本文介绍了一种利用单细胞和单细胞核RNA测序技术生成人脑类器官并进行下游分析的综合性实验方案。
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方法文章
脑类器官中单细胞与单细胞核转录组的生成及下游分析
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
在过去十年中，单细胞转录组学得到了显著发展，已成为一种标准的实验室方法，可同时分析单个细胞的基因表达谱，从而捕获细胞异质性。为了克服难以分离的细胞类型的限制，可采用一种替代性策略，即通过测序手段回收单个细胞核而非完整细胞，从而使单细胞转录组分析具有更广泛的适用性。这些技术已成为脑类器官研究的基石，确立了脑类器官作为人类大脑发育模型的地位。本实验方案充分利用单细胞和单细胞核转录组学在脑类器官研究中的潜力，提供了一步一步的操作指南，涵盖类器官解离、单细胞或细胞核分离、文库构建 及测序等关键步骤。通过实施这些替代性方法，研究人员可以获得高质量的数据集，进而鉴定神经元与非神经元细胞类型、基因表达谱以及细胞谱系轨迹，从而促进对塑造大脑发育的细胞过程和分子机制的全面研究。
引言
近年来，类器官技术已成为培养类器官组织的一种颇具前景的工具1,2,3尤其是对于人脑等难以直接获取的器官，类器官为深入研究提供了机会 发育与疾病发生4因此，脑类器官已被广泛用作研究多种人类脑部疾病的实验模型，包括发育性、精神性甚至神经退行性疾病。4,5,6.
随着单细胞转录组测序技术的发展，人类原代组织和复杂的 体外 模型能够以前所未有的精细程度进行研究，从而揭示健康与疾病状态下细胞亚群水平上基因表达变化的机制，并为发现新的潜在治疗靶点提供依据7,8,9类器官领域已通过利用单细胞转录组测序来评估脑类器官技术的细胞组成、可重复性及保真度而取得进展10,
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方案
所述实验方案在马克斯·德尔布吕克分子医学中心的生物安全二级实验室中进行（批准编号：138/08），符合欧盟及国家关于研究伦理的要求和规定。
1. 从诱导多能干细胞（iPSCs）衍生前脑类器官
注意：本方案已针对多家公司提供的不同干细胞培养基培养的多种不同iPSC细胞系进行过测试（表1）。前脑类器官的生成高度依赖于高质量的iPSC细胞，以及在启动本方案前达到60%-70%的融合度。本研究中使用了一种 commercially available cell line（参见材料表）。
- 第0天：拟胚体形成
- 使用Pluronic溶液处理96孔板时，向96孔U型底板的每孔中加入80 µL无菌过滤的2% Pluronic溶液。在室温（RT）或37 °C下孵育至少15分钟。
注意：Pluronic处理的板可在4 °C保存最多2周，用于拟胚体形成时可直接使用，无需任何洗涤步骤。 - 在接种细胞前，使用吸液器或多通道移液器从各孔中移除Pluronic溶液。
- 开始前，为一个96孔板准备以下试剂：含5 mL预热DMEM:F12培养基的15 mL离心管；11 mL添加了50 µM Y-27632的干细胞培养基；已用Pluronic处理的板（如上....
- 使用Pluronic溶液处理96孔板时，向96孔U型底板的每孔中加入80 µL无菌过滤的2% Pluronic溶液。在室温（RT）或37 °C下孵育至少15分钟。
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结果
为了利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞核RNA测序（snRNA-seq）研究脑类器官的细胞类型组成，在培养30天后收获脑类器官，因为此阶段的类器官已表现出由祖细胞、周围环绕的中间祖细胞以及早期神经元构成的神经上皮环结构4,18。在整个生长和培养过程中监测类器官的质量，对于获得可靠的单细胞和单细胞核数据至关重要。
类器官通过iPSCs聚集形成拟胚体（图1B，C）而生成。组装完成后，这些拟胚体应呈现清晰的边缘，且细胞碎片极少（图1C）。在神经外胚层诱导后，拟胚体表面出现明显的亮化现象，内部区域则相对较暗，表明神经诱导成功（图1D）。在随后的数周内，类器官发育出所谓的环状结构，即主要由神经上皮细胞构成的神经元玫瑰花结样结构（
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讨论
单细胞和单细胞核转录组分析已成为研究复杂组织中基因调控机制的关键工具。这两种方法均可用于脑类器官的转录组研究。为确保实验整体成功，起始材料的质量至关重要。因此，有必要定期切割类器官，以防止坏死核心的形成26。也可通过气液界面培养来消除这一问题27。为了减少因类器官异质性导致的批次效应，我们建议每次提取至少使用四个类器官。或者，也可对单个类器官进行多次测序，这还能进一步分析同一批次内的变异情况17。当同时平行使用scRNA-seq和snRNA-seq两种方法时，可将类器官切成两半，分别用于两种方法，从而进一步降低由类器官异质性引起的技术差异。
为了获得高质量的单个细胞或细胞核转录组谱，关键在于在整个操作过程中保持细胞或细胞核膜的完整性。因此，必须优化酶的浓度和酶消化的时间，且需根据类器官的年龄和大小进行相应调整。此外，使用适当的温度和离心速度，并避免剧烈的移液操作也至关重要。如果细胞活力较低，可在将类器官解离为单细胞后使用死细胞去除试剂盒。作.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
我们感谢Valeria Fernandez-Vallone提供了Miltenyi神经组织解离试剂盒的原始操作说明。同时感谢马克斯·德尔布吕克分子医学中心基因组技术平台提供了NP40裂解缓冲液的配方以及在建立本实验方案过程中给予的宝贵建议。我们还感谢Margareta Herzog和Alexandra Tschernycheff在实验室组织管理方面提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1,4-二硫代-DL-赤藓糖醇，F. D. Mol.-Biol.，约 1 M 在 H2O (DTT) | Sigma | 43816-10ML | |
| 1.5 ml DNA低吸附管 | VWR | 525-0130 | 微量离心管 |
| 10x Cellranger 分析流程 | 分析流程 | ||
| 15 ml Falcon | Falcon | 离心管 | |
| 2-巯基乙醇（BME） | Life Technologies | 21985023 | |
| 50 ml Falcon | Falcon | 离心管 | |
| A83-01 | 生物技术 | 379762 | |
| 抗生素/抗真菌素溶液（100X） | Life Technologies | 15240062 | |
| B-27 Plus添加剂 | Life Technologies | 17504044 | |
| B-27 补充剂（不含维生素 A） | Life Technologies | 12587010 | |
| 牛血清白蛋白，无脂肪酸（BSA） | Sigma Aldrich | A8806-5G | |
| cAMP | Biogems | 6099240 | |
| cAMP | Biogems | 6099240 | |
| C-CHIP 改良型血球计数板 | VWR | DHC-N01 | |
| 细胞滤网 40 µm | Neolab | 352340 | |
| 70 微米细胞滤网 µm（白色）尼龙 | Sigma | CLS431751-50EA | |
| 铬控制器 & Next GEM 附加试剂盒 | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM 芯片 G 单细胞试剂盒，16 次反应 | 10X Genomics | 1000127 | |
| Chromium Next GEM 单细胞 3' 试剂盒 v3.1 | 10X Genomics | 1000268 | |
| 完整， 无EDTA蛋白酶抑制剂混合液 | 罗氏 | 11873580001 | |
| DAPI | 默克化学公司 | 0000001722 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320074 | |
| Dounce 组织研磨器套装，2 mL，完整 | Sigma Aldrich | 10536355 | |
| Essential E8 Flex 培养基 | Life Technologies | A2858501 | |
| EVE细胞计数板 | VWR | EVS-050 (734-2676) | |
| 无四环素胎牛血清（FBS） | PAN Biotech | P30-3602 | |
| Geltrex LDEV-Free（包被） | Life Technologies | A1413302 | |
| gentleMACS | Miltenyi Biotec | 解离仪 | |
| GlutaMAX 补充剂 | Life Technologies | 35050038 | |
| 肝素钠，细胞培养测试 | Sigma | H3149-10KU | |
| 人重组BDNF | StemCell Technologies | 78005.3 | |
| 人重组GDNF | StemCell Technologies | 78058.3 | |
| 人胰岛素溶液 | Sigma Aldrich | I2643-25MG | |
| 无血清替代物 | Life Technologies | 10828028 | |
| LDN193189 盐酸盐 98% | Sigma Aldrich | 130-106-540 | |
| MEM非必需氨基酸（100倍浓缩） | Sigma Aldrich | M7145-100ml | |
| MgCl₂ 氯化镁（1 M）RNase-free | 赛默飞世尔科技 | AM9530G | |
| mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | 干细胞培养基 |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | 干细胞培养基 |
| N2 补充剂 | StemCell Technologies | 17502048 | |
| 神经组织解离试剂盒 | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | 130-092-628 | |
| Neurobasal Plus | Life Technologies | A3582901 | |
| NextSeq500 系统 | Illumina | 测序仪 | |
| NP-40 Surfact-Amps 去垢剂溶液 | Life Technologies | 28324 | |
| PBS杜尔贝科’s | Invitrogen | 14190169 | |
| 青霉素-链霉素（PenStrep） | Life Technologies | 15140122 | |
| Percoll | Th. Geyer | 10668276 | |
| 泊洛沙姆 F-127 | Sigma Aldrich | P2443-1KG | |
| RiboLock RNase 抑制剂 | Life Technologies | EO0382 | |
| ROCK 抑制剂（Y-27632 二盐酸盐）SB | 生物分子 | Cay10005583-10 | |
| SB 431542 | Biogems | 3014193 | |
| 氯化钠 NaCl (5 M)，无RN酶，100 mL | Invitrogen | AM9760G | |
| StemFlex 培养基 | 赛默飞世尔科技 | A3349401 | 干细胞培养基 |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | 干细胞培养基 |
| 96孔圆底TC培养板 | Sarstedt | 83.3925.500 | |
| TISSUi006-A | TissUse GmbH | https://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A | |
| 台盼蓝 | T8154-20ml | Sigma | |
| 不含酚红的 TrypLE Express 酶 | Life Technologies | 12604013 | 胰蛋白酶类试剂 |
| UltraPure 1 M Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5 | Life Technologies | 15567027 | |
| XAV939 | Enzo Life Sciences | BML-WN100-0005 |
参考文献
- Finkbeiner, S. R., et al. Stem cell-derived human intestinal organoids as an infection model for Rotaviruses. mBio. 3 (4), e00159-e00212 (2012).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidn....
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