同时采集胎鼠脑组织和血清以评估母体饮食对神经纤维瘤病1型中营养状况和神经发育的影响

摘要

在本实验方案中，我们描述了一种可从同一只小鼠胚胎中同时获取胎儿脑组织以及高质量、无溶血血清的方法。我们已利用该技术研究母体饮食暴露如何影响杂合子Nf1（神经纤维瘤病1型）小鼠的宏量营养素谱和胎儿神经发育。

摘要

母体饮食诱导的肥胖已被证明会改变子代的神经发育，可能导致认知能力下降、多动以及社交行为障碍。患有临床表现异质性遗传病1型神经纤维瘤病（NF1）的患者可能出现类似的缺陷，但目前尚不清楚母体饮食等环境因素是否会影响这些表型的发展，以及如果存在影响，其潜在机制是什么。为了评估母体致肥胖饮食对NF1相关神经发育系统性因素的影响，我们建立了一种方法，可同时从母鼠（分别饲喂对照饮食与高脂高糖饮食）的胎鼠中收集无溶血的血清以及完整脑组织或经显微解剖获取的特定脑区组织。脑组织可用于冰冻切片或速冻保存，以备后续进行RNA或蛋白质提取；所采集组织的质量通过免疫染色加以验证。血清质量则通过分析宏量营养素谱进行确认。利用该技术，我们发现母体致肥胖饮食在野生型和Nf1杂合子胎鼠中均显著升高了胎儿血清胆固醇水平。

引言

1型神经纤维瘤病（Neurofibromatosis Type 1, NF1）被认为是一种RAS通路病（RASopathy），这是一类由种系遗传突变引起RAS/MAPK（RAt肉瘤病毒/丝裂原活化蛋白激酶）信号通路激活的疾病。NF1 RAS通路病患者可能发生多种不同的临床表现，包括中枢神经系统（视路胶质瘤^1,2、高级别胶质瘤^3,4）和周围神经系统（丛状神经纤维瘤^5,6、恶性周围神经鞘瘤^7,8）的良性和恶性肿瘤，以及骨骼发育异常⁹和皮肤色素异常¹⁰（腋窝雀斑、咖啡牛奶斑）。该疾病对认知功能和神经发育的影响正日益受到关注，NF1患者出现学习障碍、多动症和自闭症谱系障碍的发生率较高^11,12,13。然而，不同患者在这些表型的发展上存在显著异质性^{13,14,15,16,17}，目前尚不清楚为何部分患者表现出明显的认知障碍，而另一些患者则不受影响。母体饮食诱导的肥胖已被证明在普通人群中同样会影响学习能力和行为表现^{18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28}，提示NF1患者中母体饮食暴露的差异可能是这种临床异质性的来源之一。特别是，肥胖母亲的子女患多动症^{18,19,20,23,25,26}、自闭症^19,24,27和执行功能缺陷的风险增加^21,23，且全量表智商评分较低^22,28。然而，与普通人群相比，NF1患者具有不同的代谢表型，包括肥胖和糖尿病的发生率较低^29,30,31，因此尚不清楚他们对饮食刺激是否会表现出类似的反应。

为了解决这些问题，我们希望确定在具有Nf1基因的胎儿后代中，由促肥胖饮食引起的宏量营养素谱改变是否会导致神经发育变化。我们此前已从胎鼠脑组织中成功获取了高质量的全脑及区域显微解剖组织，适用于神经发育相关研究³²。然而，由于胎鼠体型小、血容量低，采集胎儿血液具有较大挑战性³³。通过断头后重力引流的方式采血，在我们的样本中导致采集血量偏低且溶血严重，这可能影响后续实验结果的解读。既往报道的从胎儿心脏或胸腔血管穿刺抽吸采血的方法³³，技术操作难度高，且同样频繁出现溶血现象。因此，我们建立了一种胎儿血清采集方法，该方法采用特制的毛细采血管，可在避免显著剪切应力的情况下实现较高体积的血液采集。

此处，我们介绍一种可同时采集胚胎脑组织和胎鼠血清的方法 Nf1- 暴露于高脂高糖饮食与对照饮食的杂合子幼崽 在子宫内 (图 1 和 补充表 S1）。脑组织经冷冻包埋，用于后续免疫荧光分析，或进行区域性显微解剖后速冻，以用于后续分子生物学实验。获得高质量血清，适用于宏量营养素谱分析等下游应用。利用该方法，我们发现母体高脂高蔗糖饮食暴露可导致野生型（WT）和 Nf1-杂合子幼崽。

方案

本研究中的所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院（NIH）指南，并经圣路易斯华盛顿大学机构动物护理和使用委员会批准。动物饲养环境采用标准的12小时光照：12小时黑暗循环，自由获取食物和饮水。

1. 母体饮食

1. 在4周龄时，将雌性小鼠置于对照饲料（CD）或致肥饮食（Ob）中饲养。
2. 在8至12周龄时，通过每天清晨观察雌鼠阴道栓情况来安排定时交配，以确定准确的取材时间。为验证饮食诱导的肥胖，在交配时称量雌鼠体重。
   注意：采用8至12周龄范围进行初次交配设置，是为了确保摄取致肥饮食的雌鼠相比对照组出现超重，而这一差异在8周龄时并不总能达成。发现阴道栓当日记为胚胎第1天（E1），本研究中所有动物均在E19时采集。选择晚期胎儿阶段是由于既往研究已观察到，暴露于致肥饮食的动物在此时期存在神经发育变化（数据未显示）。

2. 胎儿 从母鼠中取出

1. 首先，确认母鼠处于妊娠状态（通过腹部形态和饱满度、腹部触诊或胎动判断）。如有疑问，可再次称量雌鼠体重以评估体重增加情况。
   注意：妊娠晚期的小鼠体重应至少增加 3–4 g。为提高在目标时间段内成功受孕的几率，可在交配前 3 天每天将雄鼠笼内的脏锯末（含尿液和信息素）添加至雌鼠笼中，以诱导发情³⁴。
2. 将母鼠放入麻醉室，室内放置浸有 3 mL 异氟烷的纸巾，注意避免母鼠与浸有麻醉剂的纸巾直接接触。待动物镇静后，将其置于纸巾上，抓住其尾部，将解剖剪置于颈部，用力向上朝头部方向剪断颈椎，实施颈椎脱位处死。或者，在异氟烷镇静后实施断头处死。
   注意：此步骤可从母鼠采集血清，方法与下文所述类似，但需使用较大的毛细管。如需采集血清，应选择断头法而非颈椎脱位法。需注意确保在处死前使用异氟烷不会改变目标表型。
3. 将母鼠仰卧置于 100 mm 培养皿中。捏起覆盖腹部的皮肤，用解剖剪沿中线做一纵行切口，再做数条与中线切口垂直的附加切口，形成皮瓣，以暴露含有胚胎的子宫。
4. 将子宫从腹腔中拉出。用剪刀将子宫与母体分离。将完整胚胎囊（"串珠状结构"）连同胚胎一起放入盛有冷灭菌 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。将装有胎鼠的培养皿置于冰上。
   注意：由于每窝通常包含 6–10 只需采集脑组织和血清的仔鼠，因此需将胎鼠置于冰上以防止组织降解。将仔鼠置于冰上还可确保其充分处死，因为仅靠母鼠处死可能不足以完全终止仔鼠生命。若仅需采集血清，则可在室温下进行采集。

3. 胎儿血清采集

1. 使用#5镊子小心解剖，将胚胎从胎膜中取出。用弯头镊子将胚胎转移至培养皿中，并加入新鲜的冷灭菌1×PBS。
2. 将动物标本在纸巾上轻轻吸干，以去除残留的羊水和PBS。
3. 用手握住动物腹部。使用显微剪在颈部腹侧做切口，进行部分断头处理，确保血管被切断，但连接头部的皮肤仍保持相连。
   注意：头部必须保持连接，以便能同时从身体和头部收集血液。
4. 将身体以45°角持握，切口朝下。将50 µL微量采血管（毛细管）平行置于母体切口处血滴形成的位置，小心让50 µL毛细管自然充满血液。
   注意：可使用两根毛细管或100 µL毛细管，最多可收集约75 µL血液。
5. 将头部放入盛有冷灭菌1×PBS的新鲜60 mm培养皿中，用于后续组织采集（第4节）。
6. 当血液进入毛细管后，迅速将活塞推入1.5 mL离心管中。轻弹管壁或短暂离心，确保血液沉至管底。
7. 对同窝其余胚胎重复上述操作。
   注意：保持幼崽处于冰上并快速操作至关重要，以减少死后凝血的风险，避免影响采集量。
8. 在室温下使血液凝固30分钟。
9. 在4 °C条件下，以16,000 × g 离心20分钟。
10. 使用200 µL移液器将血清转移至新的500 µL离心管中，注意不要扰动管底的血细胞沉淀。
    注意：血清应呈淡黄色，无红色碎片。每个胚胎可获得15–30 µL血清。
11. 将收集的血清在-80 °C条件下保存。

4. 胎儿 脑组织采集

1. 通过解剖显微镜观察，用弯头镊夹住吻部，并使用#5镊子小心地从颅骨帽上剥离皮肤，保留其在吻部的连接以便于持握。将#5镊子与颅骨呈45°角，小心刺穿作为发育中颅骨的透明膜，然后将镊子转向与颅骨平行，插入颅骨帽下方，夹紧并向一侧剥离。一侧去除后，用#5镊子夹住剩余部分，向另一侧剥离。
2. 用微型勺子轻轻将脑组织从颅骨中取出，并转移至一个含有冷1×PBS的新鲜60 mm培养皿中。
   注意：此时可对完整脑组织进行固定和包埋，用于免疫染色。参见先前发表的方法³²。
3. 若组织需用于其他分子实验而必须速冻，请进一步分离目标区域。以下描述的是围绕侧脑室、第三脑室和第四脑室的室管膜周围组织的分离方法。
   1. 用弯头镊以非优势手持住脑组织的后脑与前脑交界处。优势手持手术刀，使刀刃与脑表面平行，在皮层中部区域用力下压（图1）。
   2. 继续保持对后脑的夹持，在后脑前方做第二个切口，将其与前脑分离（图1）。在最前端部分，寻找位于水平面内的两个小的半圆形空腔，即为侧脑室。将弯头镊置于每个脑室中心以固定脑组织，用#5镊子小心剥离其内衬组织，然后转移至一个新的洁净1.5 mL离心管中。
   3. 在中间部分，于腹侧表面寻找一条细小的线状空隙，即为第三脑室。使用#5镊子小心夹除脑室表面两侧的内衬组织，然后转移至一个新的洁净1.5 mL离心管中。
   4. 在最后端部分，于后脑中央寻找一条细小的线状空隙，即为第四脑室。用#5镊子从两侧剥离其内衬组织，然后转移至一个新的洁净1.5 mL离心管中。
      注意：若后脑切面不整齐，第四脑室组织可能被遮挡和/或破坏。
   5. 对于步骤4.3.2–4.3.4，在组织放入离心管后，立即迅速将管子放入装有液氮的耐冻容器中。
      注意：样品可在液氮中保存，直至其余样本完成解剖。警告：液氮可导致严重冻伤。切勿将手直接伸入液氮，避免溅洒。
   6. 将冷冻的管子置于干冰上，并将冷冻组织转移至–80 °C冰箱中保存备用。

结果

为展示通过该技术获取的脑组织质量，我们展示了来自 Nestin-CFPnuc 小鼠的胎儿脑组织样本³⁵，按照先前报道的技术对GFAP进行免疫染色³². 巢蛋白⁺ 细胞排列于侧脑室壁上（图 2A），与GFAP⁺ 从表面延伸出的丝状结构。在野生型（WT）或Ob暴露小鼠的侧脑室中，我们未观察到CD小鼠的Nestin或GFAP表达存在差异。 Nf1-杂合品系（图2A，B）。接下来，我们评估了显微切割组织的质量。首先进行了蛋白质印迹实验³⁶ 针对从对照组（CD）与肥胖暴露（Ob-exposed）小鼠侧脑室分离的显微切割组织中检测管家蛋白 β-actin。所有样本均显示出强烈的 β-actin 表达（图 2C)，符合预期。随后，我们根据...

讨论

小鼠采血的传统方法包括眼球后静脉、尾静脉、隐静脉、面静脉和颈静脉放血^40,41,42。然而，由于胚胎个体体积小且血管细弱，这些方法并不适用于胚胎期血液采集。通过断头后重力引流的方式采集血液，在我们的样本中导致采集量低且溶血严重。先前有文献报道，使用改良的20 G针头从胸腔血管引流血液可提高采血量³³；但我们发现该技术操作难度较高，且溶血率高，因此不适用于多种后续实验应用。我们的方法通过被动血流采集，降低了因负压抽吸引起的剪切应力所导致的溶血风险。毛细管上的推杆还可快速高效地将血液转移至收集管中，最大限度减少血液与空气接触，限制血凝块的破碎。重要的是，同一动物在采血后还可用于获取完整脑组织或经显微解剖分离的特定脑区组织，从而减少实验所需动物总数。

该方案在实施过程中需要进行若干调整，以优化样本采集的质量和效率。在采集血清时，采血前应轻柔地去除胚胎液体和...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#5/45 镊子	Dumont	11251-35	尖端形状：45° 角度
4200 Tapestation	Agilent	G2991BA	检测 RNA 完整性与质量，测定 RIN 值
台式液氮容器	Thermo Fisher	2122	或其他耐低温容器
对照饲料	PicoLab	5053	也可使用 Research diets D12328（低脂、低糖）饲料。
弯头镊子	Cole Parmer	UX-10818-25	尖端形状：90° 弯曲
解剖刀柄	Cole-Parmer Essentials	10822-20	SS Siegel 型，适配 #10 至 #15 刀片
EMS SuperCut 解剖剪	Electron microscope sciences	72996-01	5½" (139.7 mm)，直刃
GFAP 抗体	Abcam	ab7260	稀释比例 1:350。使用含 0.3 M 甘氨酸的 10% 血清进行封闭。
玻璃钒碳钢外科刀片，11 号	MYCO medical	2001T-11	11 号刀片可实现平直切口
微型实验勺	Az Scilab	A2Z-VL001	不锈钢材质，可高压灭菌
微型剪刀	Rubis	78180-1C3	型号 1C300
Minivette POCT 中性管	Sarstedt	17.2111.050	标称体积：50 µL，无需预处理
Nanorop	Thermo Fisher	13-400-519	测定 RNA 浓度及 260/280 比值
致肥胖饮食	Researchdiets.com	D12331	高脂、高蔗糖
总胆固醇试剂	Thermo Fisher	TR13421	比色法检测
β-actin 抗体	Cell Signaling	8457	稀释比例 1:1,000。