多重循环免疫组织化学技术能够 原位 通过重复的抗原-抗体孵育、图像扫描以及图像对齐与整合，实现多种标志物的同步检测。本文介绍了利用该技术在肺癌及配对的脑转移样本中鉴定免疫细胞亚群的操作流程。
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本文内容
摘要
摘要
肿瘤微环境涉及宿主细胞、肿瘤细胞、免疫细胞、间质细胞以及脉管系统之间的相互作用。对免疫细胞亚群和靶蛋白进行表征及空间定位分析，对于预后判断和治疗决策至关重要。这推动了多重免疫组织化学染色技术的发展。多重荧光免疫组织化学可实现多个标志物的同步检测，有助于全面理解细胞功能及细胞间相互作用。本文介绍了一种多重循环荧光免疫组织化学检测的工作流程及其在淋巴细胞亚群定量分析中的应用。该多重循环荧光免疫组织化学染色方法在步骤和试剂使用上与常规免疫组织化学相似，包括抗原修复、循环抗体孵育以及在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片上的染色过程。在抗原-抗体反应中，配制来自不同物种抗体的混合液。通过优化并验证抗原修复时间、抗体浓度等条件，以提高信噪比。该技术具有良好的可重复性，是免疫治疗研究和临床应用中的重要工具。
引言
脑转移瘤（BM）是最常见的中枢神经系统（CNS）肿瘤，在非小细胞肺癌（NSCLC）病例中接近半数会发生脑转移，预后较差1。据估计，约10%–20%的NSCLC患者在初次诊断时已存在脑转移，而在治疗过程中，约40%的NSCLC患者将发生脑转移2。肿瘤微环境（TME）与NSCLC的发生及脑转移密切相关，包含多种组分，如血管、成纤维细胞、巨噬细胞、细胞外基质（ECM）、淋巴细胞、骨髓来源的免疫细胞以及信号分子3,4。微环境中的免疫细胞在影响癌细胞生长与发展中起关键作用。脑转移瘤具有复杂的免疫微环境和信号通路，呈现出众多潜在的治疗靶点。例如，PD-1抑制剂作为免疫检查点抑制剂（ICI），在肺癌脑转移（LCBM）患者中已显示出临床疗效。然而，PD-1治疗在原发性NSCLC与LCBM患者中的应答频率存在差异5，提示肿瘤免疫微环境在调控ICI反应中起关键作用。
免疫组织化学（IHC）是生物学、基础医学和病理学领域中一种不可或缺的工具6。该检测方法通过抗原-抗体在组织切片上的相互作用来可视化抗原的表达7。IHC 可用于诊断预测性标志物、评估....
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方案
研究经昆明医科大学第三附属医院/云南省肿瘤医院医学伦理委员会批准。所有受试者/法定监护人均签署了知情同意书。
1. 载玻片制备
- 使用切片机将含有原发性肺癌或肺癌脑转移细胞的配对石蜡包埋组织切成 4 µm 厚的切片。将切片转移至水中，用镊子分开，选择最佳切片并贴附于多聚赖氨酸包被的载玻片上。
- 将组织切片置于 65 °C 烤箱中孵育 30 分钟，以增强组织黏附性。
- 将切片浸入二甲苯中，更换三次，每次持续 10 分钟。
- 逐步降低酒精浓度，依次在 100% 乙醇中孵育 5 分钟、90% 乙醇中孵育 5 分钟、75% 乙醇中孵育 5 分钟，最后在去离子水中孵育 3 分钟。
2. 热诱导表位修复（HIER）
- 将100倍浓度的柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）用去离子水稀释至1倍（10 mM），配制足够体积的缓冲液以完全浸没载玻片。
- 将载玻片放入压力锅中，在高温（100 °C）和高压（约30 psi）条件下处理2分钟。加热结束后，将载玻片转移至蒸馏水中，冷却至室温，持续3分钟。
- 将一包52 g的磷酸盐缓冲液（PBS；粉末）溶解于5 L去离子水中，配制PBS缓冲液（pH 7.0）。将载玻片置于PBS缓冲液中浸泡5分....
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结果
我们介绍一种在单张切片上使用五色多重荧光进行循环抗原检测的实验方案。通过优化该检测方法，我们实现了来自不同物种的两种抗体的同时孵育（图1）。实验所需的设备包括压力锅和免疫染色盒（图2A）。
完成检测后，在扫描切片前我们定义四种标记物的伪彩色。CD3、CD8、CD20 和 CK 的伪彩色分别为黄色、红色、绿色和青色。细胞核使用 DAPI 标记。选择肿瘤和间质的代表性区域进行分析。使用 3D 自动数字切片扫描仪在 495 nm、578 nm、652 nm 和 590 nm 处捕获荧光光谱。肺癌脑转移组织中的代表性层叠图像和单标记图像如图 2B所示。根据包含单一标记物荧光信号的图像，扫描仪软件基于伪彩色提取细胞表型特征。同时统计相应阳性免疫细胞数量和总免疫细胞数量。通过计算 H-score12，对检测组织中每种染色蛋白的表达水平进行定量。完成上述步骤后，统计并分析.......
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讨论
我们已描述了多重循环荧光免疫组织化学染色的流程。一抗的选择是荧光免疫组织化学检测中的关键环节，建议使用单克隆抗体以获得更高的特异性和可重复性。为了优化一抗的工作浓度，需通过免疫组织化学实验测试一系列稀释梯度。必须设置阳性对照（用于评估靶抗原表达）和阴性对照（不加一抗孵育）。
在本实验方案中，针对不同物种来源的一抗进行稀释并配制混合液。荧光标记的二抗同样来自不同物种，并以相同方式混合后孵育。因此，关键步骤是根据抗原选择不同物种来源的一抗，且优先选用单克隆抗体而非多克隆抗体。这些措施可确保一抗与二抗之间的结合具有特异性。混合液应达到两种一抗各自的工作浓度，且两种抗体之间不应存在交叉反应。若两种一抗来自同一物种，则需先孵育其中一种二抗，再孵育另一种。在确定多联抗体孵育顺序时，应优先考虑对抗原-抗体反应敏感的抗体；对于低表达抗原，第二次表位修复可增强信号强度。在进行第二轮抗体孵育前，重复抗原修复所需时间较首次操作更短（1分钟 vs 首次的2分钟）。即使切片经历两次热诱导修复，前一轮循环染色产生的荧光信号强度也不会减弱。为避免非特异性免疫反应，需优化孵育条件，包括抗体工作浓度、孵育时间及环境.......
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披露
作者声明，他们不存在任何已知的相互竞争的财务利益或个人关系，这些利益或关系可能被认为影响了本文所报告的工作。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（编号：81860413，81960455）、云南省科技厅基金（202001AY070001-080）以及云南省教育厅科研基金（2019J1274）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.15 mol/L KmnO4 | 迈新生物技术有限公司 | MST-8005 | |
| 100x 柠檬酸钠 | 迈新生物技术有限公司 | MVS-0100 | |
| 3% 过氧化氢 | 迈新生物技术有限公司 | SP KIT-A1 | |
| 3D 全景 MIDI | 3D histech Ltd | Pannoramic MIDI 1.18 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150113 | |
| Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175701 | |
| Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150116 | |
| Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150079 | |
| 一抗稀释液 | Lecia | AR9352 | |
| CD20 | 迈新生物技术有限公司 | kit-0001 | |
| CD3 | 迈新生物技术有限公司 | kit-0003 | |
| CD8 | 迈新生物技术有限公司 | RMA-0514 | |
| CK | 迈欣生物技术有限公司 | MAB-0671 | |
| DAPI | sig-ma | D8417 | |
| 乙醇 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10009218 | |
| Histocore Multicut | lecia | 2245 | |
| PBS（粉末） | 迈新生物技术有限公司 | PBS-0061 | |
| 载玻片观察器 | 3D histech Ltd | ||
| 二甲苯 | 国药集团化学试剂有限公司 | 10023418 |
参考文献
- Wanleenuwat, P., Iwanowski, P. Metastases to the central nervous system: Molecular basis and clinical considerations. J Neurol Sci. 412, 116755(2020).
- Schoenmaekers, J., Dingemans, A. C., Hendriks, L. E. L. Brain imaging in early stage non-smal....
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重印与许可
