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利用基因编码钙指示剂对病毒感染的人肠道类器官单层进行活体钙成像

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DOI：

10.3791/66132

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2024年1月19日

 ,  ,  , 
1Alkek Center for Metagenomics and Microbiome Research, Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine

本文内容

摘要

本方案描述了一种在病毒感染的人肠道类器官中进行钙成像的方法，并提供了一种分析策略。

摘要

钙信号是调控几乎所有组织的核心机制。在肠上皮中，钙参与调控分泌活动、肌动蛋白动态、炎症反应、干细胞增殖以及许多尚未明确的细胞功能。因此，绘制肠上皮内钙信号的动态图谱有助于深入理解细胞稳态过程，并揭示对各种刺激的独特响应。人源肠道类器官（HIOs）是一种高通量、来源于人类的肠上皮研究模型，因而成为研究钙动态的理想体系。本文介绍了一种稳定转导HIOs以表达基因编码钙指示剂（GECIs）、进行活细胞荧光显微成像并分析成像数据以有效表征钙信号的实验方案。作为代表性示例，将三维HIOs通过慢病毒转导，使其稳定表达基于绿色荧光蛋白的胞质GECI——GCaMP6s。经基因工程改造的HIOs随后被分散为单细胞悬液，并以单层形式接种培养。在完成分化后，HIO单层细胞被轮状病毒感染和/或用已知可激发钙反应的药物处理。利用配备温控、加湿活细胞成像舱的落射荧光显微镜，可对感染或药物处理的单层细胞进行长期成像。成像完成后，使用免费开源分析软件ImageJ对获取的图像进行分析。总体而言，本研究建立了一条可灵活应用的流程，用于在HIOs中表征细胞信号传导过程。

引言

钙是一种广泛保守的第二信使，在调控细胞生理学中起着关键作用1。由于其电荷强、体积小且在生理条件下溶解度高，钙是调节蛋白质构象的理想分子。这使得钙能够有效地将电化学信号转化为酶活性、转录或转录后水平的改变。内质网（ER）和质膜之间存在严格的钙浓度梯度，形成了强大的驱动力，从而实现胞质钙浓度的快速变化。多种机制（包括缓冲作用和主动运输）共同紧密维持这一梯度。尽管这种维持对正常细胞功能至关重要，但其能量消耗较大，因此在应激状态下尤为脆弱2。

因此，细胞质内钙离子的失调几乎是各种细胞应激的普遍信号。代谢紊乱、毒素、病原体、机械损伤以及遗传干扰均可能破坏钙信号传导。无论刺激因素为何，在全细胞水平上，持续且不受控制的细胞质钙浓度升高均可促进细胞凋亡，并 最终导致坏死3,4。然而，幅度较低或频率较高的细胞质钙水平变化则具有不同的效应2。同样，钙波动的结果也可能因其发生的特定空间微域而异5。因此，监测钙水平可 为动态信号传导过程提供洞察，但这需要具备相对较高的时间和空间分辨率的采样技术。

基因编码的钙离子指示剂（GECIs）是用于活细胞系统中连续采样的有力工具6。其中应用最广泛的GECIs是一类基于绿色荧光蛋白（GFP）的钙离子响应型荧光蛋白，称为GCaMPs7。经典的GCaMP由三个不同的蛋白质结构域融合而成：环状重排的绿色荧光蛋白（cpGFP）、钙调蛋白（calmodulin）和M136。钙调蛋白结构域在结合钙离子后发生构象变化，从而能够与M13相互作用。钙调蛋白与M13的结合会诱导cpGFP发生构象改变，使其在激发后荧光发射增强。因此，钙离子浓度的升高与GCaMP荧光强度的增强呈正相关。这些传感器可定位于细胞质，也可靶向特定细胞器8。

与大多数组织类似，钙离子调控着胃肠道上皮内的多种功能。肠上皮对于营养物质和液体的吸收至关重要，同时还必须形成紧密的屏障和免疫界面，以防止病原体入侵或毒性损伤。钙依赖性信号通路几乎影响所有这些关键功能9,10,11。然而，肠上皮内的钙信号传导仍是一个尚未充分探索的研究领域，具有作为治疗靶点的广阔前景。尽管在活体（in vivo）条件下监测肠上皮内钙动态变化仍面临挑战，人类肠道类器官（HIOs）为实验研究提供了一种可操作的体外（ex vivo）系统12。HIOs 是由人类肠干细胞衍生而来的三维（3D）球状结构，在分化后能够重现天然肠上皮的大部分细胞多样性12。

本方案描述了表达基因编码钙指示剂（GECI）的人类类器官（HIO）的构建方法，并进一步将工程化HIO制备为单层细胞，用于活细胞钙成像。方案以病毒侵染为例，演示了一种破坏钙信号通路的病理干预手段，并提供了量化此类变化的分析方法。

方案

本方案及代表性实验所使用的所有人肠道类器官（HIOs）均来源于贝勒医学院德克萨斯医学中心消化疾病类器官核心实验室获取并维持培养的人体组织。所有样本的采集均遵循贝勒医学院机构审查委员会批准的方案进行。

1. 材料与试剂的准备

  1. 进行类器官维持时，准备细胞培养处理的24孔板、基底膜基质（BMM）、15 mL离心管和1.5 mL离心管。
    1. 配制不含生长因子的完全培养基（CMGF-）：向500 mL高级DMEM/F12培养基中加入5 mL 1 M HEPES、5 mL 100倍抗生素-抗真菌剂、5 mL 100倍谷氨酰胺补充剂。
    2. 配制含Wnt、R-spondin和Noggin的培养基（WRNE）：将等体积的CMGF-与Wnt条件培养基混合，加入Noggin条件培养基（终体积比10%）、R-spondin条件培养基（终体积比20%）、50 ng/mL人表皮生长因子、10 mM烟酰胺、10 nM [Leu15]-胃泌素I、500 nM A-83-01、10 µM SB202190、1倍B27补充剂、1倍N2补充剂以及1 mM N-乙酰半胱氨酸。
  2. 进行慢病毒转导时，准备胎牛血清（FBS）、含0.05%胰蛋白酶-EDTA的1×磷酸盐缓冲液（PBS）、含10% FBS的CMGF-、无菌1× PBS、Polybrene、10 µM Y-27632、慢病毒颗粒、高Wnt WRNE培养基加10 µM Y-27632。
  3. 生成类器官单层培养时，准备玻璃底10孔细胞培养载片、FBS、IV型胶原蛋白（1 mg/mL溶于去离子H2O中）、基底膜基质、含0.5 mM EDTA的1× PBS、含5 mM EDTA的1× PBS、酶解解离缓冲液、含10% FBS的CMGF-、含10 µM Y-27632的WRNE培养基。
  4. 对类器官单层进行病毒感染时，准备胰蛋白酶、轮状病毒原液、CMGF-、25G针头、无菌1× PBS以及不含酚红的分化培养基。
    1. 配制不含酚红的分化培养基：取500 mL不含酚红的细胞培养基，加入5 mL 100倍MEM非必需氨基酸、5 mL 100倍L-谷氨酰胺、5 mL 100 nM丙酮酸钠以及7.5 mL 1 M HEPES。
  5. 进行类器官免疫荧光染色时，准备4%甲醛（用1× PBS稀释16%甲醛）、Triton X-100（1× PBS中含0.1% Triton X-100）、牛血清白蛋白（1× PBS中含3%牛血清白蛋白）、NH4Cl溶液（50 mM）、DAPI（1 µg/mL DAPI溶于1× PBS中）。

2. 构建表达基因编码钙传感器的类器官

注意：本方案描述了在24孔板中接种于30 μL基底膜基质（BMM）上的三维人肠道类器官单孔转导步骤13。大多数细胞系每孔约含400,000个细胞。应设置一个未转导的孔作为对照。所有试剂和细胞悬液均需置于冰上保存。

  1. 从上次传代后 2-5 天，从两孔 HIO 中移除维持用 WRNE 培养基。每孔加入 300 μL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，并轻轻吹打 5 次以使 BMM 从培养板上脱落。置于 37 °C 培养箱中孵育 4 分钟。
  2. 每孔加入 500 μL CMGF- + 10% FBS。使用 1 mL 低吸附枪头，通过将 1 mL FBS 吹打上下 2 次进行预包被。FBS 可在多个枪头间重复使用。使用预包被的枪头，将 HIO 吹打上下 10 次。
  3. 将每孔内容物转移至各自预包被的 1.5 mL 微离心管中。用额外的 500 μL CMGF- 冲洗每孔，并将洗涤液加入相应的管中。
  4. 在 4 °C 条件下，以 100 × g 离心 5 分钟（使用摆动桶离心机）。移除上清液及任何残留的 BMM。
  5. 用 1 mL 1× PBS 重悬。将每管样品分装至两个微离心管中，共得到 4 个管。在 4 °C 条件下，以 100 × g 离心 5 分钟。移除上清液。
  6. 每管再用 1× PBS 重悬一次，并在 4 °C 条件下以 100 × g 离心 5 分钟。
  7. 准备 400 µL 转导培养基和对照培养基（表 1）。将其中 2 管用 200 µL 对照培养基重悬，另 2 管用 200 µL 转导培养基重悬。
  8. 在 37 °C 细胞培养箱中孵育 24 小时。定期使用包被枪头吹打重悬（例如转导后 2 小时、12 小时、18 小时），以促进均匀转导。
  9. 24 小时后，在 4 °C 条件下以 100 × g 离心 5 分钟。移除上清液。
  10. 用 500 µL 1× PBS 重悬沉淀进行洗涤。在 4 °C 条件下以 100 × g 离心 5 分钟。移除上清液。
  11. 使用预冷的 200 µL 枪头，将 4 个沉淀分别用 30 µL BMM 重悬。轻轻吹打上下以均匀分散。
  12. 将每管内容物接种至 24 孔板中的独立孔内。在 37 °C 孵育 10 分钟，待 BMM 凝固后，加入 500 μL HighWnt WRNE + 10 μM Y-27632。
  13. 让转导后的 HIO 培养 1 周，每隔一天更换一次培养基（HighWnt WRNE + 10 μM Y-27632）。1 周后，通过显微镜检测荧光指示剂的表达情况。若信号较强，开始药物筛选；若信号较弱，则按上述方法重复转导。
  14. 细胞系建立后，通过激动剂处理验证荧光指示剂功能。100 nM ADP 是用于 GCaMP 验证的可靠激动剂。按以下方法对 3D 类器官进行初步验证：
    1. 传代后，将一孔（或多个孔）类器官以 BMM 接种于独立的成像底板上。接种密度约为正常密度的 1/3，以避免成像时过度重叠。激动剂处理后不再继续传代这些 HIO，因难以保证无菌条件。
    2. 让 HIO 在传代后恢复 2-3 天。成像前，更换为不含酚红的分化培养基。
    3. 使用荧光显微镜，设置 3 分钟成像程序，每 5 秒采集一次图像，激发光为 488 nm，使用 FITC/GFP 滤光片组。成像 30 秒后，加入 100 nM ADP 或溶剂对照。继续成像直至信号恢复至接近基线水平，约 2 分钟。ADP 处理后 GCaMP 荧光出现瞬时、约 2 倍的升高，表明转导成功且生物传感器功能正常。如需更精确估计转导效率，可使用第 3 部分所述方法制备的单层细胞重复激动剂测试并进行成像。

3. 活体荧光成像用 HIO 单层的制备

  1. 用IV型胶原蛋白包被10孔成像底板玻片的所有孔。具体操作如下：将34 μL浓度为1 mg/mL的IV型胶原蛋白与960 μL无菌去离子水混合。向每个孔中加入95 μL稀释后的IV型胶原蛋白溶液，并在37 °C孵育0.5–2小时。
  2. 从4孔三维人肠道类器官（HIO）中移除WRNE维持培养基。HIO应在上一次传代后5–7天进行此操作。
    注意：通常1块10孔板需要约1.25 × 106个细胞。这通常需要将2–4孔3D HIO分别以每孔30 μL基质胶（BMM）接种，具体数量取决于细胞密度。
  3. 每孔加入500 μL 1× PBS + 0.5 mM EDTA。使用预先包被的1 mL枪头，轻轻吹打以使BMM从孔板上脱离。将悬液转移至预先包被的15 mL锥形管中，将相同来源的孔合并至同一管中。
  4. 用额外500 μL PBS + 0.5 mM EDTA冲洗每个孔。在4 °C下以300 × g离心5分钟。弃去上清液及残留的BMM。
  5. 使用预先包被的枪头，将剩余沉淀重悬于3 mL PBS + 5 mM EDTA中（注意：此步EDTA浓度为第一次洗涤时的10倍）。
  6. 在4 °C下以300 × g离心5分钟。弃去上清液。将沉淀重悬于2 mL酶解消化缓冲液中。
  7. 在37 °C水浴或珠浴中孵育5分钟。加入3 mL CMGF- + 10% FBS，并轻轻吹打混匀。
  8. 在4 °C下以300 × g离心5分钟。弃去上清液。加入1 mL CMGF-。
  9. 使用预先包被的枪头剧烈吹打80–100次，通过机械方式将HIO解离为单细胞。在4 °C下以300 × g离心5分钟。弃去上清液。
  10. 将沉淀重悬于1 mL WRNE + 10 µM Y-27632中。对1 mL悬液进行细胞计数。
  11. 用WRNE + 10 µM Y-27632稀释细胞悬液，使终浓度达到1.25 × 105个细胞/100 μL（即1.25 × 106个细胞/mL）。
  12. 使用200 μL移液器，移除第1步中已准备好的孔板中的胶原溶液（此时胶原已沉降至孔底）。操作时避免移液枪头接触孔底。
  13. 使用预先包被的200 μL移液枪头，向每孔加入100 μL第3.11步的细胞悬液（含1.25 × 105个细胞）。
  14. 在37 °C细胞培养箱中孵育24小时。24小时后，移除所有孔中的培养基，并更换为每孔100 μL分化培养基。
    注意：此时细胞应已贴附于孔板表面。请注意，单层细胞可能尚未达到融合状态或完全平整。
  15. 将玻片重新放回37 °C细胞培养箱中。每24小时更换一次分化培养基，直至单层细胞达到融合状态。通常从接种起需3–5天。此后，单层细胞即可用于后续实验应用。

4. HIO 单层细胞的病毒感染

  1. 制备病毒接种物。如有必要，用胰蛋白酶激活病毒储备液。对于轮状病毒，向病毒储备液中加入 10 µg/mL Worthington 胰蛋白酶，并在 37 °C 下孵育 1 小时。
    1. 使用以下两种方法之一稀释活化的病毒储备液。
      1. 若旨在使用单一病毒株获得最大数量的感染细胞，将 50 μL 活化后的病毒储备液与 50 μL CMGF- 混合。
      2. 若比较多个病毒株，需制备接种物以达到等效的感染复数（MOI）。使用以下公式计算每孔所需病毒储备液的体积，并向计算所得的病毒储备液体积中加入 CMGF-，使每孔终体积为 100 μL。
        病毒滴度计算公式，MOI应用，病毒学实验，方程示意图。
        注意：一个接种于直径为 5.46 mm（96 孔板）的单孔中的 HIO 单层约含有 200,000 个细胞。由于单层细胞感染效率较低，建议采用高感染复数（MOI，每细胞 100 至 100 万个病毒颗粒）。最佳 MOI 需通过实验确定。
    2. 用 200 mL 移液器轻轻吸除 HIO 单层中的培养基，接种病毒或模拟接种物 100 mL。
      1. 由于大多数轮状病毒储备液是在 MA104 细胞中扩增的，因此使用未感染的 MA104 细胞裂解物作为模拟接种物。所用体积应与感染孔中使用的病毒储备液体积相当，并加入 CMGF- 使每孔终体积为 100 mL。
      2. 对于从基底侧感染细胞的病毒（如轮状病毒14），使用 25G 针头划伤单层。最简便的方法是从孔底部到顶部沿单层长度方向划一条直线。将针头斜面朝上、与移动方向相反，以一定角度轻轻压入单层，并沿其长度拖动，形成一道划痕（图 2A）。
    3. 在 37 °C 培养箱中孵育 2 小时。移除病毒接种物和模拟接种物，用 1× PBS 洗涤单层一次。
    4. 加入 100 μL 无酚红的分化培养基。将载玻片置于 37 °C 培养箱中，待成像时取出。最佳成像时间窗取决于病毒感染的动力学特征。对于轮状病毒，建议在感染后 6–8 小时开始成像。

5. 感染单层细胞的 Ca2+ 成像

  1. 预热台式培养箱至 37 °C. 使用加湿的 CO₂ 培养箱培养2 以 0.02 L/min 的流速通入气体。将带有感染单层细胞的载玻片放入培养箱腔室中，并密封盖子。
  2. 使用明场（BF）照明和20倍物镜，选择单层细胞中待成像视野的X和Y坐标。最好选择包含划痕区域的视野，因为大多数感染细胞将位于划痕附近。
  3. 优化成像参数，使用488 nm激发光采集图像。为尽量减少光毒性，将光源功率设置为50%，曝光时间为50 ms。合适的采集参数可能因实验条件而异，应通过多次采集进行优化。确保无像素饱和，根据需要调整曝光时间和光照强度，以保证荧光钙离子传感器的整个动态范围均可被检测到。
  4. 若使用其他荧光染料（例如，荧光标记的病毒），需对这些通道重复优化。设置成像循环，在每分钟循环中于选定的每个 X、Y 坐标采集 488 nm 图像。持续进行该循环成像。当使用荧光标记病毒时，每隔 10 秒在相应通道采集一次图像th 循环（即每10分钟1张图像）。
  5. 连续采集图像约18小时。若使用的病毒未携带荧光标签，则在成像结束后，对单层细胞进行固定并进行免疫荧光染色以鉴定感染细胞。具体操作步骤如下所述。
    1. 移除成像培养基并替换为 100 μL 在1×PBS中加入4%甲醛，室温孵育30分钟。
    2. 去除固定剂，并用 100 μL 50 mM NH4Cl 孵育 10 分钟。去除 NH4Cl. 用去垢剂处理单层细胞以增加通透性 100 μL 0.1% Triton X-100 的 1x PBS 溶液中，室温孵育 1 小时或 4℃ 过夜 4 °C.
    3. 去除通透缓冲液。用封闭液封闭 100 μL 在1×PBS中加入3%牛血清白蛋白，孵育1 h。
    4. 除去封闭液，加入用1x PBS稀释至推荐或优化浓度的一抗。添加 100 μL 每孔加入抗体溶液
    5. 4 ℃孵育过夜 4 °C 轻柔振荡孵育。去除一抗，用1×PBS洗涤3次。
    6. 加入用1×PBS稀释至推荐/优化浓度的荧光标记二抗。加入 100 μL 每孔。室温孵育2小时。
      注意：FPBase15 是帮助选择在多重检测中避免串色的二抗的优质资源。大多数二抗在1×PBS中以1:1000稀释倍数使用时效果良好。
    7. 去除二抗。进行下一步操作。 1 µg/mL DAPI 溶液加入 1x PBS 中并添加 100 μL 每孔加入。孵育20分钟。移除DAPI。用1×PBS洗涤3次。
    8. 保持固定的单层细胞 100 μL 用1×PBS进行成像。将玻片重新放回显微镜载物台上，调用活细胞成像运行中的X和Y坐标，对每个多位点使用与二抗染色相对应的通道进行成像。参考活细胞成像运行所获得的图像，确保捕获相同的位点。

6. 细胞间钙波的定量分析

  1. 确保已安装Fiji（即Just ImageJ，FIJI），并包含以下插件：Bio-Formats（该插件应已预装于FIJI中，但ImageJ中可能没有）；Cookbook：安装方法为，在FIJI菜单中依次选择 帮助 > 更新 > 管理更新站点，勾选 Cookbook，然后重启FIJI。
  2. 将活体成像实验获得的数据文件按不同的X、Y坐标拆分为多个独立文件。在Nikon NIS-Elements软件中，选择 文件 > 导入/导出 > 拆分多点，选择导出文件夹及适当的文件前缀。
  3. 打开FIJI，从拆分后的多点文件中加载单个文件。若使用多通道图像，请先拆分通道，然后选择包含488 nm通道（GCaMP）图像的窗口。
  4. 运行DeltaF Up功能，以计算每个像素在相邻时间点之间的信号变化。操作方式为：选择 Cookbook > T函数 > Delta F Up。
  5. 浏览图像序列，找到出现钙波的图像。在显示钙波的情况下，点击 图像 > 调整 > 阈值 设置阈值。调整下限阈值，以尽量减少非钙波信号通过阈值的情况。对于使用上述参数获取的16位图像，建议从下限阈值600开始，并根据实际情况进行调整。
  6. 运行颗粒分析工具以分割钙波，点击 分析 > 分析颗粒。通过调整范围设定钙波的最小面积（单位为 µm2），默认范围为0至无穷大。对于使用20倍物镜获取的MA104细胞图像，建议将下限起始值设为10,000 µm2，并根据需要进行调整。
  7. 勾选 显示结果 和 清除结果 选项。在“显示”下拉菜单中选择 轮廓，然后点击 确定。此操作将生成两个输出：一个名为“结果”的窗口，列出所有检测到的钙波及其面积、平均强度、最小强度和最大强度值（基于ΔF）；另一个窗口标题为“[文件名]的绘图”，包含一个新图像栈，显示已分割钙波的轮廓。利用此图像验证钙波检测效果。如有需要，可调整阈值和面积范围，并重新检查检测结果。
  8. 对于批量处理，可使用附带的宏脚本（补充代码文件1）。使用方法如下：
    1. 按照步骤6.2所述，将多点数据拆分为单个文件。打开FIJI，选择 处理 > 批量处理 > 宏。在“输入”框中指定包含拆分后多点文件的文件夹路径，“输出”框保持空白。
    2. 将 补充代码文件1 中的脚本粘贴至脚本框中，并根据步骤6.5和6.6优化后的参数，调整脚本中的强度阈值和面积阈值。
    3. 点击 处理。处理时间取决于多点数量和计算机处理速度，可能需要30分钟或更长时间。处理完成后，数据将被写入桌面上一个名为“重命名我写入后”的新电子表格文件。输出文件应包含每个多点的钙波计数及钙波参数（面积、平均强度、最小强度、最大强度和强度密度）。

结果

图1A 显示一个BMM包被的穹顶，其中包含已转导并稳定表达GCaMP6s的三维人肠道类器官。图1B 显示同一类器官系在接种后24、48和72小时以单层形式重新铺板的情况。为验证GCaMP6s的功能，使用荧光显微镜对单层类器官每2秒成像一次，持续4分钟，并在约20秒后向培养基中加入100 nM ADP。ADP可诱导内质网释放钙离子，从而升高胞质钙浓度。每次曝光时在488 nm通道检测到的荧光强度如图1C所示。曲线显示，在加入ADP前荧光强度保持稳定基线，加入后出现快速上升，随后逐渐恢复至基线水平。实验同时设置了溶剂对照，以确认该反应为真实的信号事件，而非仅由添加培养基引起的荧光强度变化。

对HIO单层细胞进行划痕处理可提高轮状病毒感染效率。尽管划痕方法有多种，但如图2A所示，沿单层细胞长度方向做单道划痕最有利于获得稳定的感染效果。当使用表达荧光蛋白的轮状病毒重组株时，可在活细胞成像过程中验证感染情况（图2B）。若使用不表达标记蛋白的病毒株，则可在成像后通过免疫荧光染色检测感染。由于HIO单层细胞具有较高的细胞运动性，通常难以长时间追踪单个感染细胞。因此，建议采用终点染色法来确认感染，并确保不同视野之间的感染复数一致（图2C）。

HIO 中的细胞间钙波可以通过定性观察来检测，如图 3A所示。然而，要确定在特定视野中钙波的发生频率，则需要进行定量分析。上述方案第 6 步中描述的成功分割步骤如图 3A所示。该图展示了原始图像（图 3Ai）、减去前一帧像素强度后的图像（图 3Aii），以及最终分割得到的钙波图像（图 3Aiii）。

一旦在成像过程中对每个视野中的钙波完成分割与定量，比较在不同条件下单层细胞中钙波频率往往具有重要意义。条形图中 图3B 显示了模拟感染和轮状病毒接种的单层细胞中每个视野内的钙波总数。本示例包含两种轮状病毒（RV）毒株：一种为人轮状病毒毒株（Ito HRV），另一种为表达mRuby的猴轮状病毒SA11重组毒株（SA11-mRuby）。模拟感染组作为钙波频率的基线对照，未处理的轮状病毒感染单层细胞作为阳性对照，而经药物处理的轮状病毒感染单层细胞则为实验组。通过单因素方差分析（one-way ANOVA），可将药物处理的模拟感染和轮状病毒感染单层细胞（包括使用ADP受体抑制剂BPTU处理的组别）与两种对照条件进行比较。数据表明，BPTU能有效降低细胞间钙波的发生频率。

荧光显微镜、细胞球体比较、GCaMP6s荧光图谱、ADP反应分析。
图1：人空肠类器官中GCaMP6s表达的验证。（A）经慢病毒转导后，表达GCaMP的HIO经过筛选并进行多次传代，图中所示为最近一次传代后第7天的培养物。使用488 nm激光激发时，在15 μL基底膜基质中以三维球体形式铺板的转导HIO显示出明显的GCaMP6s表达（Ai）。采用20倍物镜，以50%激光功率进行50 ms曝光采集图像，随后拼接以显示整个基底膜基质穹顶。同样过程使用4 ms明场曝光完成（Aii）。在明场图像中，穹顶中心较暗的HIO表明培养物已准备就绪，可进行传代。（B）将HIO通过酶消化处理为单细胞悬液，然后以每孔150,000个细胞（直径5 mm）的密度接种于预先包被IV型胶原的成像底板中。接种后72小时，细胞已形成融合的单层，可用于后续实验。为验证GCaMP的功能，使用488 nm滤光片组，以50%激光功率、每2秒采集一次50 ms曝光图像，持续4分钟。（C）此处显示的曲线代表在整个成像过程中，全视野荧光强度相对于首次采集值的归一化结果。约在第20秒（箭头所示），即第十次曝光后，加入100 nM二磷酸腺苷（ADP）以诱导胞质钙离子浓度升高（红色曲线）。加入等体积的1x PBS则未引起显著反应（蓝色曲线）。请点击此处查看该图的放大版本。

静态平衡示意图（含针头）；荧光显微镜；细胞成像与分析。
图 2：划痕HIO单层细胞以促进RV感染。（A）该图展示了一种使用25G针头对单层细胞进行划痕的适宜技术。（B）HIO单层细胞被一种表达mRuby荧光蛋白（品红色，箭头所示）的重组RV毒株感染，从而可识别被感染的细胞。或者，在使用天然存在的RV毒株时，可通过免疫荧光法鉴定感染细胞。（C）所示图像来自4个不同HIO单层细胞在固定后、DAPI染色（蓝色）以及轮状病毒抗原抗体标记（品红色）的结果。两种方法均显示RV感染更倾向于发生在单层细胞的划痕区域附近。请点击此处查看该图的放大版本。

荧光显微镜图像与柱状图；HRV/BPTU研究中的Ca²⁺波分析；统计比较。
图3：RV诱导的细胞间钙波的分割与定量分析。 采用本方案，对表达GCaMP6s的RV感染HIOs在488 nm激发光下的图像每1分钟采集一次，持续16小时。(A) 该图展示了细胞间钙波分割的过程。首先，将每次采集的原始图像（Ai）减去前一时间点（t-1）的像素值，以量化荧光强度的变化（Aii）。随后应用基于实验优化的最低强度增加阈值，以识别显著信号。接着对图像进行过滤，保留最小连续信号区域，从而选择细胞间钙波（Aiii），并排除单个细胞的钙信号。该处理方法可实现对每个视野中钙波的定量分析。在本实验中，单层细胞模型分别进行模拟感染、感染人轮状病毒（HRV）的ITO毒株，或感染一种在非结构蛋白3下游第7基因片段编码mRuby的重组猴轮状病毒（SA11-mRuby）。感染后的单层细胞模型或接受ADP受体抑制剂BPTU处理，或不作处理。随后在8个不同位置进行成像，并利用本方案所述流程对每个视野中的钙波进行定量。条形图上的散点表示在各位置检测到的钙波数量，叠加于标记均值与标准差（SD）的柱状图之上。单因素方差分析（One-way ANOVA）后接Dunnett检验结果显示，两种RV毒株均能显著提高细胞间钙波频率，高于未感染组；而BPTU处理可阻止RV介导的钙波频率升高。**p<0.01，***p<0.001。 请点击此处查看该图的放大版本。

试剂转导对照
Y-27632 (1 mM 储存液)4 μL4 μL
Polybrene (1 mg/μL 储存液)2 μL2 μL
慢病毒可变*
HighWnt-WRNE *参见备注加至 400 μL加至 400 μL

表1：慢病毒转导培养基。通过混合第二列和第三列所示体积的试剂，分别制备转导培养基和对照培养基。目标感染复数（MOI）为每个细胞10个慢病毒转导单位。对于实验室自制的慢病毒，通常需要约25–50 μL浓缩病毒液。大多数商业来源的慢病毒滴度将在分析证书中提供。

补充编码文件 1： ImageJ 宏脚本，用于通过批量处理实现钙波定量。请点击此处下载该文件。

讨论

胞质内 Ca2+ 水平的改变既可能是上皮组织病理变化的原因，也可能是其结果10,16,17。胞质钙离子浓度升高可直接通过激活钙依赖性氯离子通道 TMEM16A 来驱动分泌过程18,19。TMEM16A 在 Ca2+ 刺激下被激活，介导氯离子从细胞顶膜外排，形成渗透梯度，从而促进液体分泌20,21。此外，肠内分泌细胞内 Ca2+ 水平的升高可触发5-羟色胺（血清素）的释放，进而刺激传入感觉神经元，调节肠神经系统内的活动22。Ca2+ 信号还可调节紧密连接，影响上皮屏障功能23,24，并调控肠道干细胞的增殖25。因此，Ca2+ 调控失常可能产生广泛而深远的影响。

许多病毒通过调控细胞质中的 Ca2+ 来创造有利于自身复制的细胞环境26。轮状病毒是肠道上皮细胞中此类机制的典型例子27。轮状病毒非结构蛋白4（NSP4）是一种可传导 Ca2+ 的通道蛋白，能够介导 Ca2+ 从内质网释放到细胞质中28,29。这一过程可刺激自噬，并促进病毒外衣壳的组装30,31,32。轮状病毒感染还会诱导ADP的释放，引发细胞间的 Ca2+ 波动，从而促进致病过程17。其他肠道病毒，包括杯状病毒和肠道病毒，也编码可传导 Ca2+ 的病毒孔道蛋白（viroporin），在感染细胞内引发类似的 Ca2+ 调控紊乱33,34。

活细胞Ca2+成像技术为研究病毒在肠上皮中诱导的信号通路提供了多功能平台。然而，成像数据所得结论的可靠性在很大程度上取决于人肠道类器官（HIOs）的健康状态与质量、合适的成像参数以及严谨的分析方法。

高效慢病毒转导在建立新的类器官（HIO）细胞系时常常是限制性步骤，但使用高滴度慢病毒并进行多次转导有助于确保足够的外源基因表达。重要的是，必须权衡转导过程中可能引发的显著细胞应激反应。这种应激通常为暂时性，在筛选及多次传代后会逐渐消退。尽管如此，在开始实验前，必须确认表达基因编码钙指示剂（GECIs）的HIOs表现出正常的生长和增殖能力。同样，将三维HIOs解离并重铺为单层细胞也会诱导细胞应激。最佳实践是给予单层细胞至少三天或更长时间以适应培养环境。使用IV型胶原包被培养板对维持单层细胞完整性至关重要35,36。将IV型胶原分装后于-80 °C 保存，可有效保证单层细胞的贴附性。确定每种HIO细胞系的最佳接种密度也有助于提高实验重复性。最后，设置适当的对照组，并在不同实验间进行对照比较，对于确保所观察到的现象反映的是目标变量的真实响应，而非技术性干扰因素，具有不可替代的重要性。

尽管划痕处理单层细胞可能导致非预期的细胞损伤，但它能显著增强RV对二维HIO的感染。如图2所示，几乎所有被感染的细胞均紧邻划痕区域。实验证据表明，RV在肠上皮细胞的基底外侧表面感染效率最高37。因此，推测划痕处理通过暴露基底外侧表面而增强了病毒的感染性。高效感染单层细胞也可通过将HIO接种于悬浮在含培养基孔中的聚碳酸酯膜上来实现，这种方法可使病毒接触到基底外侧表面。然而，由于培养板与聚碳酸酯膜之间的距离较长，以及聚碳酸酯膜本身和孔底部的塑料表面，这些装置不适合用于落射荧光成像。因此，本方案中描述的划痕方法仍是首选方案。鉴于划痕处理本身可能引起信号通路的扰动，设置未感染但经过划痕处理的对照组对于结果解读至关重要。对于如人诺如病毒等可通过顶膜高效感染的病毒，则无需对单层细胞进行划痕处理38。

与任何活体成像系统一样，光毒性可能严重影响利用HIO单层细胞进行的实验。在整个成像过程中，必须密切监测是否存在异常空泡化、细胞膜出泡或其他形态学上的应激迹象39。一旦发现上述任何征兆，必须降低激发光的持续时间、频率或强度。提高信噪比往往以牺牲细胞长期健康为代价，因此通过实验经验优化成像参数至关重要。随时间推移荧光基线强度逐渐降低所表现出的光漂白现象，是细胞应激的先兆，应当避免。

成像数据的可视化特性可能导致研究者倾向于进行定性分析而非定量分析。然而，与任何其他技术一样，要得出可重复的结论必须依赖定量分析。定量图像分析所涉及的复杂性远超单篇论文所能涵盖的范围，但强调以下几个关键点仍具有重要意义。首先，定量分析的一致性依赖于成像参数采集的一致性。为特定采集参数集设计的分析流程，可能在频率、曝光时间、激光功率或波长不同的条件下所获取的图像上失效。其次，感染复数（multiplicity of infection）对病毒诱导的钙信号频率具有显著影响。因此，评估每个视野中感染细胞的数量，并确保不同处理条件之间的一致性至关重要。或者，将信号频率按每个视野中的感染细胞数进行归一化，有助于减少误差。最后，尽管近期开发的基于mNG的钙离子探针（NEMO）为测定细胞内绝对Ca2+浓度提供了有前景的方法40，大多数生物传感器仅能提供关于生物系统的相对信息。因此，背景扣除、信号归一化以及与对照组的比较至关重要。

尽管本实验方案侧重于病毒感染过程中的钙成像，但其总体方法具有良好的可扩展性。病毒感染可轻易替换为其他处理条件，且目前已有越来越多的生物传感器可用于监测多种不同的细胞通路和细胞过程。在对任何实验方案进行调整时，研究者都必须优先考虑后续分析，应以明确、可量化的结果为目标来设计实验。

总体而言，活体成像提供了无与伦比的时间分辨率，有助于更精确地表征高度动态的生物学过程。将类器官应用于活体成像实验，可在贴近真实组织、具有生理相关性的模型中观察这些过程。我们希望本文所述的实验方案能够促进实验设计与优化，帮助研究人员揭示细胞与组织信号传导中的新机制。

披露

作者声明无竞争性财务利益。

致谢

本研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01DK115507和R01AI158683（项目负责人：J. M. Hyser）的支持。培训人员的支持来自NIH资助项目F30DK131828（项目负责人：J.T. Gebert）、F31DK132942（项目负责人：F. J. Scribano）和F32DK130288（项目负责人：K.A. Engevik）。我们感谢德克萨斯医学中心消化系统疾病类器官核心实验室提供类器官维持培养基。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
高级DMEM/F12培养基Gibco12634028
[Leu15]-胃泌素ISigma-AldrichG9145
0.05% 胰蛋白酶EDTA Gibco 25300054
0.05% 胰蛋白酶EDTA Gibco 25300054
1.5 mL 微量离心管Fisherbrand5408137
15 mL 锥形离心管Thermofisher Scientific0553859A
16% 甲醛Thermofisher Scientific28906
1 M HEPES缓冲液Gibco15630080
1 M HEPES缓冲液Gibco15630080
1× PBSCorning 21-040-CV
25号针头Thermofisher Scientific1482113D
A-83-01Tocris2939
ADPSigma-Aldrich A2754
高级DMEM/F12培养基Gibco12634028
抗生素-抗真菌剂 Gibco15240062
抗生素-抗真菌剂 Gibco15240062
B27添加剂Gibco17504-044
牛血清白蛋白FisherScientific BP1600100
CellView细胞培养板，聚苯乙烯，75/25 mm，玻璃底，10孔Greiner543979
IV型胶原蛋白Sigma AldrichC5533
DAPIThermofisher ScientificD1306
EDTACorning46-034-CI
胎牛血清 Corning 35010CV
胎牛血清 Corning 35010CV
Fluorobrite培养基GibcoA1896701
GlutaMAX Gibco 35050079
GlutaMAX Gibco 35050079
人表皮生长因子ProteinTechHZ-1326
慢病毒VectorBuilder(variable)
Matrigel基质胶BD Biosceicen356231/CB40230C
N2添加剂Gibco17502-048
N-乙酰半胱氨酸Sigma-AldrichA9165-5G
NH4ClSigma-Aldrich A9434
烟酰胺Sigma-AldrichN0636
Nunc细胞培养处理24孔板Thermofisher Scientific142475
PolybreneMilliporeSigmaTR1003G
SB202190Sigma-AldrichS70767
Triton X-100Fisher BioReagentsBP151100
TrypLE Express酶（无酚红）Thermofisher Scientific12604013
胰蛋白酶Worthington BiochemicalNC9811754
Y-27632Tocris1254

参考文献

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人肠道类器官轮状病毒感染活细胞荧光显微镜钙信号上皮单层细胞旁分泌信号免疫荧光染色落射荧光显微镜
利用基因编码钙指示剂对病毒感染的人肠道类器官单层进行活体钙成像
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