植物根际促生细菌（PGPR）在根际的定殖对其促生作用至关重要。因此，有必要标准化细菌根际定殖的检测方法。本文描述了一种可重复的定量细菌在根表定殖的方法。
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本文内容
摘要
摘要
测量细菌在拟南芥（Arabidopsis thaliana）根部的定殖是植物-微生物互作研究中最常见的实验之一。为了提高实验的可重复性，有必要建立一种标准化的方法来定量根际中的细菌定殖。我们首先在水培条件下培养无菌的拟南芥（A. thaliana），然后将细菌接种至根际，终浓度为 OD600 0.01。接种后第2天，采集根组织并用无菌水清洗三次，以去除未定殖的细菌细胞。随后称量根部重量，并通过涡旋振荡收集根表定殖的细菌细胞。将所得菌悬液用磷酸盐缓冲液（PBS）进行梯度稀释，之后涂布于Luria-Bertani（LB）琼脂培养基上。平板在37 °C下培养10小时后，计数LB平板上的单菌落，并将其标准化以表示定殖在根部的细菌数量。该方法可用于单菌互作条件下根际细菌定殖的检测，具有良好的可重复性。
引言
检测单一细菌菌株在根际定殖的方法包括定量和定性方法。对于定性方法，应使用持续表达荧光的菌株，并通过荧光显微镜或激光共聚焦仪器观察荧光的分布和强度1,2。这些策略能够较好地反映细菌在原位（in situ）的定殖情况3，但在定量方面不如传统的平板计数法准确。此外，由于显微镜只能显示部分根区，有时可能受到主观偏差的影响。
本文介绍了一种定量方法，包括收集定植在植物根部的细菌细胞，并通过平板计数菌落形成单位（CFU）。该方法基于稀释与涂布平板技术，可对从植物根部剥离的定植菌株进行计数，从而计算根部定植的细菌总数4,5。
首先，在水培条件下培养拟南芥（A. thaliana），然后将细菌细胞接种至根际，终浓度为 0.01 OD600。接种后 2 天采集受感染的根组织，并用无菌水清洗以去除未定植的细菌细胞。进一步收集定植在根部的细菌细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释后，接种于Luria-Bertani（LB）琼脂培养基上。在 37 °C 培养 10 小时后，计数 LB 平板上的单菌落，并进行归一化....
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方案
1. 无菌水培 A. thaliana 培养
- 准备 A. thaliana 幼苗。
- 制备培养 A. thaliana 幼苗的培养基，其成分为含2%（wt/vol）蔗糖和0.9%（wt/vol）琼脂的1/2 MS培养基（Murashige和Skoog）。
- 在培养基凝固前，将其倒入无菌的方形培养皿（13 cm × 13 cm）中。避免空气干燥，以保持湿度。
- 将 A. thaliana 种子浸入装有1 mL无菌水的2 mL微量离心管中，在4 °C下放置超过12小时，然后用1 mL 2%（vol/vol）NaClO处理2分钟进行种子灭菌。
- 用无菌水彻底清洗种子六次，以去除NaClO溶液。使用无菌的1 mL枪头将种子播种到含有MS琼脂培养基的培养皿中。
- 用透气医用胶带密封培养皿，并将其垂直放置于光照培养箱中培养1周。设置光照培养箱的光/暗周期为16小时/8小时，温度维持在23 °C，湿度维持在40%–60%。
- 移栽 A. thaliana。
- 在孔径为40 µm的细胞筛上打5 mm的孔，并对其进行灭菌处理。
- 将三株7日龄的 A. thaliana
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结果
为检验该方法检测细菌定植能力的准确性 A. thaliana 根际，我们进行了接种 Bacillus velezensis SQR9 野生型及其衍生突变体 Δ8mcp 进入 A. thaliana 根际分别。该 Δ8mcp 是一种缺失所有编码趋化受体基因的突变体，其定植能力显著降低6我们通过现有的根部定殖检测方法，在接种后2天测定了其定殖情况。结果显示，根部定殖显著减少 Δ8mcp，表明该条件和方法能够有效检测细菌定植情况（图1C).
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讨论
为了获得良好的可重复性，本实验方案的定植检测过程包含四个关键步骤。首先，必须确保每次实验接种的细菌细胞数量完全相同。其次，需要用无菌水严格控制未定植细菌的清洗强度。第三，每个样品的稀释过程在进行前都必须进行涡旋振荡，使样品充分混匀，以避免因细菌易在微量离心管中沉降的特性而导致的吸液误差。因此，我们建议在每次吸液前使用涡旋振荡器混匀细菌悬液。第四，整个操作过程中必须严格保证无菌条件，以避免任何可能的污染。
该方法用于检测定植在根表的细菌。除了根表细菌外，内生细菌和真菌也会定植于植物根际7。利用本文所述的实验方案仍可检测内生细菌的定植能力，但需将根组织研磨以释放内生细菌。然而，内生真菌与细菌不同，主流方法大多采用透射电子显微镜（TEM）观察菌丝的生长情况，这是一种类似于荧光标记细菌进行可视化的定性检测方法8。
在比较不同菌株的定殖能力时，不应将它们接种于同一块6孔板中，以避免细菌挥发性物质9
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披露
作者声明，他们对本文内容不存在利益冲突。
致谢
本工作由国家自然科学基金（32370135）、中国农业科学院创新工程（CAAS-CSAL-202302）、江苏农林职业技术学院科技项目（2021kj29）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6孔板 | Corning | 3516 | |
| 滤膜细胞筛 | Solarbio | F8200-40µm | |
| 酶标仪 | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| MS培养基 | Hopebio | HB8469-5 | |
| NaClO | Alfa | L14709 | |
| 植物凝胶 | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| 方形培养皿 | Ruiai Zhengte | PYM-130 | |
| Vortex Genie2涡旋振荡器 | Scientific Industries | G560E |
参考文献
- Wang, B., Wan, C., Zeng, H. Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis. Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).
- Zhai, Z., et al. A genetic tool for production of GFP-exp....
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