多重循环免疫组织化学技术能够 原位 通过重复的抗原-抗体孵育、图像扫描以及图像对齐与整合，实现多种标志物的同步检测。本文介绍了利用该技术在肺癌及配对的脑转移样本中鉴定免疫细胞亚群的操作流程。
本文内容
摘要
摘要
肿瘤微环境涉及宿主细胞、肿瘤细胞、免疫细胞、间质细胞以及脉管系统之间的相互作用。对免疫细胞亚群和靶蛋白进行表征及空间定位分析，对于预后判断和治疗决策至关重要。这推动了多重免疫组织化学染色技术的发展。多重荧光免疫组织化学可实现多个标志物的同步检测，有助于全面理解细胞功能及细胞间相互作用。本文介绍了一种多重循环荧光免疫组织化学检测的工作流程及其在淋巴细胞亚群定量分析中的应用。该多重循环荧光免疫组织化学染色方法在步骤和试剂使用上与常规免疫组织化学相似，包括抗原修复、循环抗体孵育以及在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片上的染色过程。在抗原-抗体反应中，配制来自不同物种抗体的混合液。通过优化并验证抗原修复时间、抗体浓度等条件，以提高信噪比。该技术具有良好的可重复性，是免疫治疗研究和临床应用中的重要工具。
引言
脑转移瘤（BM）是最常见的中枢神经系统（CNS）肿瘤，在非小细胞肺癌（NSCLC）病例中接近半数会发生脑转移，预后较差1。据估计，约10%–20%的NSCLC患者在初次诊断时已存在脑转移，而在治疗过程中，约40%的NSCLC患者将发生脑转移2。肿瘤微环境（TME）与NSCLC的发生及脑转移密切相关，包含多种组分，如血管、成纤维细胞、巨噬细胞、细胞外基质（ECM）、淋巴细胞、骨髓来源的免疫细胞以及信号分子3,4。微环境中的免疫细胞在影响癌细胞生长与发展中起关键作用。脑转移瘤具有复杂的免疫微环境和信号通路，呈现出众多潜在的治疗靶点。例如，PD-1抑制剂作为免疫检查点抑制剂（ICI），在肺癌脑转移（LCBM）患者中已显示出临床疗效。然而，PD-1治疗在原发性NSCLC与LCBM患者中的应答频率存在差异5，提示肿瘤免疫微环境在调控ICI反应中起关键作用。
免疫组织化学（IHC）是生物学、基础医学和病理学领域中一种不可或缺的工具6。该检测方法通过抗原-抗体在组织切片上的相互作用来可视化抗原的表达7。IHC 可用于诊断预测性标志物、评估预后标志物、指导靶向治疗以及探索肿瘤细胞的生物学功能8。然而，传统的 IHC 方法一次只能检测一种生物标志物。为克服这一局限性，免疫组织化学技术的创新推动了多重荧光免疫组织化学（mfIHC）的发展，该技术可在同一张组织切片上同时识别多种蛋白质标志物，既适用于明场也适用于荧光场9。这一进步使得对肿瘤微环境（TME）中基质细胞、免疫细胞和癌细胞之间的细胞组成及分子相互作用进行精确分析成为可能。
本研究中，我们介绍了一种用于分析免疫细胞空间分布的多重循环免疫组织化学方案。选择来自不同物种的两种一抗（如兔源和大鼠源）同时孵育，随后使用荧光标记的二抗进行检测。每轮抗原-抗体反应后均进行抗原修复。阻断自发荧光后，使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行染色。该方案依次检测CD3、CD8、CD20和CK；根据标志物将细胞分类为：肿瘤细胞（CK+）、成熟T细胞（CD3+）、细胞毒性T细胞（CD3+CD8+）以及B细胞（CD20+）10,11。
方案
研究经昆明医科大学第三附属医院/云南省肿瘤医院医学伦理委员会批准。所有受试者/法定监护人均签署了知情同意书。
1. 载玻片制备
- 使用切片机将含有原发性肺癌或肺癌脑转移细胞的配对石蜡包埋组织切成 4 µm 厚的切片。将切片转移至水中，用镊子分开，选择最佳切片并贴附于多聚赖氨酸包被的载玻片上。
- 将组织切片置于 65 °C 烤箱中孵育 30 分钟，以增强组织黏附性。
- 将切片浸入二甲苯中，更换三次，每次持续 10 分钟。
- 逐步降低酒精浓度，依次在 100% 乙醇中孵育 5 分钟、90% 乙醇中孵育 5 分钟、75% 乙醇中孵育 5 分钟，最后在去离子水中孵育 3 分钟。
2. 热诱导表位修复（HIER）
- 将100倍浓度的柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）用去离子水稀释至1倍（10 mM），配制足够体积的缓冲液以完全浸没载玻片。
- 将载玻片放入压力锅中，在高温（100 °C）和高压（约30 psi）条件下处理2分钟。加热结束后，将载玻片转移至蒸馏水中，冷却至室温，持续3分钟。
- 将一包52 g的磷酸盐缓冲液（PBS；粉末）溶解于5 L去离子水中，配制PBS缓冲液（pH 7.0）。将载玻片置于PBS缓冲液中浸泡5分钟，共更换3次缓冲液。
3. 过氧化物酶阻断
- 用3%过氧化氢覆盖切片，在室温下孵育10分钟。用PBS冲洗载玻片，每次5分钟，共冲洗3次。
- 用滤纸从组织边缘吸去多余的水分，同时确保组织保持湿润。
第一轮一抗孵育
- 配制CD8（兔单克隆抗体，克隆号SP16）和CD20（小鼠单克隆抗体，克隆号L26）一抗工作液，用Bond一抗稀释液按1:50比例稀释。
- 将抗体复合物加至切片上，室温孵育1小时。
- 配制0.1% Tween/磷酸盐缓冲液（PBS）：在1 L PBS缓冲液中加入1 mL Tween。
- 用0.1% Tween/PBS缓冲液洗涤切片，每次5分钟，共洗3次。用滤纸从组织周围吸去多余液体，同时确保组织保持湿润。
第一轮二抗孵育
- 配制荧光标记的山羊抗兔抗体（激发波长 (Ex)：495 nm）和山羊抗小鼠抗体（激发波长 (Ex)：578 nm）的混合液，用磷酸盐缓冲液按 1:50 稀释。山羊抗兔抗体与 CD8 的一抗结合，山羊抗小鼠抗体与 CD20 的一抗结合。
- 将二抗混合液逐滴加入，室温孵育 1 小时。
6. 热诱导表位修复与过氧化物酶阻断
- 将100倍浓度的柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）用去离子水稀释至1倍浓度（10 mM），配制足够体积的缓冲液以完全浸没切片。
- 将切片放入压力锅中，在高温（100 °C）和高压（约30 psi）条件下处理1分钟。加热结束后，将切片转移至蒸馏水中冷却至室温，持续3分钟。
- 按步骤3所述进行过氧化物酶阻断处理。
7. 第二轮一抗孵育
- 配制CD3（兔单克隆抗体，克隆号SP7）和CK（小鼠单克隆抗体，克隆号MX005）一抗工作液，按1:50比例用一抗稀释液稀释。
- 将抗体复合物加至切片上，室温孵育1小时。
- 用0.1%吐温/磷酸盐缓冲液洗涤，每次5分钟，共洗3次。用滤纸从组织周围吸去多余液体，同时确保组织保持湿润。
8. 第二轮二抗孵育
- 配制山羊抗兔（激发波长：652 nm）和山羊抗小鼠抗体（激发波长：590 nm）混合液，用磷酸盐缓冲液按1:50稀释。山羊抗兔抗体与CD3的一抗结合，山羊抗小鼠抗体与CK的一抗结合。
- 将二抗混合液滴加至样本上，室温孵育1小时。用含0.1% Tween的磷酸盐缓冲液洗涤，每次5分钟，共洗3次。
9. 自发荧光淬灭与DAPI染色
- 向组织切片中加入试剂（0.15 M/L KMnO4），作用1分钟。用流动水冲洗5分钟。
注意：KMnO4具有毒性，可损伤皮肤。操作载玻片时务必佩戴手套。若液体滴溅至皮肤，应立即用干净纸巾擦去，并用流动水彻底冲洗。 - 依次使用浓度递增的酒精（70%、90%、100%）对载玻片进行脱水处理，每种浓度处理3分钟。
- 加入DAPI并加盖盖玻片，用于多光谱成像。DAPI用量取决于组织大小。加盖盖玻片后，应确保组织完全被DAPI覆盖。
10. 载玻片扫描
- 将载玻片放置于载物盘上，并推进至无法继续推进为止。
- 要启动程序，请双击桌面上的 程序图标。启动过程中将显示模式选择窗口。该窗口提供两种明场和荧光模式：自动模式与手动模式。在荧光扫描模式下，点击 自动模式。
- 将鼠标指针悬停在 ？ 按钮上，以查看相关设置信息。点击 滤光片设置 > 滤光通道，选择 通道编号 > 伪彩色。定义颜色后保存。
- 点击 常规工作 > 扫描模式 > 全自动。点击 常规工作 > 载玻片名称，以定义输出文件的载玻片名称。点击 常规工作 > 通道设置，以选择滤光片。
- 点击 常规工作 > 扫描选项，以确定虚拟载玻片的输出质量及存储位置。
- 点击 预览，进行阈值设定并选择需要扫描的区域范围。
- 点击 硬件 > 滤光片 > 实时成像 > 自动对焦 > 自动曝光 > 数字增益 > 勾选使用手动曝光时间 > 勾选限制范围 > 设为当前值。
- 点击 常规工作 > 开始扫描。选择放大倍数为 20x 或 40x。为获得合适的文件大小，建议选择 20x。MRXS 扩展名由 3D Pannoramic MIDI 扫描仪定义，图像格式也可更改为 TIFF 格式。
- 点击 载玻片查看器 > 多视图工具箱，选择共聚焦图像，然后进行图像对齐与整合。
11. 细胞密度的定量评估
- 使用 Halo 10 扫描仪软件量化肿瘤和间质区域中阳性免疫细胞（CD3+、CD3+CD8+、CD20+）的百分比。通过验证 CK 染色以界定肿瘤组织。
结果
我们介绍一种在单张切片上使用五色多重荧光进行循环抗原检测的实验方案。通过优化该检测方法，我们实现了来自不同物种的两种抗体的同时孵育（图1）。实验所需的设备包括压力锅和免疫染色盒（图2A）。
完成检测后，在扫描切片前我们定义四种标记物的伪彩色。CD3、CD8、CD20 和 CK 的伪彩色分别为黄色、红色、绿色和青色。细胞核使用 DAPI 标记。选择肿瘤和间质的代表性区域进行分析。使用 3D 自动数字切片扫描仪在 495 nm、578 nm、652 nm 和 590 nm 处捕获荧光光谱。肺癌脑转移组织中的代表性层叠图像和单标记图像如图 2B所示。根据包含单一标记物荧光信号的图像，扫描仪软件基于伪彩色提取细胞表型特征。同时统计相应阳性免疫细胞数量和总免疫细胞数量。通过计算 H-score12，对检测组织中每种染色蛋白的表达水平进行定量。完成上述步骤后，统计并分析每种肿瘤浸润淋巴细胞类型的数量，以及每种细胞类型在总靶细胞数中所占的比例。每种免疫细胞类型的比例代表了肿瘤浸润淋巴细胞的有效百分比。分析比较了肺癌脑转移组织与原发性肺癌组织中 CD3+、CD3+CD8+ T 细胞和 CD20+ B 细胞的百分比。代表性结果如图 3所示。在肺癌脑转移组织中，免疫细胞（CD3+ T 细胞、CD3+CD8+ T 细胞）的密度低于原发性肺癌组织。脑转移组中 CD20+ B 细胞的比例高于原发性肺癌组。然而，由于样本量有限，这两组之间的差异无统计学意义。
图1：多重循环荧光免疫组织化学染色的工作流程。 切取4 µm厚的组织切片并贴附于粘附性载玻片上，随后进行以下操作步骤：脱蜡与复水、抗原修复、再次抗原修复、抗原封闭、一抗混合物孵育、二抗孵育，然后重复进行抗原修复、抗原封闭、一抗混合物孵育和二抗孵育步骤，最后进行降低自发荧光处理，选择合适的滤光片进行切片扫描并分析结果。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：多重荧光免疫组织化学染色的操作方法。 抗原处理通过在压力锅中加热切片完成。（A）使用压力锅进行热诱导表位修复。在抗体孵育过程中，将载玻片置于免疫组化染色盒中。（B）用于肺癌脑转移组织的抗体组合的代表性复合染色及单染图像。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：原发性肺癌与肺癌脑转移组织中免疫细胞比例。 四例肺癌脑转移组织中CD3+、CD3+CD8+、CD20+免疫细胞的比例均低于配对的原发性肺癌组织（误差线：标准差）。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
我们已描述了多重循环荧光免疫组织化学染色的流程。一抗的选择是荧光免疫组织化学检测中的关键环节，建议使用单克隆抗体以获得更高的特异性和可重复性。为了优化一抗的工作浓度，需通过免疫组织化学实验测试一系列稀释梯度。必须设置阳性对照（用于评估靶抗原表达）和阴性对照（不加一抗孵育）。
在本实验方案中，针对不同物种来源的一抗进行稀释并配制混合液。荧光标记的二抗同样来自不同物种，并以相同方式混合后孵育。因此，关键步骤是根据抗原选择不同物种来源的一抗，且优先选用单克隆抗体而非多克隆抗体。这些措施可确保一抗与二抗之间的结合具有特异性。混合液应达到两种一抗各自的工作浓度，且两种抗体之间不应存在交叉反应。若两种一抗来自同一物种，则需先孵育其中一种二抗，再孵育另一种。在确定多联抗体孵育顺序时，应优先考虑对抗原-抗体反应敏感的抗体；对于低表达抗原，第二次表位修复可增强信号强度。在进行第二轮抗体孵育前，重复抗原修复所需时间较首次操作更短（1分钟 vs 首次的2分钟）。即使切片经历两次热诱导修复，前一轮循环染色产生的荧光信号强度也不会减弱。为避免非特异性免疫反应，需优化孵育条件，包括抗体工作浓度、孵育时间及环境温度。
近几十年来，已开发出多种表位修复方法，主要分为热诱导表位修复（HIER）和蛋白酶诱导表位修复（PIER）。加热是一种高效的抗原修复方法，可暴露抗原表位，使其更有效地被抗体检测13。抗原修复的两种主要选择基于柠檬酸盐缓冲液和高pH值EDTA缓冲液14。最佳修复条件需根据靶抗原确定。
自发荧光可能干扰组织切片的荧光成像，其来源包括内源性荧光物质以及组织处理过程中使用的试剂15需要使用相关试剂进行洗脱。选择的荧光染料其发射峰应避开自发荧光峰（约490 nm）。16,17苏丹黑B和NaBH4已被报道用于淬灭组织自发荧光18,19苏丹黑B与NaBH4联用可降低靶向肾组织福尔马林固定石蜡包埋切片中的荧光背景20. 在本方案中，高锰酸钾（KMnO₄）处理组织的方法4 在0.15 M/L浓度下，KMnO₄可节省1分钟时间。4 在组织上形成一层覆盖层，用于屏蔽自发荧光并降低背景荧光，从而使检测蛋白的特异性染色更易于观察。
整张切片需在四种不同的滤光通道中进行扫描，因此必须进行图像配准分析，而对单细胞及亚细胞结构的位置进行对齐具有很大挑战性。对于该技术产生的多光谱图像，需要专业的光学成像设备和定量分析软件，以避免光谱串扰。仪器的高昂成本限制了其广泛应用。两种抗体共孵育可节省时间，尤其是在处理包含6种标记物的检测 panel 时，该方法仅需3个孵育循环。该技术用于可视化肿瘤免疫微环境中免疫细胞的更精细特征。未来，该方法将被应用于肿瘤相关三级淋巴结构的定量分析。
综上所述，多重循环荧光免疫组织化学技术能够在单张切片上利用不同标记的荧光染料对多个靶标进行染色。该检测方法有助于更深入理解肿瘤免疫微环境中细胞的空间分布，而肿瘤细胞与免疫细胞之间的空间邻近性有助于筛选可能从免疫治疗中获益的患者。
披露
作者声明，他们不存在任何已知的相互竞争的财务利益或个人关系，这些利益或关系可能被认为影响了本文所报告的工作。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（编号：81860413，81960455）、云南省科技厅基金（202001AY070001-080）以及云南省教育厅科研基金（2019J1274）的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.15 mol/L KmnO4 | 迈新生物技术有限公司 | MST-8005 | |
| 100x 柠檬酸钠 | 迈新生物技术有限公司 | MVS-0100 | |
| 3% 过氧化氢 | 迈新生物技术有限公司 | SP KIT-A1 | |
| 3D 全景 MIDI | 3D histech Ltd | Pannoramic MIDI 1.18 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150113 | |
| Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175701 | |
| Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150116 | |
| Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150079 | |
| 一抗稀释液 | Lecia | AR9352 | |
| CD20 | 迈新生物技术有限公司 | kit-0001 | |
| CD3 | 迈新生物技术有限公司 | kit-0003 | |
| CD8 | 迈新生物技术有限公司 | RMA-0514 | |
| CK | 迈欣生物技术有限公司 | MAB-0671 | |
| DAPI | sig-ma | D8417 | |
| 乙醇 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10009218 | |
| Histocore Multicut | lecia | 2245 | |
| PBS（粉末） | 迈新生物技术有限公司 | PBS-0061 | |
| 载玻片观察器 | 3D histech Ltd | ||
| 二甲苯 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10023418 |
参考文献
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重印与许可
