针对紧迫的登革热诊断需求，本文介绍了一种与智能手机应用程序集成的基于纸张的登革热NS1抗原检测装置（DEN-NS1-PAD），可用于定量临床血清/血液样本中的登革热NS1抗原浓度。该创新技术有助于在各类医疗环境中进行临床决策，即使在资源有限的地区也能提升登革热的管理水平。
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摘要
摘要
登革病毒（DENV）感染由伊蚊（Aedes）传播，是热带和亚热带国家重要的公共卫生问题。该病每年约有1000万例发病，导致20,000至25,000例死亡，尤其在儿童中较为严重，因此迫切需要实用的诊断工具。在感染早期阶段，登革病毒非结构蛋白1（NS1）的存在与细胞因子释放、血管渗漏以及内皮功能障碍相关，使其成为重症登革热的潜在标志物。
基于纸张的免疫分析方法，如侧向流动分析（LFAs）和微流控纸基分析装置（PADs），因其操作简便、快速、成本低廉、特异性强且易于解读，已广泛用作诊断检测手段。然而，传统的用于登革病毒NS1检测的纸基免疫分析通常依赖肉眼观察，仅能提供定性结果。为克服这一局限性并提高检测灵敏度，我们开发了一种高度便携式的登革病毒NS1检测方法——纸基分析装置（PAD）上的DEN-NS1-PAD，该方法结合智能手机应用程序作为比色和定量读取工具。该系统可直接对临床样本中的NS1浓度进行定量分析。
采集自患者的血清和血液样本被用于验证该系统原型的性能。结果可即时获得，适用于设备完善的医疗机构以及资源有限环境下的临床评估。这种基于纸质的免疫测定法与智能手机应用程序的创新结合，为登革病毒NS1抗原的增强检测与定量提供了有前景的解决方案。通过提升超越肉眼观察能力的检测灵敏度，该系统在改善登革热管理的临床决策方面具有巨大潜力，尤其适用于偏远或医疗资源匮乏地区。
引言
登革病毒（DENV）感染是传播速度最快的蚊媒疾病1，全球每年有超过3.9亿人感染，其中9600万例出现临床症状，200万例发展为重症，死亡人数超过2.5万1,2。根据世界卫生组织（WHO）估计，约有39亿人面临登革热感染风险，其中约70%分布在亚太地区，主要集中在东南亚3。2019年，向世界卫生组织报告的登革热病例数达420万例，其中泰国报告至少13.6万例登革热病例，因登革病毒感染导致144例死亡4。泰国的登革热疫情每年均发生在雨季，时间为4月至12月，城市和农村地区均有暴发，尤以东北部地区为甚。
登革病毒（DENV）感染具有多种临床表现，从无症状、轻度登革热（DF）到重度登革出血热（DHF）不等。重度DHF的主要特征是血管通透性增加，继而引发休克和器官功能障碍1。了解可导致血管渗漏的分子通路，对于开发有效的登革热治疗方法至关重要。登革病毒非结构蛋白1（NS1）是在病毒感染早期分泌的一种糖蛋白5,6，其功能是作为病毒RNA复制的辅助因子
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方案
泰国曼谷帕拉蒙固克里奥医院皇家泰国陆军医疗部机构审查委员会伦理委员会（IRBRTA 1218/2562）批准了本研究。在开展本研究过程中，我们遵守了所有必要的伦理规范。
1. 基于纸张的免疫测定装置的制备
注意：纸质免疫分析装置的制备参照了先前已建立的方法36,37以及泰国专利申请号 19010081638。
- 设计与图案绘制：在计算机上设计纸基分析装置（图1A，B），在A5尺寸的纸上布置18个纸基分析装置（PAD）的蜡图案。
注意：该设计具有特定性，专为A5尺寸纸张设计。PAD的数量可根据用户需求，根据纸张大小进行调整。 - 使用蜡打印机（材料表）将设计好的图案打印到纤维素纸上。
- 将打印蜡图案的纸张在实验室烘箱中于150 °C加热75秒，使蜡熔化。随后将其存放在干燥硅胶盒中，待后续步骤使用。
- 在检测区和对照区各加入0.5 µL的0.025%聚-L-赖氨酸（PLL）。在硅胶盒中室温（RT）孵育2分钟，然后在6....
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结果
选择合适的制备方法对于确保基于纸张的免疫分析装置具有可重复的检测性能至关重要。在本研究中，我们探索了多种制造工艺和材料，以展示一种基于纸张的免疫分析方法。我们所采用的方法利用蜡印系统在基于纸张的微流控装置中构建疏水屏障。该方法因其操作简便、快速且结果稳定而具有显著优势。值得注意的是，该方法避免了使用可能干扰蛋白质吸附并增加纤维素纸疏水性的光刻胶化学品。此外，蜡印技术能够确保流体通道尺寸的一致性，从而有助于实现可重复的检测性能。
形成疏水屏障后，将免疫测定所需的试剂施加到纤维素纸表面。通过静电吸附作用，PLL通过与胺基的正电荷以及抗体的负电荷相互作用，促进生物分子的固定。该步骤有助于在制造过程中实现抗体的修饰与固定，以及标记-抗体结合物的应用。重要的是，该步骤可并行进行。通过将修饰后的纸片叠加到带有黏性的塑料背板上，并用塑料薄膜封合，完成纸质免疫测定装置（DEN-NS1-PAD，如图1A所示）的组装。
本研究的主要目的是开发一种利用智能手机检测NS1浓度的用户友好型方法.......
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讨论
基于智能手机的读取系统的一个重要设计参数是能够对样本进行可重复的图像处理。本研究中，为简化操作并提高便利性，使用三种不同品牌的智能手机（配备1200万至1300万像素摄像头）直接拍摄图像，未使用成像箱或其他附件。图像采集过程中的多种可变条件，如摄像头分辨率、图像采集时间、光照条件和环境因素，均可能影响设备上检测线和质控线的颜色强度。通过采用归一化信号强度，可最小化不同采集时间对纸基微流控芯片（PAD）光照和干燥程度所导致的信号强度变化，从而在不同时间点采集的图像间保持信号一致性36。背景信号扣除被作为一种提升颜色强度测量准确性的策略，有效减轻了光照条件的影响。我们的研究结果与先前研究一致，均表明基线或背景扣除技术在降低环境干扰方面具有显著效果39,40。
关于使用成像盒或无附件方法哪种更具优势的持续争论，对图像处理具有重要意义39,
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
M.H.P. 感谢伊斯兰印尼大学（Universitas Islam Indonesia，UII）提供的奖学金研究基金。作者们衷心感谢 Nutchanon Ninyawee 先生在移动应用程序开发过程中提供的宝贵专业知识和协助，以及他对本手稿的贡献。此外，作者们感谢泰国科学、研究与创新局（Thailand Science Research and Innovation，TSRI）基础研究基金：2023 财年（项目编号 FRB660073/0164）在国王蒙库特科技大学（Thonburi）智能医疗项目下的财政支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 材料 | |||
| 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2） | |||
| 含0.1% Tween 20、10%蔗糖和1%酪蛋白的硼酸盐缓冲液（BBS） | 结合区处理及封闭缓冲液 | ||
| 硼酸盐缓冲液（BBS）（25 mM 硼酸钠和150 mM 氯化钠，pH 8.2），添加1% BSA | 抗体与AuNPs结合过程中的洗涤缓冲液 | ||
| 硼酸 | Merck | 10043-35-3 | |
| 牛血清白蛋白第五组分（BSA） | PAA Lab GmbH（德国） | K41-001 | |
| 酪蛋白 | Merck | 9005-46-3 | |
| 2号层析滤纸 | GE Healthcare | 3002-911 | |
| 透明覆膜 | 3M（文具店） | ||
| 磷酸氢二钠 | Merck | 7558-79-4 | |
| 双面胶带 | 文具店 | ||
| 羊抗小鼠IgG抗体 | MyBiosource（美国） | MBS435013 | |
| 金纳米颗粒（40 nm） | Serve Science Co., Ltd.（泰国） | ||
| 人IgG多克隆抗体 | Merck | AG711-M | |
| 小鼠登革病毒NS1单克隆抗体 | MyBiosource（美国） | MBS834415 | |
| 小鼠登革病毒NS1单克隆抗体 | MyBiosource（美国） | MBS834236 | |
| NS1 2型血清型抗原 | MyBiosource（美国） | MBS 568697 | |
| 含0.1% Tween 20的1× PBS用作 | 洗脱缓冲液 | ||
| 塑料背板（10×30 cm） | Pacific Biotech Co., Ltd.（泰国） | ||
| 聚-L-赖氨酸（PLL） | Sigma Aldrich | P4832 | |
| 氯化钾 | Merck | 104936 | |
| 磷酸二氢钾 | Merck | 104877 | |
| 氯化钠 | Merck | 7647-14-5 | |
| 四硼酸钠 | Sigma Aldrich | 1303-96-4 | |
| 蔗糖 | Merck | 57-50-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
| 仪器 | |||
| CytationTM 5 多功能酶标仪 | BioTek | ||
| 手机 | Huawei Y7、iPhone 11、Samsung a20 | ||
| 平板扫描仪 | Epson Perfection V30 | ||
| 烘箱 | Memmert | ||
| 蜡质打印机 | Xerox ColorQube 8880-PS | ||
| 软件 | |||
| Google Cloud AutoML Vision 目标检测文档 | Google Cloud | ||
| ImageJ | 美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州，美国 | ||
| Inkscape 0.91 软件 |
参考文献
- Cattarino, L., Rodriguez-Barraquer, I., Imai, N., Cummings, D. A. T., Ferguson, N. M. Mapping global variation in dengue transmission intensity. Science Translational Medicine. 12 (528), 1-11 (2020).
- World Health Organization (WHO). Treatment, prevention and control global strategy for ....
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重印与许可
