多重环状荧光免疫组化

Summary

多重循环免疫组化允许使用重复抗原抗体孵育、图像扫描以及图像比对和整合同时原 位 检测多个标记物。在这里，我们介绍了使用该技术在肺癌和配对脑转移样本中鉴定免疫细胞底物的操作方案。

Abstract

肿瘤微环境涉及宿主细胞、肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞和脉管系统之间的相互作用。表征和空间组织免疫细胞亚群和靶蛋白对于预后和治疗目的至关重要。这导致了多重免疫组化染色方法的发展。多重荧光免疫组化可同时检测多种标志物，有助于全面了解细胞功能和细胞间相互作用。在本文中，我们描述了多重环荧光免疫组织化学测定的工作流程及其在淋巴细胞亚群定量分析中的应用。多重荧光免疫组化染色遵循与标准免疫组化类似的步骤和试剂，包括抗原修复、环状抗体孵育和福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 组织载玻片上的染色。在抗原-抗体反应过程中，制备来自不同物种的抗体混合物。优化和验证抗原回收时间和抗体浓度等条件，以提高信噪比。该技术是可重复的，可作为免疫治疗研究和临床应用的宝贵工具。

Introduction

脑转移瘤 （BM） 是最常见的中枢神经系统 （CNS） 肿瘤，发生在近一半的非小细胞肺癌 （NSCLC） 病例中，预后不良¹。据估计，10%-20% 的 NSCLC 患者在初始诊断时已经患有 BM，大约 40% 的 NSCLC 病例将在治疗过程中发生 BM²。肿瘤微环境 （TME） 与 NSCLC 的发生和 BM 密切相关，包括各种成分，如血管、成纤维细胞、巨噬细胞、细胞外基质 （ECM）、淋巴样、骨髓来源的免疫细胞和信号分子 ^3,4。微环境免疫细胞在影响癌细胞生长发育方面起着至关重要的作用。脑转移瘤具有许多潜在的治疗靶点，其特征是复杂的免疫微环境和信号传导过程。例如，PD-1 抑制剂作为免疫检查点抑制剂 （ICI） 已显示出对肺癌脑转移 （LCBM） 患者的临床疗效。然而，原发性 NSCLC 和 LCBM⁵ 对 PD-1 治疗的反应频率不同，这表明肿瘤免疫微环境充当关键的 ICI 调节因子。

免疫组化 （IHC） 是生物学、基础医学和病理学领域的宝贵工具⁶.该检测方法通过抗原-抗体在组织载玻片上的相互作用来可视化抗原表达⁷。IHC 用于诊断预测标志物、评估预后标志物、指导靶向治疗和探索肿瘤细胞的生物学功能⁸。然而，传统的 IHC 方法一次只能检测一种生物标志物。为了解决这一局限性，免疫组织化学技术的创新导致了多重荧光免疫组织化学 （mfIHC） 的发展，它允许在同一组织载玻片上同时识别多个蛋白质标记物，包括明场和荧光场⁹。这一进展提供了对 TME 内基质细胞、免疫细胞和癌细胞之间的细胞组成和分子相互作用的准确分析。

在这项研究中，我们提出了一种多重环状免疫组织化学方案，以分析免疫细胞的空间分布。同时选择兔和大鼠等两种不同物种的一抗进行孵育，然后进行荧光标记的二抗。抗原修复在每轮抗原抗体反应后进行。阻断自发荧光，并使用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行染色。该panel包括CD3、CD8、CD20和CK的顺序检测，细胞根据标记物分类:肿瘤细胞（CK+）、成熟T细胞（CD3+）、细胞毒性T细胞（CD3+CD8+）、B细胞（CD20+）^10,11。

Protocol

该研究获得了云南省肿瘤医院/昆明医科大学第三附属医院医学伦理委员会的批准。所有受试者/法定监护人均签署知情同意书。

1. 载玻片准备

1. 使用切片机切割含有原发性肺肿瘤或肺癌脑转移细胞的成对石蜡块切片，厚度为 4 μm。将切片取出到水中并用镊子分离，选择最好的切片并将其粘附在聚赖氨酸涂层的载玻片上。
2. 将组织载玻片置于65°C的烘箱中30分钟，以增强组织粘附。
3. 通过三次更换将载玻片浸入二甲苯中，每次持续 10 分钟。
4. 逐渐降低酒精浓度，将载玻片在100%乙醇中孵育5分钟，在90%乙醇中孵育5分钟，在75%乙醇中孵育5分钟，并在去离子水中孵育3分钟。

2. 热诱导表位检索 （HIER）

1. 在去离子水中将100x柠檬酸钠缓冲溶液（pH 6.0）稀释至1x（10mM），制备足够的缓冲溶液以完全浸没载玻片。
2. 将载玻片放入压力锅中，使其在高温（100°C）和压力（~30psi）下2分钟。加热后，让载玻片在蒸馏水中冷却至室温3分钟。
3. 将一包52g磷酸盐缓冲盐水（PBS;粉末状）溶解在5L去离子水中，用于制备PBS缓冲溶液（pH 7.0）。将载玻片置于PBS缓冲溶液中5分钟，更换3次。

3.过氧化物酶阻断

1. 用3%过氧化氢覆盖切片，并在室温下孵育10分钟。在PBS中冲洗载玻片，每次3次，每次5分钟。
2. 使用滤纸将多余的水从纸巾周边吸收。同时，确保组织是湿润的。

4. 第一轮一抗孵育

1. 制备CD8（兔单克隆抗体，克隆SP16）和CD20（小鼠单克隆抗体，克隆L26）的一抗的工作混合物，在Bond一抗稀释剂中以1:50稀释。
2. 将抗体复合物加入切片上，并在室温下孵育1小时。
3. 制备 0.1% 吐温/磷酸盐缓冲盐水溶液:1 mL 吐温在 1 L PBS 缓冲溶液中。
4. 用 0.1% 吐温/磷酸盐缓冲盐水洗涤切片，每次 3 次，每次 5 分钟。使用滤纸将多余的水从纸巾周边吸走，同时确保纸巾湿润。

5. 第一轮二抗孵育

1. 制备荧光标记的山羊抗兔抗体（激发（Ex）:495nm）和山羊抗小鼠抗体（Ex:578nm）的混合物，在磷酸盐缓冲盐水中按1:50稀释。山羊抗兔抗体附着在CD8的一抗上，山羊抗小鼠抗体附着在CD20的一抗上。
2. 滴加二抗混合物，在室温下孵育1小时。

6. 热诱导表位修复和过氧化物酶阻断

1. 在去离子水中将100x柠檬酸钠（pH 6.0）稀释至1x（10mM），制备足够的缓冲溶液以完全浸没载玻片。
2. 将载玻片放入高压锅中，并在高温（100°C）和压力（~30psi）下放置1分钟。加热后，将载玻片放入蒸馏水中冷却至室温3分钟。
3. 按照步骤 3 中的说明执行过氧化物酶阻断。

7. 第二轮一抗孵育

1. 制备CD3（兔单克隆抗体，克隆SP7）和CK（小鼠单克隆抗体，MX005）一抗的工作混合物，在一抗稀释剂中以1:50稀释。
2. 将抗体复合物加入切片上，并在室温下孵育1小时。
3. 用 0.1% 吐温/磷酸盐缓冲盐水洗涤，每次 3 次，每次 5 分钟。使用滤纸将多余的水从纸巾周边吸走，同时确保纸巾湿润。

8. 第二轮二抗孵育

1. 制备山羊抗兔（Ex:652nm）和山羊抗小鼠抗体（Ex:590nm）混合物，在磷酸盐缓冲盐水中1:50稀释。山羊抗兔抗体附着在CD3的一抗上，山羊抗小鼠抗体附着在CK的一抗上。
2. 滴加二抗混合物，在室温下孵育1小时。用 0.1% 吐温/磷酸盐缓冲盐水洗涤，每次 3 次，每次 5 分钟。

9. 自发荧光猝灭和DAPI染色

1. 将试剂（0.15 M / L KMnO₄）加入组织切片1分钟。用流水冲洗 5 分钟。
   注意:KMnO₄ 有毒并损害皮肤。处理载玻片时请务必戴上手套。如果液体滴到皮肤上，请用干净的餐巾纸迅速擦拭干净，然后用流动的水冲洗。
2. 用浓度增加的酒精（70%，90%，100%）干燥载玻片，每种浓度3分钟。
3. 添加 DAPI 和盖玻片进行多光谱成像。DAPI的量取决于组织大小。添加盖玻片后，确保组织完全被 DAPI 覆盖。

10. 幻灯片扫描

1. 将载玻片放在托盘上并推动，直到无法进一步推动。
2. 要启动程序，请双击桌面上的 程序图标 。在启动过程中，将显示模式选择窗口。选择窗口显示两种明场和荧光模式:自动模式和手动模式。在荧光扫描模式下，单击 自动模式。
3. 将鼠标光标移到 ？ 按钮显示有关设置的信息。单击" 过滤器设置">"过滤器通道 "以选择 "伪颜色">"通道号"。定义颜色并保存。
4. 单击" 例行工作">"扫描模式">"全自动"。单击 "例行工作">"幻灯片名称 "以定义输出的幻灯片名称。单击 "日常工作">"通道设置 "以选择过滤器。
5. 单击 "常规工作">"扫描选项" 以确定虚拟幻灯片的最终质量和存储位置。
6. 单击 "预览 "进行阈值设置和选择要扫描的范围。
7. 单击 "硬件>滤镜">"实时>"自动对焦">"自动曝光">"数字增益">"滴答声"使用手动曝光时间>"滴答声"限制范围>设置电流。
8. 单击 "例行工作">"开始扫描"。选择放大倍率为 20 倍或 40 倍。选择 20x 以获得适当的文件大小。MRXS扩展由3D Pannoramic MIDI扫描仪定义。图像扩展也可以更改为 TIFF 图像。
9. 单击" 幻灯片查看器">"多视图工具箱 "以选择用于共聚焦的图像，然后对齐和集成图像。

11. 细胞密度的定量评估

1. 使用 Halo 10 扫描仪软件量化肿瘤和基质区域中阳性免疫细胞（CD3+、CD3+CD8+、CD20+）的百分比。验证 CK 染色以确定肿瘤组织。

Results

我们提出了一种在单张载玻片上使用 5 色多重荧光进行环状抗原检测的方案。通过对检测方法的优化，我们可以孵育来自不同物种的两种抗体（图1）。实验程序所需的设备包括压力锅和免疫染色盒（图2A）。

完成测定后，我们在扫描载玻片之前定义四个标记的伪颜色。CD3、CD8、CD20和CK的伪颜色分别为黄色、红色、绿色和青色。细胞核用DAPI标记。选择肿瘤和基质的代表性区域进行分析。使用 3D 自动数字载玻片扫描仪捕获 495 nm、578 nm、652 nm 和 590 nm 处的荧光光谱。肺癌脑转移组织中的代表性堆栈图像和单标记图像如 图2B所示。基于包含单标记荧光信号的图像，扫描仪软件基于伪色提取细胞表型特征。还计算了相应数量的阳性免疫细胞和总免疫细胞。通过计算 H 值¹² 来量化检测组织中的每个染色蛋白质水平。在这些程序之后，计数和分析每种肿瘤浸润淋巴细胞类型的数量以及每种细胞类型在靶细胞总数中的比例。每种免疫细胞类型的比例表示肿瘤浸润淋巴细胞的有效百分比。与原发性肺癌切片相比，分析了肺癌脑转移瘤中 CD3+、CD3+CD8+ T 细胞和 CD20+ B 细胞的百分比。代表性结果如 图 3 所示。在肺癌脑转移中，免疫细胞（CD3+ T细胞、CD3+ CD8+ T细胞）的密度低于原发性肺癌。CD20+ B 细胞在脑转移组中高于原发性肺癌组。然而，对于有限的样本，这两组之间的结果没有显着差异。

图 1:多重环状荧光免疫组化染色的工作流程。 将 4 μm 切片切割并粘附在胶粘剂载玻片上。执行以下操作步骤:脱蜡和再液化、抗原修复、抗原修复、抗原封闭、一抗混合物孵育、二抗孵育，然后重复抗原修复、抗原封闭、一抗混合物孵育和二抗孵育的步骤，然后减少自发荧光，选择合适的过滤器进行载玻片扫描并分析结果。 请点击这里查看此图的较大版本.

图2:多重荧光免疫组化染色的操作方法。 抗原处理是通过在高压锅中加热部分来进行的。（A） 高压锅用于热诱导表位检索。在抗体孵育过程中，将载玻片置于免疫染色盒中。（B） 用于肺癌脑转移组织的面板的代表性合成和单染色图像。 请点击这里查看此图的较大版本.

图3:原发性肺癌和肺癌脑转移瘤中的免疫细胞比例。 CD3+、CD3+CD8+、CD20+免疫细胞在四个肺癌脑转移组织中的比例低于配对的原发性肺癌组织（误差线:标准差）。 请点击这里查看此图的较大版本.

Discussion

我们已经描述了多重环状荧光免疫组化染色的过程。一抗选择是荧光免疫组化测定的一个关键方面，建议使用单克隆抗体以获得更好的特异性和可重复性。为了优化一抗的工作浓度，通过免疫组化实验测试了一系列稀释液。阳性对照（评估靶抗原表达）和阴性对照（无一抗孵育）都是必不可少的，应进行设置。

在该方案中，一抗被稀释并制备为来自不同物种的混合物。荧光标记的二抗也以相同的方式合并和孵育，来源于不同的物种。因此，关键步骤是根据抗原选择不同一抗的种类，与多克隆抗体相比，单克隆抗体是首选。这些可以确保一抗和二抗之间的组合具有特异性。混合液体应达到两种一抗的工作浓度，并且两种抗体之间不应同时存在交叉反应性。如果一抗属于同一物种，则先孵育一种二抗，然后孵育第二种二抗。在确定panel中一抗孵育的顺序时，应优先考虑对抗原-抗体反应敏感的抗体，对于低表达抗原，强度在第二次表位检索期间会增强。在第二轮抗体孵育之前，与第一次手术（2 分钟）相比，重复抗原修复所需的时间（1 分钟）更少。即使切片经过两次热诱导修复，先前循环染色的荧光强度也不会降低。为了避免非特异性免疫反应性，需要优化孵育条件，包括抗体工作浓度、孵育时间和环境温度。

近几十年来，各种表位修复方法被开发出来，主要分为热诱导表位修复（HIER）和蛋白酶诱导的表位修复（PIER）。加热是一种有效的抗原修复方法，可暴露抗原表位，使其更有效地被抗体^{检测 13}。抗原修复的两种主要选择基于柠檬酸盐缓冲液和高 pH EDTA 缓冲液¹⁴。根据靶抗原确定优化的检索条件。

自发荧光会干扰由内源性荧光团和组织处理中使用的试剂引起的切片上的荧光成像¹⁵。洗脱需要使用相关试剂。选择具有发射峰的荧光团，避免自发荧光峰（约490nm）^16,17。据报道，苏丹黑 B 和 NaBH4 可淬灭组织自发荧光^18,19。Sudan Black B 和 NaBH4 的组合降低了靶向肾福尔马林固定石蜡包埋组织中的荧光背景²⁰。在该方案中，KMnO₄浓度为0.15 M/L的组织处理可节省1分钟的时间，KMnO₄覆盖在组织上一层以屏蔽自发荧光并减少背景荧光，检测蛋白质的特异性染色更加可视化。

整个载玻片在四个不同的滤光片通道中扫描，图像对齐分析是必要的，对齐单细胞和亚细胞结构的定位是一个巨大的挑战。对于这种技术的多光谱图像，需要专业的光成像设备和定量分析软件来避免光谱串扰。仪器的昂贵成本限制了其应用。两种抗体的共孵育可节省时间，尤其是在处理需要 3 个周期孵育的 6 标记组合时。该技术用于可视化肿瘤免疫微环境中免疫细胞的更详细表征。未来，该方法将应用于肿瘤相关三级淋巴结构的定量分析。

总之，多重环荧光免疫组化能够通过单个载玻片上单独标记的荧光团对多个靶标进行染色。该测定法有助于更好地了解肿瘤免疫微环境中细胞的空间分布，并且肿瘤免疫细胞的空间接近性有助于筛选将从免疫治疗中受益的患者。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15 mol/L KmnO4	迈信生物科技有限公司	MST-8005
100x 柠檬酸钠	迈信生物科技有限公司	MVS-0100
3% 过氧化氢	迈信生物科技有限公司	SP KIT-A1
3D 全景 MIDI	3D 海斯泰克有限公司	全景MIDI 1.18
Alexa Fluor 488	Abcam	ab150113
Alexa Fluor 568	Abcam	ab175701
Alexa Fluor 594	Abcam	ab150116
Alexa Fluor 647	Abcam	ab150079
Bond 一抗稀释剂	Lecia	AR9352
CD20	麦心生物科技有限公司	kit-0001
CD3	麦心生物科技有限公司	kit-0003
CD8	迈欣生物科技有限公司	RMA-0514
CK	迈欣生物科技有限公司	MAB-0671，DAPI
	sig-马	D8417
乙醇	国药集团化学试剂有限公司	10009218
Histocore Multicut	lecia	2245
PBS（粉末）	迈信生物科技有限公司	PBS-0061
载玻片过滤器	3D histech Ltd
二甲苯	国药集团化学试剂有限公司	10023418