RNA干扰（RNAi）技术在许多体型微小的寄生性天敌昆虫中的应用面临巨大挑战，例如 赤眼蜂属 黄蜂。本研究阐明了一种高效的RNAi方法 赤眼蜂（Trichogramma dendrolimi）. 本方法为研究基因调控提供了一个可靠的模型 赤眼蜂属 黄蜂
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摘要
摘要
卵寄生蜂Trichogramma spp. 被公认为在农业和林业中防治多种鳞翅目害虫的有效生物防治剂。Trichogramma 后代的幼体阶段在寄主卵内发育，体型极为微小（成虫体长约0.5 mm）。RNA干扰（RNAi）技术已成为阐明多种生物基因功能的关键工具。然而，在某些小型寄生蜂（如Trichogramma）中实施RNAi操作通常面临重大挑战。本研究提出了一种在Trichogramma dendrolimi中高效实施RNAi的方法。该方案包括从寄主卵中获取并分离单个T. dendrolimi个体、设计与合成双链RNA（dsRNA）、体外移植与培养T. dendrolimi蛹、显微注射dsRNA，以及通过RT-qPCR分析评估靶基因的敲低效果。本研究提供了一套完整且图文详尽的T. dendrolimi RNAi实验操作流程，使研究人员能够深入探究该物种的基因调控机制。此外，该方法经少量调整后亦可适用于其他Trichogramma物种的RNAi研究或显微注射实验，因此可为开展其他内寄生性物种的RNAi实验提供重要参考。
引言
Trichogramma 属是一类卵寄生蜂，在全球范围内的农业和森林生态系统中被广泛用作高效生物防治剂，以防控多种鳞翅目害虫1,2,3,4。大规模人工繁殖的Trichogramma 的应用为害虫的可持续治理提供了一种环境友好型策略5,6,7。通过研究基因调控和基因组编辑方法10，深入了解Trichogramma 蜂的分子生物学特性，可为提高这些生物防治剂的大规模繁殖效率和田间表现提供重要依据8,9。
自从发现双链RNA（dsRNA）介导的特异性基因干扰以来 秀丽隐杆线虫 自1998年以来，RNA干扰（RNAi）技术已发展成为一种重要的遗传学工具，通过抑制目的基因的表达来研究生物体的调控机制11RNAi 实验已成为研究多种昆虫物种基因功能的常用标准方法12,13然而，在许多寄生蜂物种中，尤其是内寄生的小蜂总科（Chalcidoidea）物种中，RNAi 的操作仍面临巨大挑战。14,15,16RNAi 方法已在至少 13 种寄生性天敌物种中得到记录14,15,16,17,18,19在这些方法中，RNAi 方法已被全面开展 Nasonia 黄蜂，且适用于其整个发育阶段，包括胚胎、幼虫、蛹和成虫14,15,16值得注意的是 Nasonia 黄蜂是体外寄生性寄生蜂，其后代在寄主蛹与蛹壳之间的间隙中发育，因此可进行人工培养 体外 并使其能够耐受某些处理，例如显微注射。与 纳索尼亚 黄蜂， 赤眼蜂属 个体在寄主卵内完成整个胚胎、幼虫和蛹的发育。胚胎期和幼虫期的组织层次（可能阻碍dsRNA渗透）、对损伤的敏感性，以及存活困难等问题 体外 构成严峻的障碍20,21,22此外，其微小的尺寸 赤眼蜂属 个体大小约为成虫或蛹期长度的0.5 mm，使其操作极为复杂20,21,22.
在本研究中，我们概述了一项在 赤眼蜂（Trichogramma dendrolimi） 松村。该方案包括以下步骤：（1）双链RNA（dsRNA）的设计与合成，（2）显微注射 T. denrolimi 蛹，(3) 移植与 体外 孵育这些蛹，以及（4）通过RT-qPCR分析检测目标基因的敲低效果。RNAi实验中选定的目标基因为 铁蛋白重链同源性 (Ferhch）。FerHCH 是一种铁结合蛋白，含有具备抗氧化能力的亚铁氧化酶中心，可促进 Fe²⁺ 的氧化2+ 至 Fe3+它通过维持氧化还原平衡和铁稳态，在多种生物的生长发育过程中发挥着不可或缺的作用。FerHCH的耗竭可导致铁的过度积累，引发不可逆的组织损伤，并常常导致显著的表型改变，包括生长缺陷、畸形和死亡23,24本研究提供了进行RNAi的逐步操作指南 T. denrolimi，这对于在更广泛的背景下研究基因功能将具有重要价值 赤眼蜂属 黄蜂
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方案
注意：有关本实验方案中使用的所有材料、仪器、软件和试剂的详细信息，请参见材料表。
1. 昆虫培养物的收集与保育
- 使用体积比为1:5的阿拉伯胶粉末水溶液，将约5,000粒谷螟卵（Corcyra cephalonica (Stainton)）粘附于一张9 cm × 16 cm的卡片上25,26。
注意：避免在卡片上粘附过多寄主卵，过度密集会妨碍后续的转移和解剖操作。 - 为防止寄主卵孵化，将寄主卵卡片置于紫外光（UV）下照射30分钟（图1-i）。随后，将含有灭活卵的纸张裁剪成直径8 cm、厚1 cm的卵卡，每张卵卡包含约300–500粒卵（图1-ii）25,26,27。
- 将80–120头T. denrolimi蜂引入一根直径2 cm、长8 cm的玻璃管中，并用棉塞密封管口。
注意：将蜂类维持在25 ± 1 °C的温度条件下，光照周期为16小时光照/8小时黑暗，并保持相对湿度约为75%。 - 将一张寄主卵卡放入玻璃管中供蜂寄生（图1-ii）。让蜂在寄主卵内产卵6小时，之后立即移除蜂体。
注意：避免寄生时间过长，否则可能导致多个T. denrolimi后代在同一寄主卵内发育，造成子代蜂死亡率升高28,29。
2. 双链RNA的合成
- 设计含有T7启动子的引物组，用于合成双链RNA（dsRNA）。从目标基因中选择一段300-400 bp的片段Ferhch用于dsRNA合成。
- 获取用于靶基因dsRNA及对照dsRNA生产的商业化合成引物组GFP 用作阴性对照。
- 从100中提取RNA含量 T. denrolimi 使用参考试剂盒并按照制造商的说明书进行操作的黄蜂9检测RNA含量的质量；若OD260/OD280值在1.8至2.0之间，则继续实验9.
- 使用 2 µL 5x 缓冲液（1 U/50 µL）、1 µL DNA酶（1 U/50 µL）、6.5 µL RNA（约 100 ng/µL）和 0.5 µL H₂O 纯化 RNA 样品2在 42 °C 下孵育 2 分钟。
- 使用 10 µL 纯化的 RNA（~100 ng/µL）、4 µL 5x 缓冲液（1 U/50 µL）、1 µL 酶混合液 I（1 U/50 µL）和 4 µL H₂O 进行逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR），以生成 cDNA 模板。2O. 使用以下条件进行逆转录PCR：37 °C 反应15分钟，85 °C 反应5秒。将cDNA产物储存于-4 °C，待用。
- 按照参考的预混液配方，进行聚合酶链式反应（PCR）以扩增双链RNA序列（10 µL Taq II [1 U/50 µL]，0.8 µL 正向引物 [0.4 µM]，0.8 µL 反向引物 [0.4 µM]，0.8 µL DNA模板 [40 ng/µL]，以及7.6 µL H₂O）。2O). 使用以下条件进行PCR扩增：94 °C预变性2 min；35个循环（94 °C变性30 s，60 °C退火30 s，72 °C延伸30 s），最后72 °C延伸2 min。
- 通过2.0%琼脂糖凝胶电泳评估PCR产物的质量5,9 并通过Sanger测序确认目标序列。
- 使用凝胶回收试剂盒，按照制造商说明书纯化PCR产物9,23.
- 利用RNAi系统合成目的基因的dsRNA，反应体系包含10 µL 2x缓冲液（0.02 U/µL）、8 µL DNA模板（75 ng/µL）和2 µL酶混合物（1 U/50 µL），反应条件如下：37 °C孵育30分钟，70 °C孵育10分钟，25 °C孵育20分钟。用30 µL无核酸酶水洗脱合成的dsRNA。
- 通过1.0%琼脂糖凝胶电泳观察dsRNA产物的质量5,9将dsRNA稀释至7,000 ng/µL。检测dsRNA产物的质量；若OD260/OD280比值在1.8至2.0之间，则继续后续操作9将dsRNA产物于-20 °C保存，直至使用。
3. T. denrolimi 蛹的移植
- 在25 ± 1°C条件下，将寄生的寄主卵置于16小时光照/8小时黑暗的光周期及约75%相对湿度环境中培养约8天。寄生后的寄主卵在5天后会变黑。30 (图1-iv,v).
- 将寄主卵卡片转移至解剖显微镜下。使用一对钨针（图1- vi) 仔细去除宿主卵的卵壳（chorion）图1-七）并从内部取出蛹图1-八)5,17,18.
注意：解剖针的尖端直径应小于0.05 mm。 - 准备一个干净的培养皿用于基质。倒入10–15 mL浓度为15 g/L的琼脂溶液，静置自然冷却（图2-i).
注意：将琼脂溶液与0.5 g链霉素混合，以抑制污染物的生长 体外. - 使用已消毒的刻刀刻出若干条深0.2–0.3 mm、宽0.4–0.8 mm的沟槽图2-ii).
- 使用小刷子（图2-iii将寄主体内的蛹从解剖后的卵中取出，移植到琼脂基质的其中一个凹槽中（图2-iv).
- 重复步骤 3.4 和 3.5，将 100–300 个蛹逐个单独移植到凹槽中（图2- v).
4. 将dsRNA显微注射至 T. denrolimi蛹体内
- 使用玻璃针拉制仪拉制玻璃毛细管（图3-i,ii）。将针拉制仪的加热温度设为280，拉伸速度设为170，延迟时间设为250，拉力设为30（图3-iii）。制备多个用于显微注射的玻璃毛细针（图3-iv,v）。
- 使用磨砂板对玻璃针尖进行斜面修整（图3-vi）。
注意：确保注射针尖保持锋利；否则可能导致蛹死亡或阻碍试剂在针内的流动（图3-vii）。 - 使用显微注射泵将约 2 µL 浓度为 7,000 ng/µL 的 dsRNA 注射溶液装入已准备好的注射针中（图3-vii）。
- 将含有数百只蛹的琼脂基质转移至复式显微镜的载物台上（图3-viii）。
- 在镜头下，以约 30° 角度小心地将注射针插入 T. denrolimi 蛹的腹部（图3-ix）。
- 尽可能轻柔地将约 5 nL 的注射溶液（步骤 4.3）缓慢注入 T. denrolimi 蛹体内。
注意：随着 dsRNA 溶液的注入，T. denrolimi 蛹可能会轻微膨胀。向蛹体内注入过多溶液或使用开口过大的针头可能导致蛹提前死亡。在连续注射数只至数十只蛹后，若针头堵塞，应及时更换。 - 重复步骤 4.5 和 4.6，逐一对 600 只蛹进行 dsRNA 注射。
注意：为确保可靠的 RT-qPCR 分析，应从至少 100 只蛹中提取 RNA。在 dsRNA 处理组和 dsGFP 阴性对照组中，每组应至少注射 600 只蛹，以完成三个重复实验9。
5. 孵化 T. denrolimi 蛹
- 将含有已注射蛹的基质转移至温度为 25 ± 1 °C、光周期为 16 小时光照/8 小时黑暗、相对湿度约为 75% 的培养箱中。
- 每种处理条件下分别孵育约 700 只 T. denrolimi 蛹，孵育时间分别为 24 小时或 48 小时。每个重复取 100 只蛹提取 RNA9。
注意：需从样本中剔除萎缩的蛹（死亡蛹），否则可能导致基因表达检测结果出现误差。 - 每种处理条件下孵育约 50 只 T. denrolimi 蛹，直至成蜂羽化（图 3-x）。记录羽化率和畸形率。
6. 目标基因表达的检测
- 使用引物设计工具为RT-qPCR中的目标基因和参考基因设计引物组。
注意：确保RT-qPCR引物的序列不与dsRNA的靶向区域重叠。 - 在RT-qPCR分析中采用forkhead box O（FoxO）基因作为参考基因；FoxO的引物序列此前已有报道9。
- 获取商业合成的引物组。RT-qPCR反应体系包含10 µL Taq II（1 U/50 µL）、0.8 µL 正向引物（0.4 µM）、0.8 µL 反向引物（0.4 µM）、0.8 µL 模板（10 ng/µL）以及7.6 µL H2O。PCR扩增程序如下：95 °C 预变性30 s；进行35个循环：95 °C 变性5 s、57 °C 退火30 s、72 °C 延伸30 s；然后95 °C 10 s；60 °C 5 s；最后95 °C 5 s。
- 采用2-ΔΔCt法计算目标基因的表达量9,25。
- 采用Kruskal-Wallis检验分析不同处理条件（dsFerhch、dsGFP、未注射）下目标基因的表达差异。
注意：由于数据可能存在异方差性和非正态分布，应避免在事后比较中使用参数检验方法（如t检验），以免得出错误结论25。
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结果
T. denrolimi 蛹在注射 dsFerhch 后的羽化率显著低于注射 dsGFP 或未注射个体（表1）。在成功羽化的蜂中，51.85% 接受 dsFerhch 处理的 T. denrolimi 出现翅发育畸形、翅变小的现象。而在注射 dsGFP 或未注射的蜂中未观察到畸形个体（表1）。此外，注射 dsFerhch 的 T. denrolimi 蛹腹部出现黑色素沉积，这是铁代谢异常的表型特征23。而在注射 dsGFP 或未注射的 T. denrolimi 蛹中未观察到黑色素沉积现象（图4）。
RT-qPCR 分析显示，在注射 dsFerhch 24 小时后，T. denrolimi 蛹中 <...
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讨论
Trichogramma 蜂类被公认为有效的生物防治制剂，专门针对农业和林业中多种鳞翅目害虫1。这些微小的蜂类在其寄主卵内完成未成熟阶段的发育，这一特性为开展RNAi实验带来了挑战5,18。本研究提供了在 T. denrolimi 中进行RNAi实验的全面可视化指南。鉴于 Trichogramma 属内各物种具有相似的生物学特性，该方法经适当调整后可轻松适用于其他 Trichogramma 物种以及内寄生性蜂类的RNAi研究或显微注射实验。
该方案引入了多种创新方法，可实现高效的dsRNA显微注射，并简化RT-qPCR流程 T. denrolimi以及优化移植和 体外 孵育 T. denrolimi 蛹。根据本研究，移植蛹的羽化率达到90%，且无需任何注射。当移植蛹接受ds处理时GFP<...
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本研究由国家自然科学基金项目（32172476，32102275）、农业科技创新计划（CAAS-ZDRW202203，CAAS-ZDRW202108）以及中央引导地方科技发展资金（XZ202301YD0042C）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2x ES Taq MasterMix（含染料） | Cowin Biotech, 中国 | CW0690H | 用于扩增dsRNA序列 |
| 20x PBS缓冲液，DEPC处理（pH 7.2–7.6） | Sangon Biotech, 中国 | B540627-0500 | 用于稀释dsRNA |
| 琼脂条 | 石狮环球琼脂工业有限公司，中国 | n/a | 用于制备培养基 |
| 氨苄青霉素钠 | Sangon Biotech, 中国 | A610028 | 用于制备培养基 |
| Bioer恒温金属浴 | BIOER, 中国 | MB-102 | 用于合成dsRNA |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | WPI, 美国 | 1B100-4 | 用于拉制毛细玻璃针 |
| 超净工作台 | Airtech, 中国 | SW-CJ-1FD | 用于提取RNA |
| 双蒸水 | Sangon Biotech, 中国 | A500197-0500 | 用于稀释cDNA |
| 环境测试培养箱 | Panasonic, 日本 | MLR-352H-PC | 用于培养T. denrolimi |
| Eppendorf离心机 | Eppendorf, 德国 | 5418R | 用于储存RNA样品 |
| Eppendorf FemtoJet 4i | Eppendorf, 德国 | FemtoJet 4i | 用于向T. denrolimi注射 |
| Eppendorf制冷离心机 | Eppendorf, 德国 | 5810R | 离心 |
| 乙醇溶液（75%，RNase-free） | Aladdin, 中国 | M052131-500ml | 用于提取RNA |
| 凝胶回收试剂盒 | Omega, 美国 | D25000-02 | 用于提取cDNA |
| 阿拉伯胶 | Solarbio, 中国 | CG5991-500g | 用于制作卵卡 |
| 异丙醇 | Aladdin, 中国 | 80109218 | 用于提取RNA |
| 激光毛细管拉制仪 | SUTTER, 美国 | P-2000 | 用于拉制毛细玻璃针 |
| 微量加样器 | Eppendorf, 德国 | 20 µL | 用于加载dsRNA |
| 多样品组织研磨仪 | LICHEN, 中国 | LC-TG-24 | 用于研磨T. denrolimi |
| 针头研磨仪 | SUTTER, 美国 | BV-10-E | 用于研磨毛细玻璃针 |
| 无核酸酶水 | Sangon Biotech, 中国 | 用于稀释RNA | |
| OLYMPUS显微镜 | OLYMPUS, 日本 | XZX16 | 用于观察T. denrolimi |
| PCR仪 | Bio-rad, 美国 | S-1000 | 用于DNA扩增 |
| PowerPac Basic | Bio-rad, 美国 | PowerPacTM Basic | 用于检测dsRNA质量 |
| dsGFP引物（正向） | [TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA | ||
| dsGFP引物（反向） | [TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG | ||
| FerhchqPCR引物（正向） | TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT | ||
| FerhchqPCR引物（反向） | CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT | ||
| FerhchRNAi引物（反向） | [TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC | ||
| FerhchRNAi引物（正向） | [TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG | ||
| FoxOqPCR引物（正向） | CTACGCCGATCTCATAACGC | ||
| FoxO qPCR引物（反向） | TGCTGTCGCCCTTGTCCT | ||
| 含gDNA Eraser的PrimeScript RT试剂盒（完美实时） | TaKaRa, 日本 | RR047A | |
| 实时定量PCR仪 | Bio-rad, 美国 | CFX 96 Touch | 用于进行逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR） |
| 实时PCR（TaqMan）引物与探针设计工具 | https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/ | ||
| T7 RiBoMAX Express RNAi系统 | Promega, 美国 | P1700 | 用于体外 in vitro 合成dsRNA |
TB Green Premix Ex TaqTM  （含RnaseH Plus） | TaKaRa, 日本 | RR820A | 用于进行RT-qPCR |
| 三氯甲烷 | 科试剂, 中国 | GB/T682-2002 | 用于提取RNA |
| TRIzol试剂 | Ambion, 美国 | 15596018 | 用于从样品中提取总RNA |
| 超低温冰箱 | Thermo, 美国 | Forma 911 |
参考文献
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