使用体外组织灌注系统实时检测离体肠管的功能活动

Summary

我们提出了一种分离大鼠肠管并评估药物对体外张力、频率和振幅的影响 的方法。这种方法为研究肠管的研究人员提供了一种有价值的方法。

Abstract

胃肠道疾病发病率高，对人类构成了相当大的挑战。小肠是食物和药物消化和吸收不可或缺的一部分，在治疗这些疾病中起着至关重要的作用。肠管运动实验是一种常见且必不可少 的体外 方法，用于研究胃肠道动力学。这包括制备分离的肠管，以及将制备好的肠管悬浮在浴槽中，并将其连接到信号检测器。随后记录和分析一系列参数，例如张力，这些参数可用于评估肠道运动功能，以及在 体外保持肠管活跃的考虑因素。从采样到数据采集的标准化程序，大大提高了实验数据的可重复性，保证了生理、病理、药物干预后肠道紧张记录的真实性。在这里，我们介绍了实验操作中的关键问题和研究调节胃肠蠕动的药物的有价值的参考实验方案。

Introduction

胃肠道疾病是一种普遍存在的疾病，严重影响人类的生活和健康¹。胃肠动力障碍是功能性胃肠道疾病的重要组成部分，主要表现为衰弱症状、胃排空延迟和严重的胃问题²。它会破坏胃肠道协调，阻碍胃排空，影响肠道食物不耐受，甚至导致小肠或大肠功能梗阻³。对于接受胃肠道手术的患者，这种疾病可直接导致肠衰竭。此外，肠道疾病不仅与胃肠道疾病有关，还与肝炎和中枢神经系统疾病等其他各种疾病的致病因素有关。肠道微生物群落在肠道生理学中起着至关重要的调节作用，包括运动性，这随后会影响微生物生态系统内的定植⁴。随着乙型肝炎病毒感染发展为慢性乙型肝炎，肠道菌群会发生不同程度的变化。调节肠道菌群已被证明对乙型肝炎病毒治疗有益⁵。此外，中枢神经系统可以影响肠道并改变其微生物组成。微生物群落测序技术的最新进展揭示了肠道菌群与中枢神经系统功能之间的双向相互作用，与中枢神经系统疾病的发生和进展密切相关 ^6,7。

随着社会老龄化，胃肠动力障碍的发病率不断上升，这与肠道神经系统神经元功能和肠道内在神经支配的下降或丧失有关⁸。随着我们对胃肠道疾病的理解不断扩大，出现了许多新的想法和方法，有可能促成新药的开发。然而，其中许多想法仍然是假设的，或者有待积极的临床试验结果来实现 ^9,10。有效的研究方法对于克服胃肠道疾病至关重要。近年来，广泛的研究集中在胃肠道药物和动力调节上。胃肠道药物和胃肠道动力学是不可分割的，许多其他全身性药物对胃肠道动力学的影响各不相同。例如，非甾体抗炎药 （NSAID） 用于治疗疼痛和炎症以及缓慢的胃肠道运动，从而增加消化性溃疡的风险¹¹。另一方面，一些抗抑郁药可能会影响胃肠蠕动¹²。目前，研究胃肠道药物和其他全身性药物对胃肠动力影响的主要体外药理实验是体外肠道运动测定¹³。通过模拟生理条件，他们观察药物对肠道平滑肌收缩和松弛的直接影响，评估其胃肠道影响。然而，胃肠道动力障碍的确切原因尚不清楚，可能是遗传、环境、饮食和神经内分泌因素的复杂相互作用。因此，胃肠道动力障碍的治疗继续构成重大挑战。

小肠是消化、吸收和药物代谢的重要部位，在胃肠道功能中具有重要意义。因此，离体肠管运动测试是研究胃肠道疾病的重要工具。这包括准备动物的孤立肠管并将其放入浴中，将其连接到能量交换器，利用传感器将机械运动转换为电信号进行放大，并通过生理记录器进行记录。可以测量各种参数，如频率、平均振动幅度、张力和曲线下面积，以评估肠管的运动功能。该方法具有简单、经济可行、实验条件易于控制、影响因素最小、重现性高以及结果准确可靠等优点。此外，它对于研究药物作用机制特别有用。然而，离体肠管实验的操作存在显着的挑战，例如，肠道活动难以长时间维持。为解决这些问题并借鉴 体外 实验经验，本文将详细介绍实验操作中的关键问题，并为研究调节胃肠动力的药物提供有价值的参考实验方案。

Protocol

该协议源自先前发表的文献 14,15,16,17。雄性 Sprague Dawley （SD） 大鼠 （260-300 g，8-10 周龄） 用于本研究。动物方案由成都中医药大学管理委员会审查和批准（记录号 2023017）。实验前，指示大鼠禁食 24 小时。在实验期间，大鼠被关在动物房间里，可以自由获得食物和水。

1. 溶液制备

1. 制备含有 118 mM NaCl、4.7 mM KCl、2.5 mM CaCl₂、1.2 mM KH₂PO₄、1.2 mM MgCl₂∙6H₂O、25 mM NaHCO₃、11 mM D-葡萄糖和 5 mM HEPES 的生理盐溶液 （PSS）（参见 材料表）。
2. 使溶液饱和，并用 95% O₂ 和 5% CO₂ 的混合气体鼓泡。同时，用 2 mM NaOH 将溶液的 pH 值保持在 7.38 和 7.42 之间。
3. 将 1/3 的 PSS 预冷至 4 °C，并将其余的预热至 37 °C 以进行后续实验。
   注意:PSS 最初是在室温下在步骤 1.1-1.2 中制备的

2. 大鼠肠管清扫术

1. 收集装满 4°C PSS、手术镊子和剪刀的培养皿。施用 2% 异氟醚，通过吸入麻醉大鼠约 5 分钟。通过进行脚趾捏试验来验证大鼠是否被深度麻醉。如有必要，给予额外的麻醉剂。接下来，通过在手术台上打开腹腔来暴露肠管。
2. 将胃管和肠管快速放入填充有 4 °C PSS （pH 7.40） 且 95% O₂ 和 5% CO₂ 饱和的培养皿中。在胃的幽门中找到十二指肠，这是小肠的起点。使用镊子小心地提起邻近的组织，然后用剪刀小心地将其从肠道边缘修剪掉。随后，将肠子分成 1-2 厘米的段;整个过程如图 1 所示。

3. 肠管的悬吊和固定（图 2）

1. 打开 体外 组织灌注系统，将仪器中的浴温调节至 37 °C。 将 PSS （37 °C） 放入浴中。
2. 准备一根 15 厘米的手术缝合线（见 材料表）并将其浸泡在浸有 95% O₂ + 5% CO₂ 的 4 °C PSS 中。使用缝合线固定肠管的一端，并使用钢针钩固定另一端。
3. 安装肠管。用钢针钩将节段安装在浴槽底部，并将手术管路的另一端连接到换能器。打开燃气开关，让气泡在浴缸中出现。
4. 打开数据采集软件（参见 材料表）并单击 Start 以确保记录了相应的路径信号。

4. 归一化

1. 逆时针旋转浴槽的螺旋轴，使肠管放松到自然状态。单击 Setup-Zero All Inputs 以确保在软件中将肠管的初始张力设置为 0 g 。
2. 逆时针旋转浴槽的螺旋轴，将张力值拉至 1 g ，并将其稳定在 pH = 7.40、95% O₂ + 5% CO₂ 饱和 37 °C PSS 中 30 分钟。
   注意:肠管的正常化是将其预负荷调整到最佳状态。对于腔体样品，需要最佳的预载荷才能在体外保持出色的活性。大鼠肠管的最佳前负荷为 1 g¹⁸。

5. 反应性检测

1. 在软件中观察有节奏的自发收缩波，然后进行下一个实验，因为这表明有足够的反应。

6. 实验观察

1. 将供试药物（如乙酰胆碱等）加入浴中，研究药物对肠管功能的影响。
   注意:通过比较肠道收缩曲线的给药前后变化来评估药物的效果。加入药物时，适当增大气泡混合药物，混合后再将气泡调整至正常。

7. 数据分析

注: 体外 组织灌注系统有四个通道，可同时对四种相同或不同的药物对四根肠管的影响进行测试。由于所有通道的实验参数和分析方法相同，因此选择一个通道作为数据分析示例。

1. 停止 数据采集软件并在此数据采集软件上进行数据分析。编辑数据板并选择分析参数，如下所示:单击 Window-Data Pad 并选择通道 的平均张力 。
2. 选择给药前的收缩曲线，然后单击 添加到数据板;选择给药后的收缩曲线，然后单击 Add to data pad.给药前后的平均张力值将依次出现在数据板上。
3. 单击 Window-Data Pad 将数据复制到其他统计分析软件（参见 材料表）进行统计分析。
4. 分析其他参数，如 平均振幅、平均频率和 积分（曲线下面积），只需将 平均张力 替换为相应的参数，操作与步骤 6.1-6.3 相同。
5. 保存收缩曲线:选择收缩曲线，点击 编辑-复制 Labchart 数据 ，将数据复制到绘图软件（见 材料表）绘制收缩曲线。

8. 术后治疗

1. 手术后，按照机构批准的方案对动物实施安乐死。
   注意:在本研究中，通过吸入过量的异氟醚对动物实施安乐死。

Results

该研究的第一部分侧重于将分离的肠管与体内分离并在 体外将它们转化为 2 厘米管的过程。 图 1 中详细说明了此过程。第二部分涉及离体肠管环的悬浮和标准化。 图 2 展示了这个过程的成功，它显示了正常管的自动节律性收缩。最后，该研究检查了代表性收缩剂和松弛剂对离体肠管环的影响。研究发现，乙酰胆碱 （0.3 μmol/L） 和氯化钡 （1.2 mmol/L） 增强了这些管中的张力，而阿托品 （300 μmol/L）、肾上腺素 （1 μmol/L） 和硝苯地平 （10 μmol/L） 抑制了它们的张力，如图 3 所示。

该方法主要介绍离体肠管运动功能的测定。肠道运动受多种因素影响，其中大部分影响是通过肠道中的受体施加的。在胃肠道中，有多种受体，包括胆碱能 M 受体、肾上腺素能 α 和 β 受体、5-HT 受体、组胺受体和胃肠道激素受体¹⁹。离体肠道中的痉挛可能是由乙酰胆碱对 M 受体的作用引起的。这种作用可以被阿托品阻断，阿托品充当 M 受体的阻断剂（图 3A）。然而，阿托品不能阻断肠段平滑肌的痉挛，这是由钡离子进入氯化钡及其与钙调蛋白的结合引起的（图 3B）。肾上腺素作为 α 和 β 受体的激动剂（图 3C）。它激发小肠的 α 受体和 β₂ 受体，导致平滑肌松弛和小肠收缩减弱。结果，蠕动减慢，吸收率降低。相比之下，硝苯地平阻止 Ca²⁺ 的内部流动并促进肠道舒张（图 3D）。这有助于缓解肠道痉挛，降低肠道压力，并促进肠道吸收水分。

图 1:肠管的分离。 （A） 大鼠的肠管;（B） 从体内取出肠管，置于含有 4 °C 生理盐溶液的培养皿中;（C） 去除周围组织后的肠管;（D） 实验中使用的 2 cm 长肠管。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:分离的肠管环的悬浮和标准化过程。 （A） 体外 组织灌注系统（见 材料表）;（B） 用铁钩和手术线将肠管的两端固定在含有 4 °C 生理盐溶液的培养皿中;（C） 将肠管固定在含有 37 °C 生理盐溶液的浴槽中;（D） 给出预载荷并记录法向波形。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:药物对离体肠管的影响。 （A） 乙酰胆碱 （0.3 μmol/L） 和阿托品 （300 μmol/L） 、 （B） 氯化钡 （1.2 mmol/L） 、 （C） 肾上腺素 （1 μmol/L） 和 （D） 硝苯地平 （10 μmol/L） 对离体肠管的影响。 请单击此处查看此图的较大版本。

Discussion

胃肠蠕动是通过一系列精确协调的平滑肌收缩和放松来完成的。这个过程涉及一组肌肉群的节律性收缩、多组肌肉的协调收缩和特殊的推进收缩^20,21。胃肠动力障碍的发生可能与不同层次的功能障碍有关，如中枢神经系统、自主神经系统、肠神经系统和胃肠道平滑肌。这些组织结构通过释放各种神经递质和体液因子共同发挥作用，这些神经递质和体液因子与相应的受体结合以执行不同的生理功能²²。因此，研究药物作用的局部机制是必不可少的，进行体外小肠实验可以通过排除外来物质和中枢神经系统调节的干扰来提供更准确的见解。

实验动物常用豚鼠回肠、兔空肠和十二指肠的离体肠管标本。此外，大鼠和猫的回肠、十二指肠和空肠也可用于 体外 实验。这种方法适用于离体组织。肠道平滑肌具有自动节律收缩的特点，受肠壁神经丛的影响。许多动物的离体肠管可以在合适的生存环境中保持其自发的运动功能。体外肠管实验具有操作简单、实验条件易于控制、影响因素少、重现性好、结果准确可靠等优点，更有利于药物作用机制的讨论。此外，这种方法被认为是经济可行的。

体外肠管实验也有其局限性，如使用含有杂质、无机离子、皂苷和单宁的未纯化的生中药制剂，这会影响实验的可靠性。因此，有必要充分评价杂质和理化因素对实验结果的影响，包括液体的 pH 值和各种电解和杂质颗粒。此外，提高体外实验仪器的稳定性和体外肠管的保存技术是必要的。在设计体外实验时，必须考虑所使用的药物或制剂是否满足这些实验的要求（例如，杂质水平）。

在这种方法中，需要注意几个注意事项。首先，应在实验前从大鼠的腹腔中取出肠管并浸泡在冷的 PSS 中。此外，将整根管子切成多块并存放在冰箱中，以尽量减少对肠道的任何刺激也很重要。在加药过程中，确保加药管不与悬挂肠管的管路接触至关重要。此外，加入浴中的药物量应准确，不得将药物添加到浴池壁或直接添加到肠管中，以免影响结果。冲洗肠管时，应使用温和的方法，并应避免高压冲洗，以防止组织挛缩。建议用镊子处理肠管，避免将其长时间暴露在空气中，以防止任何活动丧失。

本文介绍了离体肠管实验的实验方法，利用作用于肠受体的各种传统药物的作用来说明它们对肠管运动的影响，这为研究调节胃肠道蠕动的药物的作用机制提供了一种有效的方法。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
乙酰胆碱	Sigma， USA	A6625
阿托品	Sangon Biotech Co.， Ltd.， 上海， 中国	IA06501
氯化钡	Macklin Biochemical Co.，Ltd.，中国上海	B861682
CaCl2	Sangon Biotech Co.， Ltd.， 上海， 中国	A501330
-葡萄糖	Sangon Biotech Co.， Ltd.， 上海， 中国	A610219
绘图软件	GraphPad Software， San Diego， California， USA	—
肾上腺素	Sigma，美国	E4642
HEPES	希亚试剂有限公司，山东，中国	S3872
体外组织灌注系统	PowerLab，ADInstruments，澳大利亚	ML0146
KCl	Sangon Biotech Co.，Ltd.，中国上海	A100395
KH2PO4	Sangon Biotech Co.， Ltd.， 上海， 中国	A100781
LabChart Professional 版本 8.3	ADInstruments， 澳大利亚	—
MgCl2·6H2O	Sangon Biotech Co.， Ltd.，中国上海	A100288
NaCl	Sangon Biotech Co.， Ltd.，中国上海	A100241
NaHCO3	Sangon Biotech Co.， Ltd.，中国上海	A100865
苯地平	麦克林生化有限公司，中国上海	N5087
统计分析软件	GraphPad Software，美国加利福尼亚州	—
手术缝合	Johnson， USA	—