利用活细胞成像技术测定病理性蛋白对原代海马神经元轴突运输的影响

摘要

在此，我们演示如何将原代海马神经元的转染与活细胞共聚焦成像相结合，以分析病理蛋白诱导的轴突运输变化，并鉴定介导这些效应的分子机制通路。

摘要

沿轴突进行的货物双向运输对于维持功能性突触、神经连接以及神经元的健康至关重要。在多种神经退行性疾病中，轴突运输受到破坏，而投射神经元尤其脆弱，这是因为它们需要在长距离内运输细胞物质并维持大量的轴突结构。多种与疾病相关蛋白的病理学修饰对运输产生负面影响，包括tau蛋白、β-淀粉样蛋白、α-突触核蛋白、超氧化物歧化酶以及亨廷顿蛋白，这提示了病理蛋白在疾病中发挥毒性的潜在共同机制。研究这些毒性机制的方法对于理解神经退行性疾病并确定潜在的治疗干预手段十分必要。

本实验中，培养的原代啮齿类动物海马神经元被共转染多种质粒，通过活细胞共聚焦成像观察荧光标记的货物蛋白的快速轴突运输，以研究病理蛋白对其影响。首先，从啮齿类动物中分离、解离并培养原代海马神经元。随后，将表达荧光标记货物蛋白以及野生型或突变型tau蛋白（作为病理蛋白的示例）的质粒DNA共同转染至神经元中。在活细胞中，利用可结合神经束蛋白（neurofascin）胞外 结构域（轴突起始段蛋白）的抗体识别轴突，并对选定的轴突区域进行成像，以检测荧光货物蛋白的运输情况。

利用免费提供的 ImageJ 宏工具 KymoAnalyzer，我们对轴突运输的速度、暂停频率和定向 cargo 密度进行了全面表征，这些参数均可能受到病理蛋白存在的影响。通过该方法，我们鉴定出一种与病理性 tau 蛋白表达相关的表型，表现为 cargo 暂停频率增加。此外，可在转染体系中加入基因沉默的 shRNA 载体，以检测其他蛋白在介导运输障碍中的作用。该实验方案易于拓展应用于其他神经退行性疾病相关蛋白，是研究这些蛋白如何破坏轴突运输机制的一种可重复的方法。

引言

神经元依赖于轴突中货物的双向运输，以维持功能性突触和神经连接。轴突运输功能障碍被认为是多种神经退行性疾病发病机制中的关键因素，这些疾病包括阿尔茨海默病（AD）及其他tau蛋白病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症和亨廷顿病^1,2,3。事实上，多种与疾病相关蛋白的病理学修饰会负面影响运输功能（详见综述⁴）。开发研究病理蛋白在疾病中发挥毒性作用机制的方法，对于理解神经退行性疾病并确定潜在的治疗干预靶点至关重要。

利用分离的鱿鱼轴浆模型，研究人员在轴突运输领域取得了一系列重要发现，包括传统驱动蛋白的发现、调控马达蛋白的激酶和磷酸酶依赖性通路，以及病理蛋白破坏轴突运输调控的机制^4,5。将病理形式的tau蛋白灌注到鱿鱼轴浆中会抑制顺向快速轴突运输（FAT），该效应依赖于tau蛋白磷酸酶激活结构域的暴露，从而激活蛋白磷酸酶1（PP1）^6,7,8。PP1进一步激活糖....

方案

本方案已获得密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会的批准。该方案已成功应用于C57BL/6J背景的Tau基因敲除小鼠和野生型斯普拉格-道利大鼠。其他品系也应适用。

1. 原代海马神经元的分离获取

1. 用过滤的0.5 mg/mL多聚-L-赖氨酸（PDL）硼酸盐缓冲液（12.5 mM十水合硼酸钠和50 mM硼酸）包被4孔玻璃底培养板。每孔加入750 µL，室温孵育过夜。
2. 用无菌去离子水洗涤培养板4次。最后一次洗涤后自然晾干，并于4 °C短期保存（<1周）。
   注意：在洗涤前及洗涤过程中，切勿让PDL在玻片上干燥，否则会对细胞培养产生毒性。我们发现PDL包被玻片的长期储存可能影响神经元健康，而保持包被与接种之间时间间隔的一致性可降低不同批次培养存活率的差异。
3. 获取妊娠时间明确的小鼠或大鼠。
   注意：妊娠时间明确的动物可从商业供应商订购，也可自行繁殖。胚胎发育第0天（E0）定义为发现阴道栓的当天。采用本方法，我们成功培养了E16–18期小鼠原代海马和皮层神经元。大鼠神经元通常也在胚胎第18天（E18）获取。
4. 在E18天，采用批准的方法处死妊娠雌鼠。剪开腹壁，取出两个子宫角，转移至含有冰冻0.9%生理盐水的培养皿中，冲洗至生理盐水澄清为止。
   注意：我们通过腹腔注射过量戊巴比妥钠（至少100 mg/kg）实施安乐死。
....

结果

利用这些方法，我们表征了在野生型或与疾病相关的tau蛋白存在条件下轴突运输的特征，以探究病理型tau蛋白在疾病中引发神经毒性的潜在机制^12,13。KymoAnalyzer软件可计算并汇总指定文件夹内所有kymograph图的多种不同参数。运输速率仅在货物运动时计算（即分段速度），同时也计算包含暂停在内的总体速率（即净速度）。货物数量以总量、密度（#tracks/µm）或通量（#tracks∙µm^-1∙s^-1）表示。运行长度可单独或合并计算，以确定暂停之间移动的平均距离。货物暂停的特征包括持续时间、频率，以及货物处于非运动状态的时间百分比（即移动速度< 0.1 mm/s）。大多数测量参数均分别针对顺向和逆向运输方向进行计算，同时也提供两个方向合并后的总值。此外，还计算运输方向逆转的频率和时间点。综合而言，这些参数可对特定轴突区域内目标蛋白存在下的货物运输进行系统而全面的表征。

我们表达了野生型tau蛋白，发现与表达GF.......

讨论

越来越多的证据表明，多种与神经退行性疾病相关的致病蛋白会破坏神经元中的快速轴突运输。这可能是这些疾病中神经毒性的共同机制。为了更好地理解这些蛋白破坏运输过程的机制，我们需要能够回答特定问题的工具和模型。本文所述方法可用于研究致病蛋白如何在啮齿类动物原代海马神经元中对囊泡运输产生负面影响的机制。

原代神经元提供了一个易于操作且仍保持快速轴突运输调控所有功能特性的实验体系。基于脂质体的神经元转染效率通常不高（我们通常观察到每孔有5-15个转染成功的神经元），但相比其他方法仍具有若干优势。首先，相对较低的转染效率使研究者能够清晰地观察来自单个孤立神经元胞体的突起过程。当与轴突初始段（AIS）的活细胞标记物（如neurofascin）联合使用时，可明确识别用于成像的轴突。先前的研究已证明，采用该方法对AIS进行活细胞成像不会影响AIS的功能²⁰。

其次，脂质体转染还允许在几乎所有表达荧光运载蛋白的细胞中实现多个DNA质粒的共转染。这些质粒易于替换，因此可以方便地制备编码同一蛋白不同修饰形.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.4% 台盼蓝	Gibco	15250-061
1.7 mL 微量离心管	DOT	RN1700-GMT
2.5% 胰蛋白酶	Gibco	15090-046
3 mL 带 21 G 针头的注射器	Fisher	14-826-84
10 mL 塑料注射器	Fisher	14-823-2A
14 G 针头	Fisher	14-817-203
15 G 针头	Medline	SWD200029Z
16 G 针头	Fisher	14-817-104
18 G 针头	Fisher	14-840-97
22 G 针头	Fisher	14-840-90
32% 多聚甲醛	Fisher	50-980-495
AlexaFluor 647 山羊抗兔 IgG (H+L)	Invitrogen	A21244	RRID:AB_2535813
两性霉素 B	Gibco	15290-026
Arruga 微型胚胎囊钳，弯型；4"	Roboz	RS-5163	高压灭菌
B-27 补充剂 (50x)，无血清	Gibco	A3582801
BioCoat 24 孔多聚赖氨酸培养板	Fisher	08-774-124
硼酸	Sigma	B6768-1KG
氯化钙	Sigma	C7902
Castroviejo 3 1/2" 长 8 x 0.15 mm 角度尖头剪刀	Roboz	RS-5658	高压灭菌
细胞计数装置			自动或手动
配备活细胞培养室附件的共聚焦显微镜
共聚焦成像软件
D-(+)-葡萄糖	Sigma	G7528
DNase I (Worthington)	Fisher	NC9185812
杜氏磷酸盐缓冲液	Gibco	14200-075
EGTA	Fisher	O2783-100
Fatal-Plus 溶液	Vortech Pharmaceuticals, LTD	NDC 0298-9373-68	戊巴比妥钠；也可使用其他经批准的安乐死方法
胎牛血清	Invitrogen	16000044
庆大霉素试剂溶液	Gibco	15710-072
GlutaMAX	Gibco	35050-061	谷氨酰胺替代物
汉克氏平衡盐溶液	Gibco	24020-117
ImageJ 版本 1.51n	ImageJ		Life-Line 版本 2017 年 5 月 30 日：https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (版本 1.01)	Encalada 实验室		软件包包含全部 6 个宏：https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000	Invitrogen	100022050	需与 P3000 转染增强试剂共同使用
氯化镁	Fisher	AC223211000
MES 一水合物	Sigma	M8250
微型解剖剪刀 3.5" 直型尖/尖	Roboz	RS-5910	高压灭菌
Neurobasal Plus 培养基	Gibco	A3582901
Neurofascin (A12/18) 小鼠 IgG2a	加州大学戴维斯分校/美国国立卫生研究院 NeuroMab	75-172	RRID:AB_2282826；250 ng/mL；适用于大鼠神经元，不适用于小鼠神经元
Neurofascin 186 (D6G60) 兔 IgG	Cell Signaling	15034	RRID:AB_2773024；500 ng/mL；适用于小鼠神经元，尚未在大鼠神经元中测试
新生小牛血清	Gibco	16010-167
Opti-MEM	Gibco	31985-062
P3000	Invitrogen	100022057
培养皿，100 x 10 mm 玻璃	Fisher	08-748B	用于解剖；高压灭菌
培养皿，100 x 20 mm 玻璃	Fisher	08-748D	用于放置子宫角；高压灭菌
多聚-D-赖氨酸	Sigma	P7886-100MG
聚丙烯锥形离心管 (15 mL)	Fisher	14-955-238
聚丙烯锥形离心管 (50 mL)	Fisher	14-955-238
氯化钾	Fisher	P217-500
乙酸钠	Sigma	S5636
十水合四硼酸钠	VWR	MK745706
直刃手术剪，钝/尖	Fisher	13-810-2	高压灭菌
注射器滤器，0.22 µm	VWR	514-1263
齿状拇指敷料钳，4.5"	Roboz	RS-8100	高压灭菌
µ-Slide 4 孔玻璃底培养皿	Ibidi	80427