我们描述了一种将异种移植物移植到透明斑马鱼胚胎卵黄中的实验方案，该方案通过一种简单快速的分期方法进行了优化。注射后的分析包括检测异种移植细胞的存活情况以及通过流式细胞术评估疾病负荷。
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本文内容
摘要
摘要
体内肿瘤行为研究是癌症研究中的常规手段；然而，使用小鼠模型在成本和时间方面存在显著挑战。本文中，我们提出幼年斑马鱼作为一种移植模型，相较于小鼠模型具有多项优势，包括操作简便、成本低廉以及实验周期短。此外，在幼体阶段斑马鱼缺乏适应性免疫系统，因此无需构建或使用免疫缺陷品系。尽管已有成熟的斑马鱼胚胎异种移植实验方案，本文介绍了一种改进的方法，包括胚胎分期以实现快速移植、存活率分析，以及利用流式细胞术评估疾病负荷。通过胚胎分期，可实现细胞快速注射至幼鱼卵黄，并对细胞进行标记以监测注射细胞团的一致性。注射后，对胚胎存活情况进行评估，直至注射后7天（dpi）。最后，通过荧光蛋白标记移植细胞并结合流式细胞术分析，进一步评估疾病负荷。流式细胞术的实现依赖于一种标准化的斑马鱼胚胎细胞悬液制备方法，该方法也可用于建立斑马鱼细胞的原代培养。综上所述，本文所述方法可在每个实验组使用更多数量的动物，以更快速、更经济的方式实现对肿瘤细胞体内行为的评估。
引言
分析肿瘤在基因改变或药物处理下的行为反应 体内 是癌症研究中的一个基本要素1,2,3,4此类研究通常涉及使用免疫缺陷型小鼠（Mus musculus）模型5然而，小鼠异种移植研究在诸多方面存在局限性，包括容量有限、实验周期长、成本高昂，以及需要复杂的成像设备来监测体内肿瘤的进展6,7相比之下，斑马鱼模型（Danio rerio可实现更高的容量、更短的持续时间、更低的成本，并且由于其透明性，可简便地监测疾病进展8,9.
斑马鱼是一种发育完善的脊椎动物模型系统，具有体外发育和高繁殖力的特点，单条雌鱼可产下超过100个胚胎10。此外，斑马鱼胚胎具有透明性，便于利用荧光相关技术（如报告基因）直观观察发育过程。最后，由于关键发育过程在进化上的保守性，斑马鱼成为多种研究的理想模型，包括移植恶性细胞行为的研究11,12。野生型斑马鱼胚胎会发育出黑色素细胞，使其在2周龄时变为光学不透明；但这一限制已被casper胚胎（roya9; mitfaw2）的建立所克服，这类胚胎终生保持透明13。由于其优良的光学特性，casper斑马鱼是移植肿瘤细胞的理想受体14,15,16。过去二十年中，将肿瘤细胞异种移植至斑马鱼的研究日益重要17,18,19,20,21。斑马鱼胚胎具有先天免疫系统，但在幼体阶段缺乏适应性免疫，因此在功能上处于免疫缺陷状态，这使其能够有效作为移植肿瘤异种移植物的宿主22。
已针对斑马鱼胚胎及成体中的肿瘤移植建立了多种实验方案，这些方案考虑了多种不同的变量23,24,25,26,27。研究探索了在斑马鱼体内多个不同部位进行肿瘤接种的方法，包括卵黄、卵周腔、心脏等位置的注射，并涵盖了不同的发育阶段16,28。斑马鱼异种移植养殖的环境温度也至关重要，因为斑马鱼通常在28 °C下培养，而哺乳动物细胞的最佳生长温度为37 °C。因此，必须采用一个折中的温度，既能被斑马鱼耐受，又能支持肿瘤生长，34 °C似乎能够同时满足这两个条件29。异种移植后对肿瘤行为和进展的分析是另一个研究重点，涉及多种成像技术以及生存分析方法的应用30。斑马鱼模型的一个主要优势在于可提供大量实验动物，从而为研究肿瘤行为的体内实验带来强大的统计学效力；然而，以往的方法由于注射过程中繁琐的固定操作，严重限制了这一潜力的发挥。
在此，我们通过建立一种简单、快速的胚胎分期方法来克服这一局限性，该方法利用透明的casper斑马鱼品系实现高通量分析及注射质量监控。该方法包括在受精后2天（dpf）将异种移植物注射到casper斑马鱼胚胎的卵黄囊中。我们将异种移植后胚胎的存活情况作为肿瘤行为分析的一部分进行观察。此外，我们通过制备单细胞悬液并结合流式细胞术分析，进一步展示了异种移植后疾病负荷的评估方法（图1）。
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方案
斑马鱼的维持、喂养和饲养在标准水产养殖条件下于28.5 °C进行，如文献31所述。所有与斑马鱼相关的实验均在此温度下进行；然而，在异种移植后，动物在实验期间于34 °C下培养，此操作符合机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的程序。
1. 繁殖（注射前3天）
- 在繁殖前一周，为配对的鱼提供干燥饲料（额外饲料；每条鱼5-6粒），以最大限度地提高动物健康状况，并增加繁殖配对产生的胚胎数量。
- 在收集胚胎的前一天晚上，将待繁殖的鱼放入繁殖缸中，并用隔板将雄鱼和雌鱼分开，采用一雄多雌的交配方式，每条雄鱼配2条雌鱼。
注意：对于每个实验组包含100只动物、共4个实验组的实验，每次实验需使用20对繁殖鱼。要确定所需繁殖对的数量，可参考一个良好的估算值，即每对casper繁殖鱼可产生约50个胚胎。另一种选择是使用更具繁殖力的有色斑马鱼品系，并用1-苯基-2-硫脲（PTU）处理以抑制色素形成31。实际操作中，实验规模应确保获得的胚胎数量为注射后1天（dpi）所需数量的两倍。
2. 胚胎收集（注射前两天）
- 第二天早晨，移除隔板，使鱼类开始繁殖。
- 移除隔板后20分钟（min），在培养皿中观察鱼缸中的胚胎。
- 使用筛网收集胚胎，并置于含有胚胎水的90 mm培养皿中，胚胎水的配制方法如《斑马鱼手册》31所述。
- 配制胚胎水时，将1.5 mL储存盐溶液加入1 L蒸馏水中，并加入亚甲蓝至终浓度0.1%。储存盐溶液的配制方法为：将40 g海盐（材料表）溶解于1 L蒸馏水中。胚胎水的离子组成为 K+（0.68 mg/L）、Cl−（31.86 mg/L）、Na+（17.77 mg/L）、SO4−（4.47 mg/L）、Mg2+（2.14 mg/L）和 Ca2+（0.68 mg/L）。
- 让斑马鱼继续繁殖额外一小时，并收集新产生的胚胎。
- 将用于实验的胚胎合并在一起。
- 傍晚时，移除所有未受精或已死亡的胚胎（可通过其异常形态识别），并更换新鲜的胚胎水。
3. 胚胎维持及注射工具准备（注射前一天）
- 次日早晨，移除所有额外的死亡胚胎，并更换新鲜的胚胎水。
- 将1.5%琼脂糖溶于胚胎水中，加热溶解后倒入90 mm培养皿中制备琼脂糖平板。每个90 mm培养皿需要30–35 mL该混合液。
- 使用玻璃毛细管（硼硅酸盐）通过拉针仪制备无丝毛细针。在加热加压条件下拉制毛细管 形成封闭末端，再用镊子剪开以获得理想的开口。通过测定单位时间内排出液体的体积来评估针尖开口的适用性（见下文， 第6.3节）。
注意：玻璃毛细管可购买带或不带中心丝的型号。进行细胞注射时，优先选用无中心丝的毛细管。 - 将毛细针置于用黏土（儿童彩泥）在90 mm培养皿内刻出的凹槽中，并加盖保存，直至使用（图2A）。
4. 使用 CM-Dil 标记白血病细胞的制备与标记（注射当天）
- 在适合细胞生长的最佳条件下培养待移植的细胞。本实验所用的小鼠白血病细胞对核糖体蛋白 Rpl22 要么充足（M82；Rpl22+/+），要么缺乏（M109；Rpl22-/-），该蛋白具有肿瘤抑制功能32。
- 将细胞在 50 mL 锥形管中离心收集。计数后，在室温（RT）下以 300 ×g 离心 5 分钟。弃去上清液。
注：所需细胞数量取决于实验范围和条件，但 1 × 106 个细胞是一个合适的起始点。 - 进行 CM-Dil 染色
注：CM-Dil 染色可用于监测注射团块。- 通过将 50 µg CM-Dil 冻干粉溶于 50 µL 二甲基亚砜（DMSO）中制备储存液（终浓度为 1 mg/mL 或约 1 mM）。
- 将储存液按 4.8 µL 染料/mL 的比例稀释于含有所需支持性补充物的 1% 胎牛血清（FBS）/Hank's 平衡盐溶液（HBSS）中，制备工作液。
- 将细胞重悬于染色工作液中，浓度为 1 × 106/100 µL。
- 在 37 °C 下孵育 10 分钟。
注：染色条件需根据所用细胞进行优化（如时间等）。本实验中所用细胞需在不同温度下进行两次独立的 10 分钟孵育，以达到最佳染色效果。 - 用 10 mL 的 1× HBSS 在室温（RT）下洗涤一次。
- 将细胞在室温下以 300 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，然后用 10 mL HBSS 重悬，重复相同步骤进行第二次洗涤。
- 将染色后的肿瘤细胞以 40,000 个细胞/µL 的浓度重悬于含 1% FBS 的 PBS 及所需支持性补充物中，并将细胞悬液维持在 34 °C 直至注射。
注：本研究所用细胞系的维持需要支持性补充物（例如 1% FBS 和细胞因子）。具体补充物及异种移植条件可能需根据研究中的特定细胞系进行调整。此处选用 PBS 而非培养基，以避免对卵黄产生潜在毒性。
5. 脱膜
- 在体视显微镜下使用胰岛素注射器，在2倍放大条件下，于受精后2天（2 dpf）手动去除casper斑马鱼胚胎的卵膜。用一根针刺穿卵膜，同时用另一根针固定卵膜。
注意：不建议使用蛋白酶（pronase）进行去卵膜处理，因为这有时会导致胚胎健康状况下降。选择在受精后2天（2 dpf）去卵膜更为理想，因为此时操作更简便，且胚胎比更早期（如1 dpf）时更不易受损。 - 去卵膜过程中，需小心避免针头接触胚胎。若针头意外触碰或损伤胚胎卵黄，可能导致胚胎死亡。
- 通过更换胚胎培养液，清除已脱落的卵膜碎片。
6. 设置显微注射仪和注射针
- 打开显微注射仪和泵，设置适合细胞显微注射的条件。建议以9–11 psi的注射压力和0.5秒（s）的注射时间作为剪切针尖和设定孔径的起始参数。
- 将肿瘤细胞系悬液（约5 µL）小心地单次吸入显微针中，避免产生 气泡，以免干扰针内细胞流。
- 使用镊子（Dumont 5号）剪切针尖末端，形成一个每0.2–0.3秒可喷出10–15纳升（nL）细胞悬液的孔径。
注：上述nL 体积的计算使用校准毛细管进行，其中1 mm = 30 nL。简而言之，先将注射时间设为0.5 s，每次剪切针尖后按下注射键，并用校准毛细管收集液滴，然后在显微镜下利用刻度测量收集液体的长度。当0.5 s内注射量达到30 nL时停止剪切针尖。随后将注射时间调整为0.2–0.3 s（即每次注射约10–15 nL细胞）。
7. 注射用胚胎的制备
- 在显微镜下选择健康的胚胎，剔除具有发育异常的胚胎，如心包水肿或躯干短小或弯曲的胚胎。
- 使用三卡因甲磺酸盐（MS-222；胚胎水中浓度为 0.16 g/L）在 90 mm 培养皿中对胚胎进行 1 分钟的麻醉处理。
- 用玻璃巴斯德吸管吸取胚胎，将 10–15 个胚胎以侧位排列在 1.5% 琼脂糖平板上（图 2B-D）。
- 用巴斯德吸管吸去多余水分，仅保留维持胚胎 存活所需的最少胚胎水。
8. 注射操作步骤
- 在显微镜下检查，确保细胞已聚集在针尖处。
- 使用校准过的针头向胚胎卵黄内注射0.2–0.3秒（对应10–15 nL，约含400–600个细胞）。
- 对所有胚胎重复注射操作，然后将其收集至新鲜的胚胎水中。
注意：由于细胞容易在针尖处积聚，每注射15–20个胚胎后需重新剪切针尖。每次重新剪切后还需重新调整压力和时间，以确保每次注射的体积一致。 - 为确保对两组不同移植细胞行为的比较具有有效性，需监测细胞团块的移植情况。可通过在注射后1小时（hpi）根据CM-Dil染色（在RFP通道中）对胚胎进行分选，将染色理想者（"良好团块"）与染色较差者（"较差团块"；图3，黄色箭头）区分开来。
- 弃除具有较差团块的胚胎，或将其用于评估不同细胞剂量对疾病进展的影响。
- 在当天结束前移除所有死亡胚胎，因其死亡通常与注射损伤有关，而非肿瘤生长所致。将未保留细胞的胚胎从分析中剔除 ，因为细胞可能已从注射部位泄漏 。
- 将注射后的胚胎置于直径90 mm的培养皿中，在34 °C条件下持续培养，每皿约放置60个胚胎。
注意：5 dpf后，胚胎生长将消耗完卵黄，因此在整个实验期间需为胚胎提供草履虫作为食物。为保证充分营养，应从6 dpf（4 dpi）至9 dpf（7 dpi）每日向胚胎投喂草履虫。草履虫可通过在最佳营养与温度条件下于烧瓶中培养进行扩增，具体方法见文献31。
9. 生存分析
- 在接下来的7天内监测胚胎发育情况，每天更换胚胎培养用水。若实验涉及药物处理，为方便起见，可改为隔天换水。
- 在整个分析期间检查胚胎健康状况，并记录死亡情况。
注意：本 实验 的实验周期为7天，但具体时长可根据异种移植肿瘤的侵袭性进行调整，可能更短或更长。 - 利用CM-Dil荧光评估疾病负荷（图4A），并通过Kaplan-Meier分析确定基因改变或药物处理对存活率的影响，并以图形方式展示（例如使用GraphPad Prism软件；图4B）33。
10. 胚胎单细胞悬液制备用于流式细胞术分析
注意：异种移植后可通过流式细胞术分析评估疾病负荷；然而，该方法需要对肿瘤细胞进行永久性标记。使用逆转录病毒或慢病毒递送的红色荧光蛋白（RFP）或 mCherry 是有效的，因其信号可显著超越斑马鱼细胞的自发荧光，而绿色荧光蛋白的信号则会被斑马鱼细胞的自发荧光所掩盖。
- 选择所需 dpi 阶段的胚胎进行分离。此处展示的是 5 dpi 胚胎（图 5）。
- 每种条件初始收集 30–40 个胚胎，但胚胎数量可根据发育阶段及移植细胞的侵袭性进行调整。 按上述方法对胚胎进行麻醉。
注意：如图所示，可将胚胎分组作为重复样本，以确保统计学显著性（图 5B）。 - 将胚胎转移至 1.5 mL 离心管中。
- 每份样品使用 100 μL 无钙林格氏液（配方31）以溶解卵黄，低钙环境可软化胚胎组织，从而实现更有效的组织解离。
- 使用 200 μL 移液枪头间歇性吹打 5 分钟，以去除卵黄。
- 将 0.05% 胰蛋白酶/PBS（不含酚红指示剂）预热至 29 °C，并每毫升胰蛋白酶溶液中加入 27 μL 胶原酶 IV（100 mg/mL）。每份胚胎样品需使用 1 mL 消化液。
- 向每份去卵黄的胚胎样品中加入 1 mL 胰蛋白酶/胶原酶混合液，在 29 °C 下孵育 30–35 分钟。
- 每隔 5 分钟使用 1 mL 移液枪头在此溶液中上下吹打胚胎，直至胚胎结构（脊柱）不再可见。
- 加入 200 μL 胎牛血清（FBS）以终止反应。
- 充分混匀后，在 29 °C 下继续孵育 5 分钟，以确保胰蛋白酶完全失活。
注意：组织解离过程中采用 29 °C 是为了避免在 37 °C 下引发斑马鱼细胞的热休克死亡；但如果无需保持斑马鱼细胞活性，消化可在 37 °C 下进行。 - 在 4 °C 下以 300 x g 离心 5 分钟，收集细胞沉淀，并弃去上清液。
- 用 4 °C 的 PBS 重悬细胞沉淀，并按上述条件离心。
- 重复洗涤一次，然后通过 70 µm 细胞滤网过滤细胞。
- 离心收集细胞沉淀，随后进行染色以用于流式细胞术分析。
注意：若需培养原代斑马鱼细胞，则需再用 4 °C 的 PBS 洗涤两次，并重悬于 L15 培养基（含抗生素和 10% FBS）中。
11. 荧光激活细胞分选（FACS）：异种移植细胞的染色与分选
- 用染色缓冲液（含1% FBS的HBSS）重悬细胞悬液，300 × g 离心5分钟，收集细胞沉淀。
- 将细胞沉淀用染色缓冲液重悬，并加入针对移植细胞的抗体，以提供第二个标记物（除RFP或mCherry外），用于区分移植细胞与斑马鱼细胞。本实验中，每份样品使用50 µL抗小鼠CD45抗体（APC-CD45），按1:50稀释（图5）。
- 4 °C孵育20分钟后，加入1 mL染色缓冲液，同上洗涤以去除未结合的抗体。
- 弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于200 µL含活细胞染料Helix NP Blue（1 µM）的染色缓冲液中，用于活/死细胞区分。
- 将细胞悬液转移至5 mL圆底聚碳酸酯管中，用于流式细胞术分析。
注意：平行染色肿瘤细胞对照有助于在流式细胞术分析时更清晰地设门。
12. 流式细胞术
- 开启可用的流式细胞仪，并使用低流速（每秒500个事件或更低）来设置参数。
- 使用肿瘤细胞对照（即用于异种移植的相同细胞）设置FSC（前向散射）、SSC（侧向散射）、BV421/CasB（活性）、CE-594（mCherry）和APC（CD45.2）通道的电压。
注意：需要使用单染样本建立补偿设置，以消除不同荧光染料之间的信号重叠。 - 使用未注射的胚胎样本建立能够同时容纳移植细胞和斑马鱼细胞的检测设置。
- 将流速提高至每秒8000个事件，并为每个样本记录100万个事件。
- 使用适当的分析软件分析所得数据，首先通过绘制FSC-H与FSC-A（高度与面积）选择单细胞，然后绘制图像以筛选活细胞。FlowJo软件广泛用于此类分析。
- 利用肿瘤细胞对照，在FSC-A与SSC-A图上圈定移植细胞的门控区域，然后使用指示染料（本例中为CD45和mCherry）进一步确认（图5B）。
注意：为肿瘤选定的大小门控区域也会包含斑马鱼细胞，这为归一化处理和疾病负荷的确定提供了依据。 - 使用上述相同的门控设置分析胚胎样本。最终的肿瘤染色与荧光蛋白指示图将提供疾病负荷的量化指标（图5C）。
注意：此处绘制了接受足量细胞注射的胚胎与接受不足量细胞注射的胚胎之间疾病负荷差异的比较。 - 如有需要，可通过流式细胞术对胚胎中的肿瘤细胞进行分选，用于后续分子分析。
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结果
异种移植
整个实验与分析的全面概览如图所示 图1，涵盖从胚胎制备到通过存活率分析及流式细胞术检测疾病负荷来评估疾病进展的全过程。该方法在异种移植的可重复性和可扩展性方面实现了多项改进，并提供了一种评估疾病负荷的新途径。实验的成功高度依赖于移植细胞的健康状态，处于非健康状态或非对数生长期的细胞在移植后无法有效增殖。注射过程的持续时间也是一个关键参数。肿瘤细胞制备完成后，必须在3-4小时内完成向斑马鱼胚胎的注射。本研究所采用的方法通过将胚胎直接侧向固定在琼脂糖板上并注射至卵黄中这一简单改进，可在规定时间内实现更高数量胚胎的注射图 2C,D此外，必须选择合适的针头孔径，以确保注入足够数量的细胞（400–600个），同时避免孔径过大而损伤胚胎。另一个需要考虑的因素是注射压力。我们发现，当压力超过12–13 psi时，会破坏胚胎的卵黄，导致胚胎死亡。最后，该操作本身存在的另一项变异性在于注射的一致性。待注射的细胞会沉降到注射针的末端，使得对注射体积的精确...
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讨论
斑马鱼异种移植已成为小鼠研究的一种快速、可靠且经济高效的替代方法12。尽管已有多种斑马鱼异种移植方法被报道，但我们对该方法的改进取得了显著优化。除了对操作相关参数进行标准化之外，这些改进特别聚焦于加快肿瘤注射的速度，从而能够在每个实验组中增加动物数量，并利用肿瘤标记来监测注射质量及注射后的生物学行为。
尽管本文所述对该方法的改进具有巨大潜力，但成功实施该策略仍需要经验丰富的操作人员，并针对具体应用进行优化。我们采用了白血病细胞，因此，实体瘤的应用可能会带来额外挑战。此类肿瘤可能易于发生聚集，从而导致细胞团注过程中的递送变异性；然而，即便在此类情况下，RFP标记仍应能够实现注射后对细胞团质量的有效质控。该优势优于GFP标记或绿色染料，因其信号易受自发荧光干扰而难以分辨。最后，本文对影响成功率的大多数参数（胚胎健康状况、水产养殖温度、注射针孔径、注射压力等）进行了标准化，从而最大限度地降低了该过程的变异性。
在斑马鱼异种移植实验中，注射位点的选择是一个重要考虑因素。本文表明，相对于其...
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R37AI110985和P30CA006927、宾夕法尼亚联邦拨款、白血病与淋巴瘤学会以及Bishop基金支持。本研究还得到了福克斯蔡斯癌症中心核心设施的支持，包括细胞培养、流式细胞术和实验动物设施。 我们感谢Jennifer Rhodes博士在福克斯蔡斯癌症中心负责斑马鱼和显微注射设施的维护工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1-苯基-2-硫脲（PTU） | Sigma | P7629 | |
| 70 微米细胞筛 | Corning | CLS431751-50EA | |
| 90 毫米培养皿 | Thermo Fisher Scientific | S43565 | |
| 琼脂糖 | Apex bioresearch | 20-102GP | |
| APC 标记的抗小鼠 CD45.2 抗体（APC anti-mouse CD45.2 Antibody） | Biolegend | 109814 | |
| BD FACSymphony A5 细胞分析仪 | BD Biosciences | BD FACSymphony A5 | |
| 校准毛细管 | Sigma | P1424-1PAK | |
| 细胞示踪染料 CM-dil | Invitrogen | C7001 | |
| IV 型胶原酶（Collagenase IV） | Gibco | 17104019 | |
| Dumont 55 号镊子 | Fine science tools | 11255-20 | |
| 胎牛血清（FBS） | Corning | 35-015-CV | |
| 荧光显微镜 | Nikon | 型号 SMZ1500 | |
| 玻璃毛细管（硼硅酸盐） | World precision instruments | 1B100-4 | |
| HBSS | Corning | 21-023-CV | |
| Helix NP Blue | Biolegend | 425305 | |
| Instant Ocean 海盐 | Instant ocean | SS15-10 | |
| 光学显微镜 | Nikon | 型号 SMZ1000 | |
| 亚甲蓝 | Sigma | M9140-100G | |
| 微量移液加载器（长头型，用于细胞加载） | eppendorf | 930001007 | |
| P1000 微量移液器拉制仪 | Sutter instruments | 型号 P-97 | |
| PM 1000 细胞微量注射仪 | MicroData Instruments, Inc. (MDI) | PM1000 | |
| 三卡因甲磺酸盐（Tricaine methanesulphate，即氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐，Ethyl 3-aminobenzoate methanesulphate） | Sigma | E10521-10G | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红 | Gibco | 15400054 | |
| 斑马鱼成鱼辐照饲料（干饲料） | Zeigler | 388763 |
参考文献
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