该方案以骨肉瘤小鼠模型中益气解毒汤的煎剂配制及灌胃技术为例，提供了详细的标准化操作流程。方案阐述了动物保护措施，提升了研究数据的可靠性，为探究中药煎剂方剂的治疗效果及分子作用机制提供了有效的研究策略。 体内.
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摘要
摘要
汤剂是中药最常用的剂型，在临床应用中已有数千年历史，通常通过口服给药，具有起效快、易吸收以及根据患者具体证候进行个体化治疗的特点。汤剂的质量直接关系到中药的临床疗效，因此，汤剂制备过程的标准化对于避免因主观因素导致的煎煮质量差异具有重要意义。同时，由于临床试验存在局限性，医学研究中常采用携带人类疾病的小型动物（如小鼠）作为模型，以探讨不同干预措施（包括中药汤剂）的治疗效果及其综合作用机制。 因此，作为一种重要的经口给药方式，熟练的灌胃技术对于避免潜在的食管损伤和药物溢出尤为关键，可确保每只模型动物接受等量的药物，从而获得准确的实验结果。此外，规范的汤剂制备方法与熟练的灌胃操作策略对于保护动物福利、减少动物使用数量也至关重要。本文以益气解毒汤在骨肉瘤小鼠模型中的应用为例，报道了一套详细的汤剂制备与灌胃技术标准化流程，并通过肿瘤体积评估其疗效。该方案将最大限度地保护实验动物，提高研究数据的可靠性，为今后研究中药汤剂的治疗效果及其分子机制提供有效的技术策略。 体内.
引言
汤剂是中药最常用的剂型，也是液态药物制剂1,2。中药汤剂的制备方法是将药材加水浸泡后煎煮，再经过滤除去药渣而成。
由于汤剂处方可根据临床需要进行个体化调整，尤其符合中医循证治疗的特点，这种剂型 通过 经口给药在临床实践中已应用数千年，具有特定且不可替代的优势3,4汤剂的质量与临床疗效直接相关。 因此，汤剂处方必须依据标准化煎煮方法的原则进行制备，以确保有效成分得到最大程度的提取和保护3同时，饮片是临床使用中药材的主要形式；处方用饮片的质量标准和生产方法必须符合《中华人民共和国药典》的规定。2此外， prescribed decoction-ready medicines 必须用冷水浸泡至少30分钟，然后在专用药锅中加热煎煮。5研究表明，大部分有效成分可通过煎煮两次提取出来，且 医疗机构中药煎药室管理规范亦规定中药煎煮应进行两次4,6,7若处方中含有质地坚硬或具有补益作用的特殊中药材，建议延长煎煮时间。从浸泡处方药材的容器开始，所有与药液直接接触的煎煮器具及储存容器均应具备化学稳定性并配有盖子，例如砂锅、陶瓷、玻璃和不锈钢制品。不得使用铝制及普通塑料制品，严禁使用铁器及其他易腐蚀的器具，以避免发生可能的化学反应，导致药效降低，甚至产生有害作用4,6,7.
由于开展临床实验存在局限性，医学研究中常使用携带人类疾病的小型动物（如小鼠）来探索不同干预措施（包括中药汤剂处方）的治疗效果及综合作用机制8,9；然而，与人类不同，在临床实践中，中药汤剂需每日 freshly 配制、混合，并每日给药两次。动物无法自主按时摄入所需剂量的药物，目前大多数与中药相关的动物实验均采用灌胃法进行口服给药。用于in vivo动物实验的中药汤剂应预先配制，分装后于-20 °C保存，并在使用前新鲜解冻3,4,10。此外，不规范的动物固定和灌胃针操作会增加不必要的损伤和负面情绪风险。因此，作为一种重要的经口给药方式，熟练掌握灌胃技术对于避免可能的食管损伤和药物溢出尤为关键，从而确保每只模型动物均能接受等量的处方中药，以获得准确的实验结果。本文提供了一种适用于中药汤剂处方的动物灌胃操作方案。
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方案
本方案以益气解毒汤为例，详细描述了在骨肉瘤模型小鼠中进行灌胃操作的技术。实验选用4周龄雄性裸鼠（BALB/c nude），饲养于上海中医药大学实验动物中心的SPF级动物房。所有动物实验均经上海中医药大学动物管理与伦理委员会批准，遵循《实验动物伦理准则》（动物伦理批准编号：PZSHUTCM2304060007），并严格依照国际有关实验动物的管理要求进行。
1. 材料
- 准备以下材料：中草药（人参 42 g、Hedyotis diffusa 52.5 g、黄芩 31.5 g）、1 mL 注射器和 12G/55 mm 弯头灌胃针（图 1）。
2. 剂量确定
- 按以下方法计算每日剂量：标准体重为60 kg的成人的每日剂量为人参12 g， Hedyotis diffusa 15 g，黄芩9 g，共计36 g饮片，即0.6 g饮片/kg体重。参照成人体重60 kg与小鼠体重25 g之间的体表面积换算，等效剂量为12倍，低剂量为6倍，高剂量为24倍11，以及我们的初步数据，在本研究中对小鼠采用20倍剂量比例的益气解毒汤，因此小鼠给药剂量为12 g煎煮药材/kg体重。
- 使用以下公式计算每只小鼠的剂量：
小鼠剂量（标准体重）= 成人剂量（标准体重）× 20（指定等效剂量比）。
每只小鼠每日剂量为0.3 g［（12 g 药材/1000 g 体重）× 25 g 体重］，溶于200 µL溶液中，终浓度为1.5 g/mL。 - 计算益气解毒汤灌胃组小鼠（n=7）连续给药28天所需的总药材量为58.8 g，浓缩至39.2 mL，得到终浓度为1.5 g/mL。
- 考虑到煎煮和灌胃过程中可能存在的药物损失，以及计算的便利性，共准备126 g（人参42 g， Hedyotis diffusa 52.5 g，尖叶黄芩草31.5 g）煎煮用中药，浓缩至终体积84 mL。
3. 细胞来源与培养
- 从 ATCC 细胞库购买人源 143B 骨肉瘤细胞。
- 在 10 cm 细胞培养皿中接种 1 × 106 个 143B 细胞，加入 10 mL 含 10% 胎牛血清（FBS）、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素的 MEM 培养基。
- 将 143B 细胞在 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养，直至细胞融合度达到 80%–90%。
4. 建模方法
- 收集80%汇合度的培养143B细胞，重悬于6 mL含10%血清的MEM培养基中，按体积比1:1与基底膜基质凝胶混合，制备终浓度为1 × 10⁷个细胞/mL的细胞悬液。7 cells/mL
- 向每只裸鼠的左侧胫骨注射10 µL细胞悬液以建立模型 原位 异种移植骨肉瘤小鼠模型，如我们先前发表的文章所述12步骤简述如下。
- 用 PBS 洗涤细胞 2 次。加入 1.5 mL 0.25% 胰蛋白酶消化 3 分钟。加入 6 mL 含 10% 血清的 MEM 培养基。将细胞收集至 15 mL 离心管中。
- 将20 µL细胞悬液吸入细胞计数板的计数室中，使用自动细胞计数仪计算细胞浓度。以800 x g离心细胞 g 室温下孵育5分钟。
- 用移液器弃去上清液，将细胞沉淀重悬于8.5 mg/mL基底膜基质中，并置于冰上。
- 使用2%异氟烷和98%氧气（氧气流速为2 L/min）对小鼠进行麻醉。在麻醉期间，于小鼠眼部涂抹少量兽用眼膏以防止角膜干燥。
- 在通风良好的区域进行整个操作过程。在注射骨肉瘤细胞前，通过轻触小鼠足部检查其是否处于深度麻醉状态；如果小鼠仍有抽动或惊跳等反应，则需继续麻醉。 如果小鼠仍有反应（如抽搐或抖动），需等待更长时间，直至这些反应消失。
- 将小鼠置于仰卧位。用拇指和食指固定小鼠踝部，使用碘伏和70%乙醇棉片交替擦拭胫骨注射部位，共进行三轮消毒。
- 将针头连接至1 mL注射器，针尖指向胫骨平台的注射部位，并与胫骨长轴平行。经皮插入针头，在胫骨平台上钻孔，方向朝向胫骨远端。
- 将先前置于冰上的骨肉瘤细胞悬液吸入微量注射器中，并用该装载骨肉瘤细胞的微量注射器替换胫骨处原有的1 mL注射器。缓慢注射约10 µL（1 × 10⁶）细胞。7 将骨肉瘤细胞悬液（细胞浓度为 cells/mL）注入每只无胸腺小鼠的胫骨中。
- 将微量注射器从注射部位取出，用棉签按压注射部位约30秒。将小鼠放回清洁的笼子中，观察其恢复情况10分钟。
5. 灌胃用中药汤剂处方的制备（ 图2）
- 按照步骤2计算剂量。
- 除名贵药材人参外，将所有用于煎煮的中药材用饮用水浸泡，水量高出药面约3 cm，浸泡30分钟，然后按以下方法进行两次煎煮。
- 第一次煎煮时，先用武火加热至沸腾，然后改用文火加热15–25分钟。文火指低功率加热，温度通常在80 °C至100 °C之间；武火指高功率加热，温度通常在200 °C至300 °C之间。
- 将煎煮液倒入一个容器中。
- 第二次煎煮时，在饮水中加入药材，水量以刚好浸没药面为宜，先用武火加热至沸腾，然后改用文火加热15–25分钟。
- 将第二次煎煮所得药液倒入与步骤5.4相同的容器中。
- 由于人参较为贵重，需单独浸泡并煎煮42 g，加饮用水至高出药面3 cm。
- 将已浸泡的人参用武火煎煮60分钟。
将煎煮液倒入与步骤5.4相同的容器中。 - 第二次煎煮人参时，加入适量饮用水，水量以刚好浸没药面为宜，用文火加热40分钟，煎煮液同样倒入与步骤5.4相同的容器中。
注意：煎煮所用容器应具有化学稳定性，例如砂锅（临床最常用）、陶瓷、玻璃或不锈钢材质，以避免与药物成分发生化学反应。不同步骤所得的所有煎煮液均需收集至同一容器中。 - 使用三层纱布固定于量杯口部（以橡皮筋扎紧），对混合后的煎煮液进行过滤。
- 将过滤后的药液倒入锅中，先用武火煮沸，随后转为文火持续加热，直至达到目标浓度（最终体积为84 mL，终浓度为1.5 g/mL）。
- 根据一周内经口灌胃给药所需的剂量，将浓缩药液分装为每份21 mL，并于-20 °C冰箱中保存。
6. 使用灌胃装置对小鼠进行灌胃给药
- 将小鼠放置在鼠笼表面或其他较粗糙的表面上。
- 用右手的拇指和食指抓住小鼠尾巴，然后用左手的拇指、食指和中指抓住小鼠颈部。
- 用左手的其余两个手指固定小鼠尾巴，使小鼠的头部、颈部和身体呈一条直线。
注意：在整个抓持过程中应确保小鼠处于放松状态。如果小鼠持续挣扎，应重复抓持操作直至其放松。 - 用右手持灌胃装置，为一只体重为 20 g 的小鼠加载 200 µL 的煎剂配方（每 10 g 体重给予 100 µL 煎剂配方）。
- 从口角处将灌胃针插入小鼠口腔，并将舌头推向其上颌。
- 保持小鼠身体方向不变，沿食道轻柔推进灌胃针，直至约有 10 mm 长度的灌胃针留在体外。
注意：当灌胃针进入食道时会有空虚感。灌胃针插入的长度应测量至胸骨上缘。灌胃针总长度为 60 mm（图3），因此在将煎剂注入小鼠胃内之前，应将约 50 mm 的灌胃针插入小鼠体内。 - 将煎剂注入小鼠胃内。若遇到阻力或有液体从口角溢出，提示灌胃针位置错误，必须避免。此外，若煎剂较为黏稠，注射速度应减慢。
- 释放小鼠并观察 10 分钟。若未见呼吸异常，则表明灌胃成功，可将小鼠放回鼠笼（图4）。
7. 治疗过程
- 为探究益气解毒汤的治疗效果，设立对照组和益气解毒汤组。对对照组小鼠每日给予生理盐水，连续给药28天；对益气解毒汤组小鼠每日给予益气解毒汤，连续给药28天。
8. 不良反应
- 将小鼠放回笼中后，需密切观察其状态，包括因食物无法进入胃内而导致的体重下降和精神状态减退。
- 由于食物引起的气管阻塞，小鼠会出现呼吸困难和气促，并通过咳嗽试图清除气管。若在灌胃过程中出现上述任何症状，应立即停止操作，并 实施安乐死。
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结果
益气解毒汤对骨肉瘤生长的抑制作用 在体 在胫骨内异种移植骨肉瘤小鼠模型中评估了疗效，该模型通过将143B骨肉瘤细胞注射至裸鼠胫骨内构建。从注射143B细胞的第二天开始，对益气解毒方组小鼠进行灌胃给药，持续28天；对照组小鼠给予生理盐水。所有小鼠在28天后处死。结果显示，与对照组相比，益气解毒方组小鼠的肿瘤体积显著减小（图5).
图 1：煎煮用耗材。 可用于煎煮的药材包括（A）人参、（
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讨论
中药处方中草药的临床疗效在很大程度上与给药剂量和剂型相关；因此，在临床实践中建立标准化的煎煮方法和熟练的给药流程十分必要，同时也可提高实验结果的可靠性。
本研究首先提供了一套针对临床实践中中医药常用中药饮片标准化煎煮的详细方案，有助于指导人们科学地煎煮药物，实际提升汤剂的质量以及中药的临床疗效；因此，一旦实现标准化，将提高中药在临床应用中疗效的准确性和一致性。
灌胃法作为一种口服给药方式，已广泛应用于临床前研究，并适用于多种实验动物，包括小鼠、大鼠和兔子，具有操作简便、剂量控制准确以及能够模拟临床给药途径等优点13。然而，若在未麻醉的情况下将动物固定于不正确的位置，动物可能会剧烈挣扎，这不仅威胁研究人员的健康安全，还可能降低实验的可靠性。因此，建立标准化的灌胃操作方法至关重要，可有效减少此类风险，避免药液误入气管或造成食管损伤，进而导致动物死亡和实验失败。
本研究选择灌胃途径将汤剂配方给予骨肉瘤模型小鼠，因为该方法可精确控制...
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披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
本研究工作得到了以下资助：（1）国家自然科学基金（81973877 和 82174408）；（2）国家重点研发计划&中国国家重点研发计划（2020YFE0201600）、上海市优先建设研究重点中心项目（2022ZZ01009）、上海市医院中药制剂产业转化协同创新中心项目、上海中医药大学校内预算科研项目（2021LK047）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 143B 细胞系 | ATCC | CRL-8303 | 骨肉瘤细胞系 |
| 麻醉机 | 深圳瑞沃德生命科技有限公司 | R500IP | 小鼠麻醉设备 |
| 自动细胞计数仪 | 上海司莫生物技术有限公司 | IC1000 | 细胞计数 |
| BALB/c 裸鼠 | 上海斯莱克实验动物有限责任公司 | 雄性 | 实验动物 |
| 积雪草 | 上海养和堂中药饮片有限公司 | 20230606 | 可煎煮中药饮片 |
| 基底膜基质 | 上海优宁生物科技有限公司 | 356234, BD, Matrigel | 重悬细胞 |
| 离心管（15 mL） | 上海悦年生物科技有限公司 | 430790, Corning | 离心细胞 |
| 弯头灌胃针（12 号/55 mm） | 瑞沃德生命科学有限公司 | C21014-12 | 胃灌注装置组件 |
| 纱布 | 海氏海诺集团有限公司 | LC45 | 药液过滤 |
| 人参 | 上海万仕诚药业有限公司 | 20220704-2 | 可煎煮中药饮片 |
| 白花蛇舌草 | 上海养和堂中药饮片有限公司 | 2023071107 | 可煎煮中药饮片 |
| 异氟烷 | 深圳瑞沃德生命科技有限公司 | VETEASY | 小鼠麻醉 |
| 微量注射器 | 上海高鸽工贸有限公司 | 0-50 μL | 向胫骨内精确注射细胞 |
| 磷酸盐缓冲液 | 碧云天生物技术 | ST447 | 洗涤人骨肉瘤细胞 |
| 橡胶圈 | 上海恒飞生物科技有限公司 | XPJ | 固定纱布于量杯上 |
| 注射器（1 mL） | 上海密莎瓦医疗工业有限公司 | SBM0040 | 胃灌注装置组件 |
| 胰蛋白酶（0.25%） | 上海悦年生物科技有限公司 | 25200056, Gibco | 细胞胰酶处理 |
参考文献
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