在水培条件下测量 拟南芥 根上的细菌定植

有定量和定性方法可用于检测单一细菌菌株的根际定植。对于定性方法，应使用组成型表达荧光的菌株，并且应在荧光显微镜或激光共^{聚焦仪器1,2}下检查荧光分布和强度。这些策略可以很好地反映细菌原位定植 ³，但它们在定量方面不如传统的平板计数方法准确。此外，由于在显微镜下只能显示部分根区的限制，有时可能会受到主观偏见的影响。

在这里，我们描述了一种定量方法，其中包括收集定植的细菌细胞并计数板上的细菌 CFU。该方法基于稀释和铺板，通过该方法可以计算从植物根部剥离的定植菌株，^{并且可以计算出}根部上的总定植细菌数^4,5。

首先，在水培条件下培养 拟南芥 ，然后在根际中以终浓度0.01 OD₆₀₀接种细菌细胞。接种后 2 天收获感染的根组织，并用无菌水洗涤以去除未定植的细菌细胞。此外，收集定植在根上的细菌细胞，在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 缓冲液中稀释，并接种到 Luria-Bertani （LB） 琼脂培养基上。在37°C孵育10小时后，对LB平板上的单个菌落进行计数并归一化以确定定植在根上的细菌细胞。

该方法适用性强，重复性好，更适用于根际细菌定植的准确测定。

1.无菌水培拟南芥栽培

1. 准备 拟南芥 幼苗。
   1. 准备培养 拟南芥 幼苗培养基，其由1/2MS培养基（Murashige和Skoog）与2%（wt / vol）蔗糖和0.9%（wt / vol）琼脂组成。
   2. 在凝固之前，将准备好的灭菌培养基倒入无菌方形培养皿（13 cm x 13 cm）中。避免风干以保持湿度。
   3. 将 拟南芥 种子浸入装有1mL无菌水的2mL微量离心管中，在4°C下浸泡12小时以上，然后用1mL 2%（体积/体积）NaClO灭菌种子2分钟。
   4. 用无菌水彻底清洗种子六次，以去除NaClO溶液。用 MS 琼脂培养基将种子播种在培养皿上，吸头为无菌 1 mL。
   5. 用透气的医用胶带密封培养皿，并将它们垂直放置在光照培养箱中生长 1 周。将光照培养箱昼夜比设置为16小时/ 8小时，保持温度为23°C，湿度为40%-60%。
2. 移植拟 南芥。
   1. 在 40 μm 孔径细胞染色剂上切 5 mm 孔并无菌。
   2. 通过细胞过滤器的孔移植三株 7 天大的 拟南芥 植物，并将它们放入含有 3 mL 无菌液体 1/2 MS 培养基和 0.5% 蔗糖的 6 孔板中。
   3. 将 6 孔板置于光培养箱中（图 1A）并孵育 10 天。

2.细菌培养和接种

1. 准备用于接种的细菌悬浮液。
   1. 对于 贝氏芽孢杆菌，将细菌细胞接种到无菌LB培养基中，并在37°C下以170rpm振荡孵育，直至达到0.8-1.2的OD₆₀₀ 。
   2. 通过以6000×g离心2分钟收集细菌细胞，并将细胞重悬于PBS缓冲液（2mM KH₂PO 4,8mM Na₂HPO_4,136mM NaCl，2.6mM KCl）中。重复离心和重悬步骤 3 次，以去除 LB 培养基和细菌代谢物。
   3. 将细菌细胞悬浮在新鲜的 1/2 MS 培养基中，终浓度为 OD₆₀₀ 0.01。将细菌悬浮液接种到培养 拟南芥 幼苗的6孔板上，将6孔板置于光照培养箱中，培养2天。

3. 测量定植在根部的细菌

1. 收获根组织并铺板定植细胞。
   注意:所有步骤都应在gnotobiotic条件下进行
   1. 称量 2 mL 试管并将重量记录为 W₀。
   2. 收获共培养的 拟南芥 根组织，并在无菌水中洗涤3次。将根放在滤纸上以去除多余的水。
   3. 将根放入称量的微量离心管中，将根与管一起称取，记录为W₁。
   4. 向每个试管中加入 1 mL PBS，并以最大速度涡旋试管 8 分钟。
   5. 将含有收集的根定植细菌细胞的悬浮液稀释至 1 x ^10-1-1 x ^10-4（根据细菌定植能力）。将稀释的细菌悬浮液铺在含有LB琼脂培养基的平板上，并在37°C下孵育10小时。
2. 对菌落进行计数并对数据进行归一化。
   1. 计算LB平板上的细菌菌落。
   2. 根据相应的稀释度计算CFUs，并用根鲜重（W_{1-W 0}）对数据进行归一化。最终结果表明，接种后2天每克根定植的细菌细胞计数（图1B）。

为了检验该方法在 拟南芥根际中检测细菌定植能力的准确性，我们分别将 芽孢杆 菌SQR9 WT和衍生突变体 Δ8mcp 接种到 拟南芥 根际中。 Δ8mcp 是一种缺乏所有化学感受器编码基因的突变体，并且它的定植显着减少6。我们通过目前的根定植测定法在接种后 2 天测量了它们的定植。结果表明， Δ8mcp的根系定植显著减少，表明该条件和方法有效地测量了细菌定植（图1C）。

图1: 拟南芥 的生长和 芽孢杆菌 SQR9和 Δ8mcp的根定植。 （A） 在水培条件下使用细胞染色器在 6 孔板中生长的 7 日龄 拟南芥的俯视图。（B） 7日龄 拟南芥在6孔板中生长的侧视图，每个孔含有3个幼苗。（C） 使用所提出的测定法测量的 B. velezensis 野生型 SQR9 和 Δ8mcp 的定植。共纳入6次重复，数据以SEM±平均值表示。 请点击这里查看此图的较大版本.

作者声明，他们与本文的内容没有利益冲突。