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利用体外组织灌注系统实时检测分离肠管的功能活性

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DOI：

10.3791/66243

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2024年7月26日

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1Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Basic Medical College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Medical and Life Sciences, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Chengdu Integrated TCM and Western Medicine Hospital

本文内容

摘要

我们介绍一种分离大鼠肠管并评估药物对其张力、频率和振幅影响的方法 体外该方法为研究肠管的科研人员提供了一种有价值的途径。

摘要

胃肠道疾病发病率较高，给人类健康带来巨大挑战。小肠在食物和药物的消化与吸收过程中起关键作用，对于这些疾病的治疗具有重要意义。肠道平滑肌运动实验是一种常见且重要的 体外 方法，用于研究胃肠道动力学。包括分离肠管的制备，将制备好的肠管悬挂于浴槽中并连接至信号检测器。随后记录和分析一系列参数，如张力，可用于评估肠道运动功能，以及维持肠管活性的注意事项 体外从取样到数据采集的标准化流程极大地提高了实验数据的可重复性，并确保了在生理、病理及药物干预后对肠道张力记录的真实性。本文提出了胃肠道动力调节药物研究中实验操作的关键问题，并提供了一份有价值的参考实验方案。

引言

胃肠道疾病是一种常见病，严重危害人类生命健康1。胃肠动力障碍是功能性胃肠道疾病的重要组成部分，主要表现为严重症状、胃排空延迟以及严重的胃部问题2。该障碍可破坏胃肠道协调性，阻碍胃排空，影响肠道食物耐受性，甚至导致小肠或大肠的功能性梗阻3。对于接受胃肠道手术的患者，这种障碍可直接导致肠功能衰竭。此外，肠道紊乱不仅与胃肠道疾病相关，还与其他多种疾病的致病因素有关，例如乙型肝炎和中枢神经系统疾病。肠道微生物群在肠道生理功能（包括胃肠动力）中发挥重要的调节作用，进而影响微生物生态系统内的定植4。随着乙型肝炎病毒感染进展为慢性乙型肝炎，肠道菌群会发生不同程度的改变。调节肠道菌群已在乙型肝炎病毒治疗中显示出益处5。此外，中枢神经系统可影响肠道并改变其微生物组成。近年来微生物组测序技术的进步揭示了肠道微生物群与中枢神经系统功能之间存在双向相互作用，这与中枢神经系统疾病的发病和进展密切相关6,7。

随着社会老龄化，胃肠道动力障碍的发病率不断上升，这与肠神经系统及肠道固有神经支配的神经功能减退或丧失密切相关8随着我们对胃肠道疾病认知的不断拓展，大量新理念和新方法不断涌现，有望推动新药的研发。然而，其中许多理念仍处于假设阶段，或有待积极的临床试验结果来加以验证9,10有效的研究方法对于攻克胃肠道疾病至关重要。近年来，大量研究聚焦于胃肠道药物及其运动功能的调控。胃肠道药物与胃肠道动力密切相关，许多其他全身性药物对胃肠道动力亦具有不同程度的影响。例如，非甾体抗炎药（NSAIDs）用于缓解疼痛和炎症，但会减缓胃肠道蠕动，增加消化性溃疡的风险11另一方面，某些抗抑郁药可能会影响胃肠道蠕动12目前，主要的 体外 研究胃肠道药物及其他全身性药物对胃肠动力影响的药理学实验是 体外 肠道运动实验13通过模拟生理条件，研究人员观察药物对肠平滑肌收缩与舒张的直接影响，以评估其对胃肠道的作用。然而，胃肠道动力障碍的确切病因尚不明确，可能涉及遗传、环境、饮食及神经内分泌因素之间的复杂相互作用。因此，胃肠道动力障碍的治疗仍面临重大挑战。

小肠作为消化、吸收和药物代谢的关键部位，在胃肠道功能中具有重要意义。因此，离体肠管运动实验是研究胃肠道疾病的重要工具。该方法包括制备动物离体肠管并将其置于浴槽中，连接换能器，利用传感器将机械运动转化为电信号，经放大后由生理记录仪记录。通过测量频率、振动平均振幅、张力及曲线下面积等参数，可评估肠管的运动功能。该方法具有操作简便、经济可行、实验条件易于控制、干扰因素少、重复性高以及结果准确可靠等优点，尤其适用于药物作用机制的研究。然而，离体肠管实验的操作仍存在明显挑战，例如肠管活性难以长时间维持。为解决这些问题并借鉴相关经验 体外 实验，本文将详细介绍实验操作中的关键问题，并为研究调节胃肠道动力药物提供一份有价值的参考实验方案。

方案

本实验方案基于先前已发表的文献14,15,16,17。本研究采用雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（260–300 g，8–10周龄）。动物实验方案经成都中医药大学管理委员会审查并批准（记录编号：2023017）。实验前，大鼠禁食24小时。实验期间，大鼠饲养于动物实验舱内，可自由摄食和饮水。

1. 溶液配制

  1. 制备生理盐溶液（PSS），其中包含 118 mM NaCl、4.7 mM KCl、2.5 mM CaCl2、1.2 mM KH2PO4、1.2 mM MgCl2∙6H2O、25 mM NaHCO3、11 mM D-葡萄糖和 5 mM HEPES（参见材料表）。
  2. 用 95% O2 和 5% CO2 的混合气体饱和溶液并持续通气。同时，使用 2 mM NaOH 将溶液的 pH 值维持在 7.38 至 7.42 之间。
  3. 将三分之一的 PSS 预冷至 4 °C，其余部分预热至 37 °C，以用于后续实验。
    注意：PSS 最初在步骤 1.1–1.2 中于室温下配制

2. 大鼠肠道解剖

  1. 准备盛有4°C PSS的培养皿、手术镊子和剪刀。通过吸入2%异氟烷对大鼠进行约5分钟的麻醉。通过脚趾夹捏试验确认大鼠已深度麻醉。如有必要，追加麻醉剂。随后，在手术台上打开腹腔，暴露肠管。
  2. 迅速将胃和肠管放入盛有4°C PSS（pH 7.40）并饱和通入95% O2 和5% CO2 的培养皿中。在胃的幽门处找到十二指肠，即小肠的起始部分。用镊子轻轻提起邻近组织，并用剪刀小心地将其从肠缘剪除。随后，将肠管切成1-2 cm长的节段；整个过程如图1所示。

3. 肠道的悬浮与固定（图2）

  1. 打开 体外 组织灌流系统，并将仪器浴槽温度调节至 37 °C。将预热至 37 °C 的生理盐溶液（PSS）加入浴槽中。
  2. 准备一根15 cm的外科缝线（参见 材料表）并将其浸泡在用95% O₂饱和的4 °C PSS中2 + 5% CO₂2用缝线固定肠管的一端，并用钢针钩固定另一端。
  3. 安装肠管。将肠段一端用钢针钩固定在浴槽底部，另一端的手术线连接至换能器。打开气体开关，使浴槽中产生气泡。
  4. 打开数据采集软件（参见 材料表）并点击“开始”以确保正在记录相应的路径信号。

4. 归一化

  1. 逆时针旋转浴槽的螺旋轴，使肠管松弛至其自然状态。单击 Setup-Zero All Inputs，以确保软件中肠管的初始张力设置为 0 g。
  2. 逆时针旋转浴槽的螺旋轴，将张力值调节至 1 g，并在 pH = 7.40、95% O2 + 5% CO2 饱和、37 °C 的 PSS 溶液中稳定 30 分钟。
    注意：肠管的归一化处理旨在将其预载荷调整至最佳状态。对于腔性样本，最佳预载荷对于维持其体外优异的活性至关重要。大鼠肠管的最佳预载荷为 1 g18。

5. 反应性的检测

  1. 在软件中观察节律性的自发收缩波，若出现此现象则表明反应充分，可继续进行下一项实验。

6. 实验观察

  1. 将测试药物（如乙酰胆碱等）加入浴槽中，以研究该药物对肠管功能的影响。
    注意：通过比较给药前后肠管收缩曲线的变化来评估药物的作用。加入药物时，应适当增大气泡以混匀药物，待混匀后再将气泡调节至正常状态。

7. 数据分析

注意： 体外 组织灌注系统具有四个通道，可同时对四种相同或不同的药物在四段肠管上的作用效果进行测试。由于所有通道的实验参数和分析方法均相同，因此选择其中一个通道作为数据处理的示例。

  1. 停止数据采集软件并在此软件中进行数据分析。编辑数据面板，并按如下方式选择分析参数：点击 Window-Data Pad，然后为该通道选择平均张力。
  2. 选择给药前的收缩曲线，点击 Add to Data pad；选择给药后的收缩曲线，点击 Add to data pad。给药前和给药后的平均张力值将依次显示在数据面板上。
  3. 点击 Window-Data Pad ，将数据复制到其他统计分析软件（参见材料表）中进行统计分析。
  4. 分析其他参数，例如平均幅度、平均频率和积分（曲线下面积），只需将平均张力替换为相应参数，操作方法与步骤6.1–6.3相同。
  5. 保存收缩曲线：选择收缩曲线，点击 Edit-Copy Labchart Data ，将数据复制到绘图软件（参见材料表）中绘制收缩曲线。

8. 术后治疗

  1. 手术后，按照机构批准的方案对动物实施安乐死。
    注：本研究中，动物通过吸入过量异氟烷实施安乐死。

结果

研究的第一部分着重于从机体中分离出孤立的肠管并将其制备成2 cm长的肠段的过程 体外该过程在下文中有详细说明。 图1第二部分涉及分离的肠管环的悬浮与标准化。该过程的成功体现在 图2，显示了正常管段的自动节律性收缩。最后，本研究考察了代表性收缩剂和舒张剂对离体肠管环的作用。结果发现，乙酰胆碱（0.3 µmol/L）和氯化钡（1.2 mmol/L）可增强这些管段的张力，而阿托品（300 µmol/L），肾上腺素（1 µmol/L）和硝苯地平（nifedipine）10 µmol/L）抑制了它们的张力，如图所示 图3.

该方法主要介绍离体肠管运动功能的测定。肠道运动受多种因素影响，大多数作用通过肠道内的受体介导。在胃肠道中存在多种受体，包括胆碱能M受体、肾上腺素能α和β受体、5-HT受体、组胺受体以及胃肠激素受体19。离体肠管的痉挛可由乙酰胆碱作用于M受体引起，这种效应可被阿托品阻断，因为阿托品是M受体的阻断剂（图3A）。然而，氯化钡中的钡离子进入肠段平滑肌并与钙调蛋白结合所引起的痉挛，则不能被阿托品阻断（图3B）。肾上腺素是α和β受体的激动剂（图3C），它可兴奋小肠的α受体和β2受体，导致平滑肌松弛，小肠收缩减弱，从而减缓蠕动，降低吸收速率。相比之下，硝苯地平可抑制Ca2+内流，促进肠道松弛（图3D），有助于缓解肠痉挛，降低肠内压力，并促进肠道对水分的吸收。

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图 1：肠段的分离。（A）大鼠体内的肠段；（B）将肠段从体内取出后置于含有 4 °C 生理盐溶液的培养皿中；（C）去除周围组织后的肠段；（D）实验中使用的长度为 2 cm 的肠段。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：分离肠管环的悬浮与标准化处理过程。 (A) 体外 组织灌注系统（参见 材料表); (B用铁钩和手术线在含有培养皿中固定肠管的两端 4 °生理盐溶液；(C将肠管固定在盛有溶液的浴槽之一中 37 °生理盐溶液；(D）给予预负荷并记录正常波形。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图3：药物对离体肠管的作用。 （A）乙酰胆碱（0.3 µmol/L）和阿托品（300 µmol/L）、（B）氯化钡（1.2 mmol/L）、（C）肾上腺素（1 µmol/L）以及（D）硝苯地平（10 µmol/L）对离体肠管的作用。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

胃肠道运动由一系列精确协调的平滑肌收缩和舒张完成。该过程包括一组肌群的节律性收缩、多组肌群的协调收缩以及特殊的推进性收缩20,21。胃肠道运动障碍的发生可能与多个层面的功能障碍有关，例如中枢神经系统、自主神经系统、肠神经系统以及胃肠道平滑肌。这些组织结构通过释放多种神经递质和体液因子共同发挥作用，这些因子与相应受体结合，从而执行不同的生理功能22。因此，研究药物作用的局部机制至关重要，而开展离体小肠实验可排除外来物质及中枢神经系统调节的干扰，从而提供更为准确的研究依据。

豚鼠回肠、兔空肠和十二指肠的离体肠管标本常用于实验动物研究。此外，大鼠和猫的回肠、十二指肠和空肠也可用于 体外 实验。该方法适用于离体组织。肠平滑肌具有自动节律性收缩的特性，并受肠壁内神经丛的影响。多种动物的离体肠管在适宜的生存环境中可维持其自发的运动功能。离体肠管实验具有操作简便、实验条件易于控制、影响因素少、重复性好、结果准确可靠等优点，更有利于探讨药物作用机制。此外，该方法被认为经济且可行。

这 体外 肠管实验也存在其局限性，例如使用含有杂质、无机离子、皂苷和鞣质等成分的未纯化粗制中药制剂，可能影响实验的可靠性。因此，有必要充分评估杂质及理化因素对实验结果的影响，包括液体的pH值以及各种电解质和杂质微粒。此外，还需提高体外实验仪器的稳定性及离体肠管的保存技术。在设计体外实验时，必须考虑所用药物或制剂是否符合实验要求（如杂质含量水平）。

在该方法中，需注意多项事项。首先，应将肠管从大鼠腹腔中取出，并在实验前浸泡于冷的PSS溶液中。此外，需将整段肠管剪成多个小段并置于冰箱中保存，以尽量减少对肠道的刺激。在给药过程中，必须确保给药管不与悬挂肠管的连线接触。同时，加入浴槽中的药物剂量应准确，且不可将药物直接加至浴槽壁或肠管上，以免影响实验结果。冲洗肠管时应采用轻柔操作，避免高压冲洗，以防组织收缩。建议使用镊子操作肠管，并避免其长时间暴露于空气中，以防止活性丧失。

本文展示了离体肠管实验的实验方法，通过观察多种传统药物对肠管受体的作用，阐明其对肠管运动的影响，为研究调节胃肠道运动的药物在胃肠道中的作用机制提供了一种有效的方法。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到成都中医药大学特殊人才计划的资助 "邢霖学者与学科人才研究促进计划" (33002324).

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙酰胆碱 Sigma, USAA6625
阿托品上海桑吉生物科技有限公司，中国IA06501
氯化钡麦克林生化科技有限公司，上海，中国B861682
CaCl2上海桑吉生物科技有限公司，中国A501330
D-葡萄糖上海桑吉生物科技有限公司，中国A610219
绘图软件GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥—
肾上腺素Sigma, USAE4642
HEPES西亚试剂有限公司，山东，中国S3872
离体组织灌流系统PowerLab, ADInstruments, 澳大利亚ML0146
KCl上海桑吉生物科技有限公司，中国A100395
KH2PO4上海桑吉生物科技有限公司，中国A100781
LabChart 专业版 8.3 ADInstruments, 澳大利亚—
MgCl2·6H2O上海桑吉生物科技有限公司，中国A100288
NaCl上海桑吉生物科技有限公司，中国A100241
NaHCO3上海桑吉生物科技有限公司，中国A100865
硝苯地平麦克林生化科技有限公司，上海，中国N5087
统计分析软件GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥—
外科缝合线Johnson, USA—

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