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测量细菌定植 拟南芥 水培条件下的根系

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DOI：

10.3791/66241

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2024年3月1日

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1State Key Laboratory of Efficient Utilization of Arid and Semi-arid Arable Land in Northern China, Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, College of Life Science and Technology, Huazhong Agricultural University, 3Jiangsu Provincial Key Lab for Organic Solid Waste Utilization, National Engineering Research Center for Organic-based Fertilizers, Jiangsu Collaborative Innovation Center for Solid Organic Waste Resource Utilization, Nanjing Agricultural University, 4Jiangsu Engineering and Technology Center for Modern Horticulture, Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry

本文内容

摘要

植物根际促生细菌（PGPR）在根际的定殖对其促生作用至关重要。因此，有必要标准化细菌根际定殖的检测方法。本文描述了一种可重复的定量细菌在根表定殖的方法。

摘要

测量细菌在拟南芥（Arabidopsis thaliana）根部的定殖是植物-微生物互作研究中最常见的实验之一。为了提高实验的可重复性，有必要建立一种标准化的方法来定量根际中的细菌定殖。我们首先在水培条件下培养无菌的拟南芥（A. thaliana），然后将细菌接种至根际，终浓度为 OD600 0.01。接种后第2天，采集根组织并用无菌水清洗三次，以去除未定殖的细菌细胞。随后称量根部重量，并通过涡旋振荡收集根表定殖的细菌细胞。将所得菌悬液用磷酸盐缓冲液（PBS）进行梯度稀释，之后涂布于Luria-Bertani（LB）琼脂培养基上。平板在37 °C下培养10小时后，计数LB平板上的单菌落，并将其标准化以表示定殖在根部的细菌数量。该方法可用于单菌互作条件下根际细菌定殖的检测，具有良好的可重复性。

引言

检测单一细菌菌株在根际定殖的方法包括定量和定性方法。对于定性方法，应使用持续表达荧光的菌株，并通过荧光显微镜或激光共聚焦仪器观察荧光的分布和强度1,2。这些策略能够较好地反映细菌在原位（in situ）的定殖情况3，但在定量方面不如传统的平板计数法准确。此外，由于显微镜只能显示部分根区，有时可能受到主观偏差的影响。

本文介绍了一种定量方法，包括收集定植在植物根部的细菌细胞，并通过平板计数菌落形成单位（CFU）。该方法基于稀释与涂布平板技术，可对从植物根部剥离的定植菌株进行计数，从而计算根部定植的细菌总数4,5。

首先，在水培条件下培养拟南芥（A. thaliana），然后将细菌细胞接种至根际，终浓度为 0.01 OD600。接种后 2 天采集受感染的根组织，并用无菌水清洗以去除未定植的细菌细胞。进一步收集定植在根部的细菌细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释后，接种于Luria-Bertani（LB）琼脂培养基上。在 37 °C 培养 10 小时后，计数 LB 平板上的单菌落，并进行归一化处理，以确定定植在根部的细菌数量。

该方法适用性高，重复性好，更适合准确测定根际细菌定殖情况。

方案

1. 无菌水培 A. thaliana 培养

  1. 准备 A. thaliana 幼苗。
    1. 制备培养 A. thaliana 幼苗的培养基，其成分为含2%（wt/vol）蔗糖和0.9%（wt/vol）琼脂的1/2 MS培养基（Murashige和Skoog）。
    2. 在培养基凝固前，将其倒入无菌的方形培养皿（13 cm × 13 cm）中。避免空气干燥，以保持湿度。
    3. 将 A. thaliana 种子浸入装有1 mL无菌水的2 mL微量离心管中，在4 °C下放置超过12小时，然后用1 mL 2%（vol/vol）NaClO处理2分钟进行种子灭菌。
    4. 用无菌水彻底清洗种子六次，以去除NaClO溶液。使用无菌的1 mL枪头将种子播种到含有MS琼脂培养基的培养皿中。
    5. 用透气医用胶带密封培养皿，并将其垂直放置于光照培养箱中培养1周。设置光照培养箱的光/暗周期为16小时/8小时，温度维持在23 °C，湿度维持在40%–60%。
  2. 移栽 A. thaliana。
    1. 在孔径为40 µm的细胞筛上打5 mm的孔，并对其进行灭菌处理。
    2. 将三株7日龄的 A. thaliana 植株通过细胞筛的孔移栽，并放入含有3 mL无菌液体1/2 MS培养基（含0.5%蔗糖）的6孔板中。
    3. 将6孔板置于光照培养箱中（图1A），培养10天。

2. 细菌培养与接种

  1. 准备用于接种的细菌悬液。
    1. 对于Bacillus velezensis，将细菌接种至无菌LB培养基中，在37 °C、170 rpm振荡条件下培养，直至OD600达到0.8–1.2。
    2. 在6000 × g条件下离心2分钟收集菌体，并将菌体重悬于PBS缓冲液（2 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 136 mM NaCl, 2.6 mM KCl）中。重复离心和重悬步骤3次，以去除LB培养基及细菌代谢产物。
    3. 将细菌重悬于新鲜的1/2 MS培养基中，终浓度为OD600 0.01。将细菌悬液接种至培养有A. thaliana幼苗的6孔板中，将6孔板置于光照培养箱中，继续培养2天。

3. 测定定植于根部的细菌

  1. 收获根组织并接种定殖的细胞。
    注意：所有步骤均应在无菌条件下进行
    1. 称量2 mL离心管，并记录重量为W0。
    2. 收获共培养的A. thaliana根组织，用无菌水清洗3次。将根置于滤纸上以去除多余水分。
    3. 将根放入已称重的微量离心管中，连同管一起称重根组织，并记录为W1。
    4. 向每根离心管中加入1 mL PBS，以最大速度涡旋振荡8分钟。
    5. 根据细菌定殖能力，将含有根定殖细菌细胞的悬浮液稀释至1 × 10-1–1 × 10-4 。将稀释后的细菌悬浮液涂布于含有LB琼脂培养基的平板上，在37 °C下培养10小时。
  2. 计数菌落并标准化数据。
    1. 计数LB平板上的细菌菌落。
    2. 根据相应的稀释倍数计算CFU，并以根鲜重（W1–W0）对数据进行标准化。最终结果表示接种后第2天每克根组织中定殖的细菌细胞数量（图1B）。

结果

为检验该方法检测细菌定植能力的准确性 A. thaliana 根际，我们进行了接种 Bacillus velezensis SQR9 野生型及其衍生突变体 Δ8mcp 进入 A. thaliana 根际分别。该 Δ8mcp 是一种缺失所有编码趋化受体基因的突变体，其定植能力显著降低6我们通过现有的根部定殖检测方法，在接种后2天测定了其定殖情况。结果显示，根部定殖显著减少 Δ8mcp，表明该条件和方法能够有效检测细菌定植情况（图1C).

拟南芥根定殖；多孔板设置；微生物生长曲线；实验结果。
图1：A. thaliana 的培养及 Bacillus velezensis SQR9 和 Δ8mcp 的根部定殖情况。（A）水培条件下，在6孔板中培养7天的A. thaliana顶部视图，孔内含有细胞染料。（B）6孔板中培养7天的A. thaliana侧面视图，每孔含3株幼苗。（C）利用本实验方法检测B. velezensis野生型SQR9与Δ8mcp突变株的定殖能力。实验包含六个重复，数据以均值±标准误表示。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

为了获得良好的可重复性，本实验方案的定植检测过程包含四个关键步骤。首先，必须确保每次实验接种的细菌细胞数量完全相同。其次，需要用无菌水严格控制未定植细菌的清洗强度。第三，每个样品的稀释过程在进行前都必须进行涡旋振荡，使样品充分混匀，以避免因细菌易在微量离心管中沉降的特性而导致的吸液误差。因此，我们建议在每次吸液前使用涡旋振荡器混匀细菌悬液。第四，整个操作过程中必须严格保证无菌条件，以避免任何可能的污染。

该方法用于检测定植在根表的细菌。除了根表细菌外，内生细菌和真菌也会定植于植物根际7。利用本文所述的实验方案仍可检测内生细菌的定植能力，但需将根组织研磨以释放内生细菌。然而，内生真菌与细菌不同，主流方法大多采用透射电子显微镜（TEM）观察菌丝的生长情况，这是一种类似于荧光标记细菌进行可视化的定性检测方法8。

在比较不同菌株的定殖能力时，不应将它们接种于同一块6孔板中，以避免细菌挥发性物质9和植物挥发性物质10,11的相互影响。我们选择接种后2天检测根部定殖情况，因为SQR9的定殖量在接种后2至4天达到峰值；检测细菌定殖的时间可根据具体菌株进行调整。

与其他已报道的方法相比，本方法准确且易于操作。例如，Noam 等人所描述的方法是在将拟南芥从固体培养基转移至水培条件时立即接种细菌12,13。而我们建议在移栽数天后再向根际接种细菌，以避免植物适应新生长环境的过程对实验结果产生影响。本研究所描述的方法也有利于植物释放根系分泌物，从而影响细菌的定殖过程。

为了使植物茎叶在空气中独立生长，完全避免与液体接触，我们对细胞染色盒进行了一些小的改进和处理，使其适用于这种水培方法。此外，该方法更适合于精确测定少量细菌定植情况，而不适用于水培中大量收集根系分泌物的情况14。需要注意的是，本方法是在先前已发表的研究基础上进行修改的12,14,15。

披露

作者声明，他们对本文内容不存在利益冲突。

致谢

本工作由国家自然科学基金（32370135）、中国农业科学院创新工程（CAAS-CSAL-202302）、江苏农林职业技术学院科技项目（2021kj29）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
6孔板Corning3516
滤膜细胞筛SolarbioF8200-40µm
酶标仪 TecanInfinite M200 PRO
MS培养基HopebioHB8469-5
NaClOAlfaL14709
植物凝胶Sigma-AldrichP8169
方形培养皿Ruiai ZhengtePYM-130
Vortex Genie2涡旋振荡器Scientific IndustriesG560E

参考文献

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