此处，我们介绍一种应用纳秒脉冲电场（nsPEF）刺激施万细胞的实验方案 体外相关因子的合成与分泌能力以及细胞行为的变化验证了采用纳秒脉冲电场（nsPEF）刺激的成功。该研究对周围神经再生方法持积极评价。
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方法文章
通过纳秒脉冲电场调控雪旺细胞生长以促进体外周围神经再生
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
施万细胞（Schwann cells, SCs）是周围神经系统的髓鞘形成细胞，在周围神经再生过程中发挥关键作用。纳秒脉冲电场（Nanosecond Pulse Electric Field, nsPEF）是一种新兴的神经电刺激方法，已被证明可有效促进细胞增殖及其他生物学过程。为评估施万细胞在nsPEF作用下是否发生显著变化，并探索其在新型周围神经再生方法中的潜力，本研究对培养的RSC96细胞施加了5 kV和10 kV的nsPEF刺激，随后继续培养3至4天。之后检测了施万细胞表达的一些相关因子，以验证刺激的有效性，包括特异性标志蛋白、神经营养因子、转录因子以及髓鞘形成调控因子。代表性结果表明，nsPEF显著增强了施万细胞的增殖与迁移能力，并提高了其合成有利于周围神经再生相关因子的能力。同时，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达水平降低，提示周围神经损伤具有良好的预后。上述结果表明，nsPEF通过刺激施万细胞，在治疗周围神经损伤方面具有广阔的应用前景，是一种极具潜力的高效干预手段。
引言
每年，都有数百万人受到周围神经系统（PNS）和中枢神经系统（CNS）神经损伤的影响1。研究表明，神经损伤后，CNS的轴突修复能力非常有限，而PNS由于施万细胞（SCs）具有显著的可塑性，表现出更强的修复能力2。然而，实现周围神经损伤后的完全再生仍然十分困难，持续对人类健康构成重大挑战3,4。目前，尽管自体移植存在供体部位并发症和来源有限等缺点5，仍是常见的治疗方法。这一现状促使研究人员探索替代疗法，包括材料学方法6、分子因子7以及电刺激（ES）。作为一种促进轴突生长和神经再生的因素，选择合适的电刺激方法并探究电刺激与施万细胞之间的关系变得至关重要8。
施万细胞（SCs）是周围神经系统（PNS）中的主要胶质细胞，在PNS再生过程中发挥关键作用9,10。周围神经损伤后，SCs会迅速活化并经历广泛的重编程2, ....
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方案
1. 冻存RSC96细胞的解冻
- 将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37 °C水浴中快速振荡解冻，然后加入含有4-6 mL完全培养基的离心管中，充分混匀。
- 以1000 × g 离心3-5分钟，弃上清液，将细胞重悬于3 mL完全培养基中。
- 将细胞悬液加入含有6-8 mL完全培养基的培养瓶（或培养皿）中，于37 °C孵育过夜。
- 次日，在显微镜下观察细胞生长状态和密度。
2. 细胞传代：
注意：当细胞密度达到 80%–90% 时，即可进行传代。
- 弃去培养基，用不含钙、镁离子的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞1-2次。
- 向培养瓶中加入0.25% (w/v) 胰蛋白酶-0.53 mM EDTA（T25培养瓶加1-2 mL，T75培养瓶加2-3 mL），于37 °C孵育1-2分钟。
- 在显微镜下观察细胞脱落情况。若大部分细胞变圆并脱落，立即将培养瓶移回操作区，轻轻敲击培养瓶，加入含10% FBS的培养基3-4 mL以终止消化。
- 混匀后吸取溶液，于1000 × g 离心5分钟。弃去上清液，加入1-2 mL新鲜培养基，轻轻吹打重悬细胞。
- 按1:....
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结果
低强度脉冲电场促进细胞增殖
根据CCK-8检测结果，5 kV/cm组RSC96细胞的增殖速率显著快于对照组细胞。然而，随着参数升高（20 kV/cm和40 kV/cm），细胞增殖速率变得不稳定，甚至低于对照组。40 kV/cm组RSC96细胞的增殖速率显著低于对照组和5 kV/cm组，差异具有显著统计学意义（P < 0.05）。由于未达到细胞增殖实验的要求，后续实验排除了20 kV/cm和40 kV/cm组（图1）。
低强度脉冲电场促进 S100β 的表达
S100β 作为施万细胞（SCs）的特异性标志蛋白，参与多种功能，包括神经突延伸和轴突增殖14。此外，研究发现 S100β 蛋白在发育过程中可发挥神经营养因子的作用，且在神经损伤情况下其表达量增加。先前的研究表明，S100β 可与脑源性神经营养因子（BDNF）协同作用，调控不同的信号转导级联反应，促进神经元成熟和轴突生长
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讨论
近年来，据报告，纳秒脉冲电场（nsPEF）的应用呈现出快速增长态势。nsPEF仅对目标区域产生高度特异性的效应，可在不引起额外热损伤的情况下提供足够的治疗能量，因而对人体更加安全。28这些特性使其在肿瘤治疗和神经再生方面具有良好的转化前景。然而，一些研究也指出了nsPEF存在的一些局限性。与材料研究相比，ES受限于外部电源和导线29此外，最近一项研究证实，围手术期使用利多卡因作为镇痛剂会显著减弱电刺激相关神经再生的改善效果25这些问题可能给未来的研究带来挑战 体内.
我们仅使用纳秒脉冲电场（nsPEF）刺激RSC96细胞。接受低强度刺激的细胞表现出明显变化。然而，根据实验结果，nsPEF诱导的刺激效应持续时间相对较短，约为3天。未来可考虑结合金纳米棒和纳米水凝胶等能够增强脉冲电场生物电效应的材料，从而增强脉冲电场的生物电效应，并开发出更具靶向性和高效性的治疗策略30
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由国家重大科研仪器研制项目（编号：82027803）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗荧光淬灭封片剂 | 武汉珈维生物技术有限公司 | G1401 | |
| 抗GFAP小鼠单克隆抗体 | 武汉珈维生物技术有限公司 | GB12100-100 | |
| 抗神经丝重链蛋白小鼠单克隆抗体 | 武汉珈维生物技术有限公司 | GB12144-100 | |
| 抗S100β小鼠单克隆抗体 | 武汉珈维生物技术有限公司 | GB14146-100 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | 武汉珈维生物技术有限公司 | GC305010 | |
| 盖玻片 | 江苏世泰实验器材有限公司 | 10212432C | |
| CY3标记的山羊抗小鼠IgG | 武汉珈维生物技术有限公司 | GB21302 | |
| DAPI染色试剂 | 武汉珈维生物技术有限公司 | G1012 | |
| 脱色摇床 | 武汉珈维生物技术有限公司 | DS-2S100 | |
| 纳秒脉冲电场（nsPEF）高压电源 | Matsusada Precision Inc. | AU-60P1.6-L | |
| 组织化学笔 | 武汉珈维生物技术有限公司 | G6100 | |
| 破膜液 | 武汉珈维生物技术有限公司 | G1204 | |
| 载玻片 | 武汉珈维生物技术有限公司 | G6012 | |
| 掌上离心机 | 武汉珈维生物技术有限公司 | MS6000 | |
| PBS粉末 | 武汉珈维生物技术有限公司 | G0002 | |
| 移液器 | 武汉珈维生物技术有限公司 | ||
| 正置荧光显微镜 | Nikon, Japan | NIKON ECLIPSE C1 | |
| 兔抗SOX10/AF488标记抗体 | 北京博奥森生物技术有限公司 | BS-20563R-AF488 | |
| RSC96施万细胞 | 武汉珈维生物技术有限公司 | STCC30007G-1 | |
| 扫描仪 | 3DHISTECH | Pannoramic MIDI | |
| 纳秒脉冲电场（nsPEF）专用电缆 | Times Microwave Systems | M17/78-RG217 | |
| 涡旋混合器 | 武汉珈维生物技术有限公司 | MV-100 |
参考文献
- Jing, W., et al. Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells. ACS Chem Neurosci. 10 (1), 348-357 (2018).
- Nocera, G., Jacob, C.
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