在本实验方案中，我们描述了一种可从同一只小鼠胚胎中同时获取胎儿脑组织以及高质量、无溶血血清的方法。我们已利用该技术研究母体饮食暴露如何影响杂合子Nf1（神经纤维瘤病1型）小鼠的宏量营养素谱和胎儿神经发育。
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本文内容
摘要
摘要
母体饮食诱导的肥胖已被证明会改变子代的神经发育，可能导致认知能力下降、多动以及社交行为障碍。患有临床表现异质性遗传病1型神经纤维瘤病（NF1）的患者可能出现类似的缺陷，但目前尚不清楚母体饮食等环境因素是否会影响这些表型的发展，以及如果存在影响，其潜在机制是什么。为了评估母体致肥胖饮食对NF1相关神经发育系统性因素的影响，我们建立了一种方法，可同时从母鼠（分别饲喂对照饮食与高脂高糖饮食）的胎鼠中收集无溶血的血清以及完整脑组织或经显微解剖获取的特定脑区组织。脑组织可用于冰冻切片或速冻保存，以备后续进行RNA或蛋白质提取；所采集组织的质量通过免疫染色加以验证。血清质量则通过分析宏量营养素谱进行确认。利用该技术，我们发现母体致肥胖饮食在野生型和Nf1杂合子胎鼠中均显著升高了胎儿血清胆固醇水平。
引言
1型神经纤维瘤病（Neurofibromatosis Type 1, NF1）被认为是一种RAS通路病（RASopathy），这是一类由种系遗传突变引起RAS/MAPK（RAt肉瘤病毒/丝裂原活化蛋白激酶）信号通路激活的疾病。NF1 RAS通路病患者可能发生多种不同的临床表现，包括中枢神经系统（视路胶质瘤1,2、高级别胶质瘤3,4）和周围神经系统（丛状神经纤维瘤5,6、恶性周围神经鞘瘤7,8）的良性和恶性肿瘤，以及骨骼发育异常9和皮肤色素异常10（腋窝雀斑、咖啡牛奶斑）。该疾病对认知功能和神经发育的影响正日益受到关注，NF1患者出现学习障碍、多动症和自闭症谱系障碍的发生率较高11,12,13
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方案
本研究中的所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院（NIH）指南，并经圣路易斯华盛顿大学机构动物护理和使用委员会批准。动物饲养环境采用标准的12小时光照：12小时黑暗循环，自由获取食物和饮水。
1. 母体饮食
- 在4周龄时，将雌性小鼠置于对照饲料（CD）或致肥饮食（Ob）中饲养。
- 在8至12周龄时，通过每天清晨观察雌鼠阴道栓情况来安排定时交配，以确定准确的取材时间。为验证饮食诱导的肥胖，在交配时称量雌鼠体重。
注意：采用8至12周龄范围进行初次交配设置，是为了确保摄取致肥饮食的雌鼠相比对照组出现超重，而这一差异在8周龄时并不总能达成。发现阴道栓当日记为胚胎第1天（E1），本研究中所有动物均在E19时采集。选择晚期胎儿阶段是由于既往研究已观察到，暴露于致肥饮食的动物在此时期存在神经发育变化（数据未显示）。
2. 胎儿 从母鼠中取出
- 首先，确认母鼠处于妊娠状态（通过腹部形态和饱满度、腹部触诊或胎动判断）。如有疑问，可再次称量雌鼠体重以评估体重增加情况。
注意：妊娠晚期的小鼠体重应至少增加 3–4 g。为提高在目标时间段内成功受孕的几率，可在交配前 3 天每天将雄鼠笼内的脏锯末（含尿液和信息素）添加至雌鼠笼中，以诱导发情
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结果
为展示通过该技术获取的脑组织质量，我们展示了来自 Nestin-CFPnuc 小鼠的胎儿脑组织样本35，按照先前报道的技术对GFAP进行免疫染色32. 巢蛋白+ 细胞排列于侧脑室壁上（图 2A），与GFAP+ 从表面延伸出的丝状结构。在野生型（WT）或Ob暴露小鼠的侧脑室中，我们未观察到CD小鼠的Nestin或GFAP表达存在差异。 Nf1-杂合品系（图2A，B）。接下来，我们评估了显微切割组织的质量。首先进行了蛋白质印迹实验36 针对从对照组（CD）与肥胖暴露（Ob-exposed）小鼠侧脑室分离的显微切割组织中检测管家蛋白 β-actin。所有样本均显示出强烈的 β-actin 表达（图 2C)，符合预期。随后，我们根据.......
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讨论
小鼠采血的传统方法包括眼球后静脉、尾静脉、隐静脉、面静脉和颈静脉放血40,41,42。然而，由于胚胎个体体积小且血管细弱，这些方法并不适用于胚胎期血液采集。通过断头后重力引流的方式采集血液，在我们的样本中导致采集量低且溶血严重。先前有文献报道，使用改良的20 G针头从胸腔血管引流血液可提高采血量33；但我们发现该技术操作难度较高，且溶血率高，因此不适用于多种后续实验应用。我们的方法通过被动血流采集，降低了因负压抽吸引起的剪切应力所导致的溶血风险。毛细管上的推杆还可快速高效地将血液转移至收集管中，最大限度减少血液与空气接触，限制血凝块的破碎。重要的是，同一动物在采血后还可用于获取完整脑组织或经显微解剖分离的特定脑区组织，从而减少实验所需动物总数。
该方案在实施过程中需要进行若干调整，以优化样本采集的质量和效率。在采集血清时，采血前应轻柔地去除胚胎液体和.......
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披露
作者不存在任何利益冲突。
致谢
N Brossier 获得了由神经纤维瘤病治疗加速计划（NTAP，资助号 #210112）资助的 Francis S. Collins 神经纤维瘤病临床与转化研究学者项目的支持。本出版物部分得到了约翰斯·霍普金斯大学医学院 NTAP 的资助。其内容完全由作者负责，不一定代表约翰斯·霍普金斯大学医学院的官方观点。额外资助来自圣路易斯儿童医院（FDN-2022-1082 至 NMB）以及圣路易斯华盛顿大学糖尿病研究核心（NIH P30 DK020579）。显微成像通过华盛顿大学细胞成像中心（WUCCI）完成，该中心得到了华盛顿大学医学院、华盛顿大学儿童发现研究所和圣路易斯儿童医院（CDI-CORE-2015-505 和 CDI-CORE-2019-813）以及巴恩斯-犹太医院基金会（3770 和 4642）的支持。Nestin-CFPnuc35 小鼠由 Grigori Enikolopov（纽约州立大学石溪分校文艺复兴医学院）慷慨提供，携带 R681X 或 C383X 生殖系突变的 Nf1 杂合小鼠32,38,39 由 David Gutmann（密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院）慷慨提供。图 1 使用 BioRender.com 制作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| #5/45 镊子 | Dumont | 11251-35 | 尖端形状：45° 角度 |
| 4200 Tapestation | Agilent | G2991BA | 检测 RNA 完整性与质量，测定 RIN 值 |
| 台式液氮容器 | Thermo Fisher | 2122 | 或其他耐低温容器 |
| 对照饲料 | PicoLab | 5053 | 也可使用 Research diets D12328（低脂、低糖）饲料。 |
| 弯头镊子 | Cole Parmer | UX-10818-25 | 尖端形状：90° 弯曲 |
| 解剖刀柄 | Cole-Parmer Essentials | 10822-20 | SS Siegel 型，适配 #10 至 #15 刀片 |
| EMS SuperCut 解剖剪 | Electron microscope sciences | 72996-01 | 5½" (139.7 mm)，直刃 |
| GFAP 抗体 | Abcam | ab7260 | 稀释比例 1:350。使用含 0.3 M 甘氨酸的 10% 血清进行封闭。 |
| 玻璃钒碳钢外科刀片，11 号 | MYCO medical | 2001T-11 | 11 号刀片可实现平直切口 |
| 微型实验勺 | Az Scilab | A2Z-VL001 | 不锈钢材质，可高压灭菌 |
| 微型剪刀 | Rubis | 78180-1C3 | 型号 1C300 |
| Minivette POCT 中性管 | Sarstedt | 17.2111.050 | 标称体积：50 µL，无需预处理 |
| Nanorop | Thermo Fisher | 13-400-519 | 测定 RNA 浓度及 260/280 比值 |
| 致肥胖饮食 | Researchdiets.com | D12331 | 高脂、高蔗糖 |
| 总胆固醇试剂 | Thermo Fisher | TR13421 | 比色法检测 |
| β-actin 抗体 | Cell Signaling | 8457 | 稀释比例 1:1,000。 |
参考文献
- Listernick, R., Darling, C., Greenwald, M., Strauss, L., Charrow, J. Optic pathway tumors in children: the effect of neurofibromatosis type 1 on clinical manifestations and natural history. J Pediatr. 127 (5), 718-722 (1995).
- Fisher, M. J., et al.
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