细胞悬液加入96孔细胞培养板的每个孔中。根据CCK-8试剂盒的检测要求，控制试剂盒中细胞总数在1 × 103至1 × 106之间。
  2. 从试剂盒中取10 µL CCK-8溶液，加入96孔细胞培养板中。在37 °C的CO2培养箱中继续孵育30分钟至4小时。
  3. 测定吸光度。采用双波长法测量，检测波长为430–490 nm，参考波长为600–650 nm。
  4. 根据细胞增殖实验结果确定后续实验所用的场强强度，并选择增殖状态良好的细胞用于后续实验。

5. 细胞划痕实验

  1. 在六孔板的每个孔中接种 3 × 105 个细胞，每孔总体积为 2 mL。约 72 小时后，细胞将铺满孔底。分别对实验组和对照组进行检测。
  2. 使用移液器枪头在培养孔底部划一条水平线。确保枪头保持垂直，尽量避免倾斜。
  3. 吸除培养基，并用 PBS 洗涤 2–3 次。
  4. 向每孔加入 2 mL 无血清培养基。
  5. 将培养板放入 37 °C 培养箱中。在 0 小时和 24 小时，于倒置显微镜下以 4 倍放大倍数拍摄图像，观察细胞迁移的变化。

6. 免疫荧光

  1. 细胞通透化：
    1. 将细胞悬液轻柔吹打后加入培养皿中，用组织学笔在盖玻片上细胞分布均匀的位置画圈。对照组和不同实验组需分别处理。
    2. 加入50–100 µL通透工作液（0.25–0.5% Triton X-100），室温（RT）孵育20分钟。用PBS洗涤三次，每次5分钟。
  2. 血清封闭：在画好的圈内加入3% BSA，均匀覆盖组织。室温孵育30分钟。
  3. 一抗孵育：轻柔吸除封闭液，向细胞孔中加入适当稀释的一抗（小鼠来源，稀释比例为1:300）。将细胞培养板放入湿盒中，4 °C孵育过夜。
  4. 二抗孵育：将细胞板置于摇床上，洗涤三次，每次5分钟。加入相应的二抗（CY3标记的山羊抗小鼠IgG，稀释比例为1:300），室温孵育50分钟。
  5. DAPI核染色：
    1. 将盖玻片置于含PBS（pH 7.4）的摇床上，洗涤三次，每次5分钟。
    2. 轻柔干燥载玻片后，在圈内加入DAPI染色液（2 µg/mL，每圈0.5 mL），在避光环境中室温孵育10分钟。
  6. 封片：将盖玻片置于含PBS（pH 7.4）的摇床上，洗涤三次，每次5分钟。轻柔干燥载玻片后，用抗荧光淬灭封片剂封固盖玻片。
  7. 图像采集：DAPI激发波长为330–380 nm，发射波长检测为420 nm；AF488激发波长为465–495 nm，发射波长检测为515–555 nm；CY3激发波长为510–560 nm，发射波长检测为590 nm；CY5激发波长为608–648 nm，发射波长检测为672–712 nm。

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结果

低强度脉冲电场促进细胞增殖
根据CCK-8检测结果，5 kV/cm组RSC96细胞的增殖速率显著快于对照组细胞。然而，随着参数升高（20 kV/cm和40 kV/cm），细胞增殖速率变得不稳定，甚至低于对照组。40 kV/cm组RSC96细胞的增殖速率显著低于对照组和5 kV/cm组，差异具有显著统计学意义（P < 0.05）。由于未达到细胞增殖实验的要求，后续实验排除了20 kV/cm和40 kV/cm组（图1）。

低强度脉冲电场促进 S100β 的表达
S100β 作为施万细胞（SCs）的特异性标志蛋白，参与多种功能，包括神经突延伸和轴突增殖14。此外，研究发现 S100β 蛋白在发育过程中可发挥神经营养因子的作用，且在神经损伤情况下其表达量增加。先前的研究表明，S100β 可与脑源性神经营养因子（BDNF）协同作用，调控不同的信号转导级联反应，促进神经元成熟和轴突生长

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讨论

近年来，据报告，纳秒脉冲电场（nsPEF）的应用呈现出快速增长态势。nsPEF仅对目标区域产生高度特异性的效应，可在不引起额外热损伤的情况下提供足够的治疗能量，因而对人体更加安全。28这些特性使其在肿瘤治疗和神经再生方面具有良好的转化前景。然而，一些研究也指出了nsPEF存在的一些局限性。与材料研究相比，ES受限于外部电源和导线29此外，最近一项研究证实，围手术期使用利多卡因作为镇痛剂会显著减弱电刺激相关神经再生的改善效果25这些问题可能给未来的研究带来挑战 体内.

我们仅使用纳秒脉冲电场（nsPEF）刺激RSC96细胞。接受低强度刺激的细胞表现出明显变化。然而，根据实验结果，nsPEF诱导的刺激效应持续时间相对较短，约为3天。未来可考虑结合金纳米棒和纳米水凝胶等能够增强脉冲电场生物电效应的材料，从而增强脉冲电场的生物电效应，并开发出更具靶向性和高效性的治疗策略30

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由国家重大科研仪器研制项目（编号：82027803）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗荧光淬灭封片剂武汉珈维生物技术有限公司G1401
抗GFAP小鼠单克隆抗体武汉珈维生物技术有限公司GB12100-100
抗神经丝重链蛋白小鼠单克隆抗体武汉珈维生物技术有限公司GB12144-100
抗S100β小鼠单克隆抗体武汉珈维生物技术有限公司GB14146-100
牛血清白蛋白（BSA）武汉珈维生物技术有限公司GC305010
盖玻片江苏世泰实验器材有限公司10212432C
CY3标记的山羊抗小鼠IgG武汉珈维生物技术有限公司GB21302
DAPI染色试剂武汉珈维生物技术有限公司G1012
脱色摇床武汉珈维生物技术有限公司DS-2S100
纳秒脉冲电场（nsPEF）高压电源Matsusada Precision Inc.AU-60P1.6-L
组织化学笔武汉珈维生物技术有限公司G6100
破膜液武汉珈维生物技术有限公司G1204
载玻片武汉珈维生物技术有限公司G6012
掌上离心机武汉珈维生物技术有限公司MS6000
PBS粉末武汉珈维生物技术有限公司G0002
移液器武汉珈维生物技术有限公司
正置荧光显微镜Nikon, JapanNIKON ECLIPSE C1
兔抗SOX10/AF488标记抗体北京博奥森生物技术有限公司BS-20563R-AF488
RSC96施万细胞武汉珈维生物技术有限公司STCC30007G-1
扫描仪3DHISTECHPannoramic MIDI
纳秒脉冲电场（nsPEF）专用电缆Times Microwave SystemsM17/78-RG217
涡旋混合器武汉珈维生物技术有限公司MV-100

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