一种在透明斑马鱼胚胎中进行肿瘤异种移植分析的简单、快速且有效的方法

摘要

我们描述了一种将异种移植物移植到透明斑马鱼胚胎卵黄中的实验方案，该方案通过一种简单快速的分期方法进行了优化。注射后的分析包括检测异种移植细胞的存活情况以及通过流式细胞术评估疾病负荷。

摘要

体内肿瘤行为研究是癌症研究中的常规手段；然而，使用小鼠模型在成本和时间方面存在显著挑战。本文中，我们提出幼年斑马鱼作为一种移植模型，相较于小鼠模型具有多项优势，包括操作简便、成本低廉以及实验周期短。此外，在幼体阶段斑马鱼缺乏适应性免疫系统，因此无需构建或使用免疫缺陷品系。尽管已有成熟的斑马鱼胚胎异种移植实验方案，本文介绍了一种改进的方法，包括胚胎分期以实现快速移植、存活率分析，以及利用流式细胞术评估疾病负荷。通过胚胎分期，可实现细胞快速注射至幼鱼卵黄，并对细胞进行标记以监测注射细胞团的一致性。注射后，对胚胎存活情况进行评估，直至注射后7天（dpi）。最后，通过荧光蛋白标记移植细胞并结合流式细胞术分析，进一步评估疾病负荷。流式细胞术的实现依赖于一种标准化的斑马鱼胚胎细胞悬液制备方法，该方法也可用于建立斑马鱼细胞的原代培养。综上所述，本文所述方法可在每个实验组使用更多数量的动物，以更快速、更经济的方式实现对肿瘤细胞体内行为的评估。

引言

分析肿瘤在基因改变或药物处理下的行为反应 体内 是癌症研究中的一个基本要素^1,2,3,4此类研究通常涉及使用免疫缺陷型小鼠（Mus musculus）模型⁵然而，小鼠异种移植研究在诸多方面存在局限性，包括容量有限、实验周期长、成本高昂，以及需要复杂的成像设备来监测体内肿瘤的进展^6,7相比之下，斑马鱼模型（Danio rerio可实现更高的容量、更短的持续时间、更低的成本，并且由于其透明性，可简便地监测疾病进展^8,9.

斑马鱼是一种发育完善的脊椎动物模型系统，具有体外发育和高繁殖力的特点，单条雌鱼可产下超过100个胚胎¹⁰。此外，斑马鱼胚胎具有透明性，便于利用荧光相关技术（如报告基因）直观观察发育过程。最后，由于关键发育过程在进化上的保守性，斑马....

方案

斑马鱼的维持、喂养和饲养在标准水产养殖条件下于28.5 °C进行，如文献³¹所述。所有与斑马鱼相关的实验均在此温度下进行；然而，在异种移植后，动物在实验期间于34 °C下培养，此操作符合机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的程序。

1. 繁殖（注射前3天）

1. 在繁殖前一周，为配对的鱼提供干燥饲料（额外饲料；每条鱼5-6粒），以最大限度地提高动物健康状况，并增加繁殖配对产生的胚胎数量。
2. 在收集胚胎的前一天晚上，将待繁殖的鱼放入繁殖缸中，并用隔板将雄鱼和雌鱼分开，采用一雄多雌的交配方式，每条雄鱼配2条雌鱼。
   注意：对于每个实验组包含100只动物、共4个实验组的实验，每次实验需使用20对繁殖鱼。要确定所需繁殖对的数量，可参考一个良好的估算值，即每对casper繁殖鱼可产生约50个胚胎。另一种选择是使用更具繁殖力的有色斑马鱼品系，并用1-苯基-2-硫脲（PTU）处理以抑制色素形成³¹。实际操作中，实验规模应确保获得的胚胎数量为注射后1天（dpi）所需数量的两倍。

2. 胚胎收集（注射前两天）

1. 第二天早晨，移除隔板，使鱼类开始繁殖。
2. ....

结果

异种移植
整个实验与分析的全面概览如图所示 图1，涵盖从胚胎制备到通过存活率分析及流式细胞术检测疾病负荷来评估疾病进展的全过程。该方法在异种移植的可重复性和可扩展性方面实现了多项改进，并提供了一种评估疾病负荷的新途径。实验的成功高度依赖于移植细胞的健康状态，处于非健康状态或非对数生长期的细胞在移植后无法有效增殖。注射过程的持续时间也是一个关键参数。肿瘤细胞制备完成后，必须在3-4小时内完成向斑马鱼胚胎的注射。本研究所采用的方法通过将胚胎直接侧向固定在琼脂糖板上并注射至卵黄中这一简单改进，可在规定时间内实现更高数量胚胎的注射图 2C,D此外，必须选择合适的针头孔径，以确保注入足够数量的细胞（400–600个），同时避免孔径过大而损伤胚胎。另一个需要考虑的因素是注射压力。我们发现，当压力超过12–13 psi时，会破坏胚胎的卵黄，导致胚胎死亡。最后，该操作本身存在的另一项变异性在于注射的一致性。待注射的细胞会沉降到注射针的末端，使得对注射体积的精确.......

讨论

斑马鱼异种移植已成为小鼠研究的一种快速、可靠且经济高效的替代方法¹²。尽管已有多种斑马鱼异种移植方法被报道，但我们对该方法的改进取得了显著优化。除了对操作相关参数进行标准化之外，这些改进特别聚焦于加快肿瘤注射的速度，从而能够在每个实验组中增加动物数量，并利用肿瘤标记来监测注射质量及注射后的生物学行为。

尽管本文所述对该方法的改进具有巨大潜力，但成功实施该策略仍需要经验丰富的操作人员，并针对具体应用进行优化。我们采用了白血病细胞，因此，实体瘤的应用可能会带来额外挑战。此类肿瘤可能易于发生聚集，从而导致细胞团注过程中的递送变异性；然而，即便在此类情况下，RFP标记仍应能够实现注射后对细胞团质量的有效质控。该优势优于GFP标记或绿色染料，因其信号易受自发荧光干扰而难以分辨。最后，本文对影响成功率的大多数参数（胚胎健康状况、水产养殖温度、注射针孔径、注射压力等）进行了标准化，从而最大限度地降低了该过程的变异性。

在斑马鱼异种移植实验中，注射位点的选择是一个重要考虑因素。本文表明，相对于其.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-苯基-2-硫脲（PTU）	Sigma	P7629
70 微米细胞筛	Corning	CLS431751-50EA
90 毫米培养皿	Thermo Fisher Scientific	S43565
琼脂糖	Apex bioresearch	20-102GP
APC 标记的抗小鼠 CD45.2 抗体（APC anti-mouse CD45.2 Antibody）	Biolegend	109814
BD FACSymphony A5 细胞分析仪	BD Biosciences	BD FACSymphony A5
校准毛细管	Sigma	P1424-1PAK
细胞示踪染料 CM-dil	Invitrogen	C7001
IV 型胶原酶（Collagenase IV）	Gibco	17104019
Dumont 55 号镊子	Fine science tools	11255-20
胎牛血清（FBS）	Corning	35-015-CV
荧光显微镜	Nikon	型号 SMZ1500
玻璃毛细管（硼硅酸盐）	World precision instruments	1B100-4
HBSS	Corning	21-023-CV
Helix NP Blue	Biolegend	425305
Instant Ocean 海盐	Instant ocean	SS15-10
光学显微镜	Nikon	型号 SMZ1000
亚甲蓝	Sigma	M9140-100G
微量移液加载器（长头型，用于细胞加载）	eppendorf	930001007
P1000 微量移液器拉制仪	Sutter instruments	型号 P-97
PM 1000 细胞微量注射仪	MicroData Instruments, Inc. (MDI)	PM1000
三卡因甲磺酸盐（Tricaine methanesulphate，即氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐，Ethyl 3-aminobenzoate methanesulphate）	Sigma	E10521-10G
胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红	Gibco	15400054
斑马鱼成鱼辐照饲料（干饲料）	Zeigler	388763