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基于高通量图像的表型分析技术用于确定马铃薯对单一及复合胁迫的形态与生理响应

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DOI：

10.3791/66255

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2024年6月7日

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1PSI (Photon Systems Instruments), spol. s r.o. Drasov, 2Plant Stress Resilience, Institute of Environmental Biology, Utrecht University, 3Plant Breeding, Wageningen University and Research, 4Department of Biology, Biochemistry, Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg, 5Department of Biotechnology and Systems Biology, National Institute of Biology, 6Plant Cell Biology, Institute of Cellular and Molecular Botany, University of Bonn, 7Department of Functional & Evolutionary Ecology, University of Vienna

本文内容

摘要

我们设计了一种基于图像的表型分析方案，用于确定植物对单一及复合的高温、干旱和涝渍处理所引发的形态学和生理学响应。该方法能够在全植株水平（尤其是地上部分）识别早期、晚期以及恢复期的响应特征，并凸显了使用多种成像传感器的必要性。

摘要

高通量基于图像的表型分析是一种强大的工具，可无创地随时间评估植物在特定条件下的生长发育和性能表现。通过使用多种成像传感器，可测定多个目标性状，包括植物生物量、光合效率、冠层温度以及叶片反射率指数。在田间条件下，植物经常同时暴露于多种胁迫环境中，严重的热浪、洪涝和干旱事件对作物生产力构成严重威胁。当多种胁迫同时发生时，由于协同或拮抗作用，其对植物的影响可能显著不同。为阐明马铃薯植株对单一及复合胁迫（模拟自然发生胁迫情景）的响应机制，本研究对一种选定的马铃薯品种（Solanum tuberosum L.，品种 Lady Rosetta）在块茎形成初期分别施加对照、干旱、高温、涝渍以及高温、干旱和涝渍复合胁迫。我们的分析表明，涝渍胁迫对植株表现的负面影响最为严重，导致与气孔关闭相关的快速而显著的生理响应，包括光系统II的量子产率和效率降低，冠层温度升高以及水分指数上升。在高温及复合胁迫处理下，植株在胁迫早期阶段的相对生长速率下降。在干旱及复合胁迫条件下，植株体积和光合性能在胁迫后期随温度升高和气孔关闭而下降。在明确环境条件下优化的胁迫处理与选定的表型分析方案相结合，有助于揭示 单种与复合胁迫下形态和生理响应的动态变化。本文为致力于识别植物对多种与气候变化相关胁迫具有抗性特征的科研人员提供了一种实用工具。

引言

气候变化的潜在影响，包括热浪、洪水和干旱事件的强度和频率增加，对作物生长产生了负面影响1。了解气候变化对作物变异性的效应以及由此引起的年度作物产量波动至关重要2。随着人口增长和粮食需求上升，维持作物产量成为一项挑战，因此迫切需要寻找具有气候适应性的作物用于育种3,4。马铃薯（Solanum tuberosum L.）是一种重要的粮食作物，因其高营养价值和较高的水分利用效率，对全球粮食安全具有重要贡献。然而，在不利条件下生长和产量下降是一个主要问题，尤其在敏感品种中更为显著5,6。许多研究强调了探索维持马铃薯作物生产力替代途径的重要性，包括改进农业实践、筛选耐受性基因型以及理解胁迫对发育和产量的影响7,8,9，这也是欧洲马铃薯种植者（或农民）的迫切需求10。

自动化表型分析平台（包括基于图像的表型分析）能够对植物结构和功能进行定量分析，这对于筛选相关目标性状至关重要11,12。高通量表型分析是一种先进的非侵入性技术，可快速、可重复地测定多种关注的形态和生理性状13。尽管表型反映了基因型差异与环境效应的关联，但在受控条件下对植物施加胁迫进行比较，可将 大量表型信息与特定（胁迫）条件相联系14。基于图像的表型分析在描述表型变异方面至关重要，且能够在整个植物发育过程中对一系列性状进行筛选，不受群体规模限制15。例如，利用红-绿-蓝（RGB）成像传感器测量叶片的形状、大小和颜色指数等形态性状，可用于评估植物生长和发育状况。此外，通过叶绿素荧光、热红外（IR）和高光谱成像等多种传感器，可对光合性能、冠层温度和叶片反射率等生理性状进行量化测定16。近期在受控环境中开展的研究表明，基于图像的表型分析在评估植物对非生物胁迫（如马铃薯的高温胁迫17、大麦的干旱胁迫18、水稻的干旱胁迫19以及小麦的干旱与高温复合胁迫20）下的不同机制和生理响应方面具有巨大潜力。尽管研究植物对多重胁迫互作的响应较为复杂，但这些发现为理解植物应对气候变化的机制提供了新的见解21。

植物的生理和形态响应直接受到非生物胁迫条件（高温、水分亏缺和淹水）的影响，导致产量降低22。尽管马铃薯相较于其他作物具有较高的水分利用效率，但由于其根系结构较浅，水分亏缺仍会对其产量和品质产生负面影响5。根据干旱程度的强度和持续时间不同，叶面积指数会下降，在胁迫后期尤为明显地表现为冠层生长迟缓以及新叶形成受抑制，从而导致光合速率降低23。水分阈值至关重要，过多的水分或长期干旱会因氧气限制、根系导水率下降以及气体交换受阻，对植株生长和块茎发育产生不利影响24,25。此外，马铃薯对高温较为敏感，当温度超过最适范围时，会导致块茎起始、生长及同化速率延迟26。当多种胁迫同时出现时，其生化调控和生理响应与单一胁迫下的响应不同，凸显了研究植物对复合胁迫响应的必要性27。复合胁迫可能导致植物生长受到更严重的抑制，并对与繁殖相关的性状产生决定性影响28。复合胁迫的影响取决于各胁迫之间的主导关系，从而引起植物响应的增强或抑制（例如，干旱通常导致气孔关闭，而在热胁迫下气孔开放以促进叶片表面散热）。然而，复合胁迫的研究仍处于发展阶段，尚需进一步研究以更深入理解介导植物在这些条件下响应的复杂调控机制29。因此，本研究旨在提出并推荐一种利用多种成像传感器的表型分析方案，适用于评估马铃薯在单一及复合胁迫处理下的形态-生理响应，并揭示其整体表现背后的机制。如假设所示，结合多种成像传感器被证明是表征植物胁迫响应过程中早期和后期策略的有效工具。优化基于图像的表型分析方案将成为植物研究人员和育种工作者的有力工具，用于发掘与非生物胁迫耐受性相关的感兴趣性状。

方案

1. 植物材料准备与生长条件

  1. 移植 体外 马铃薯（Solanum tuberosum L.，品种 Lady Rosetta）组培苗移栽至 250 mL 花盆中。
  2. 将花盆装满完全饱和的Klasmann基质2，在弱光条件下置于生长室中培养1周。
  3. 调节冠层水平的光照条件以 160 µmol·m-2·s-1 使用光度计，通过25%白光和35%红外光的组合进行测量。
  4. 在培养10天后移植植物 体外 将插条插入土壤，栽入3 L花盆（直径15.5 cm，高20.5 cm）中。
  5. 在3 L的盆中装入1850 g的3:1 Klasmann基质与2:沙的混合物。
  6. 将植物置于光照条件下的生长室中 320 µmol·m-2·s-1 结合55%白光和81%红外光，并设置为长日照条件（16小时光周期）。
  7. 将生长室的温度设置为 22 °C/19 °C 整个实验期间，昼夜循环和相对湿度（RH）均控制在55%。
  8. 将盆栽重量维持在60%土壤相对含水量（SRWC）作为适宜的对照水平，以保证植株生长和产量30,31.
    注意：根据以往试验，将土壤体积含水量维持在60%以上会促进苔藓在土壤表面生长，并增加植物病害发生的风险。此外，苔藓的存在可能在叶绿素荧光成像中产生误导性的阳性信号，且难以滤除。请使用以下公式计算相对土壤含水量（SRWC%）：SRWC% = (FW - DW)/(TW - DW) × 100，其中FW为土壤鲜重，TW为膨压重量，DW为干重。32.
    1. 从三个不同的克拉斯曼基质2混合袋中选取土壤样品（每份100 g）作为重复，称量土壤的鲜重。
    2. 将土壤充分浸水至盆器中的水不再滴落，称量土壤的饱满重量。
    3. 将样品放入烘箱中 80 °C 干燥3天，直至土壤样品完全干燥，称量土壤干重33.
  9. 将蓝色垫子放置在培养皿表面以减少蒸发。
    注意：在图像分割中，蓝色是用于减去土壤背景与植物像素所必需的颜色。
  10. 每种处理选择十个生物学重复。
  11. 在灌溉过程中对花盆进行随机化处理（总共50个花盆）。
  12. 添加蓝色支架以支撑植物，避免将其放入表型分析系统时造成机械损伤。

2. 施加应力

  1. 在块茎形成的早期阶段（移栽后28天） 体外 插条），将植株分为五个处理组，每组处理表型分析十株植物（图1).
  2. 以不造成损害的程度诱导单一和复合胁迫，具体如下：
    1. 在生长室中，将植物分别置于对照、干旱和渍水处理条件下培养 22 °C/19 °C 昼夜（步骤 1.7），采用不同百分比的 SRWC：
      对照组（C）：整个实验期间保持60%田间持水量。
      干旱（D）处理：土壤相对含水量逐渐降至20%，持续7天，随后恢复1天。
      淹水（W）处理，土壤相对含水量达160%持续5天，随后恢复10天。
    2. 为了在淹水处理中维持水位高于土壤表面，将一个塑料袋插入空盆中，然后将装有土壤的主盆放入准备好的第二个盆中。
    3. 将植物置于生长舱中，温度设置为30/28 °C 昼夜和55%相对湿度条件下进行热处理。施加单一和复合热胁迫，具体如下：
      1. 对于热处理（H），保持温度在30-28 °C 用60%的SRWC处理15天。
      2. 对于热胁迫+干旱+涝渍（HDW）三重胁迫，将植物暴露于高温处理条件下 30 °C/28 °C 前7天的昼夜温度（保持60%土壤相对含水量），随后进行为期7天的干旱与高温复合处理（20%土壤相对含水量和 30 °C/28 °C最后使植物经历1天的淹水胁迫。具体操作为：将植物放回生长室（生长条件见步骤1.7），并诱导土壤相对含水量达到160% SRWC，持续1天。
        注意：所选的诱导胁迫持续时间基于预实验结果，预实验表明在处理植物存活率达到100%的情况下，胁迫已产生显著效应且无不利影响。在人工气候室环境中，环境条件的波动范围为± 0.2 °C 温度±3% 湿度。

3. 表型分析的植物准备

  1. 在生长室于早上6:00开灯后，让植物在恒定的生长光照条件（320 µmol·m-2·s-1）下适应至少2–3小时，再开始表型分析实验流程。这可确保光合作用和气孔调节处于稳态34。
  2. 在测量前，将植物从培养位置转移至表型分析系统内的生长缓冲区，以便手动将植株装入系统，此时自动化评分系统处于待机状态，并位于温室内部（补充图1、补充图2 和 补充图3）。
    注意：在持续约3.5小时的表型分析期间，植物均保留在生长缓冲区。在温室中，环境条件的变化范围为温度±2°C、湿度±5%，光照强度波动约20%。因此，应尽快开始测量并尽量缩短测量时间，以避免温室环境条件对植物造成影响。
  3. 在表型分析平台上，根据第4节中规定的测量方案，将花盆放置在圆盘中，圆盘会按照设定的时间间隔通过传送带自动移动至成像传感器位置。
  4. 为每株植物/托盘标记唯一的编号，以确保在整个实验过程中所测得的数据能准确对应到相应的植株。

4. 表型分析实验方案

  1. 利用多种成像传感器（叶绿素荧光、热红外、RGB 和高光谱成像）优化表型分析方案，从而实现对植物生理和形态参数的同步测量图2).
    注意：由于植物的响应反映了环境条件和昼夜节律的影响，因此需要对花盆进行随机化处理，并在每天的同一时间段内完成表型分析。
  2. 在表型分析平台中，确保植物通过适应隧道进入系统（图2A植物高度首先被采集，然后根据固定的焦距距离调整每个传感器的高度。
  3. 根据测量方案，使用软件分两轮进行测量。
    1. 第一轮包括利用叶绿素荧光和热成像技术量化为“快速反应”的生理响应的测量。
    2. 首先测量热胁迫处理下的生理参数，然后测量其余处理的生理参数。
    3. 在第二轮中，继续进行其他用于评估较慢响应的测量，包括结构RGB成像和高光谱成像，随后进行重量测定和浇水处理。
  4. 在称重和浇水步骤中，为每株植物设定参考重量，以实现按指定处理条件进行自动浇水和称重。
    1. 确保总参考重量包含规程中定义的圆盘、传送带上放置的插入物、支撑用蓝色支架、蓝色垫片、盆、土壤及植物生物量的重量。
    2. 为在称重和浇水步骤中准确测量蒸散量，需准备空盆作为对照。此外，还需准备额外的盆栽以校正植物生物量重量。
  5. 测量50株植物时，整个表型分析流程耗时215分钟（其中85分钟在1st 圆形，130 分钟，在 2nd 圆的
  6. 在处理前1天于对照条件下对所有植株进行表型观察，随后施加胁迫处理，以监测其动态响应，并评估胁迫诱导的早期和晚期阶段。

5. 调整每个成像传感器的设置

  1. 动力学叶绿素荧光成像
    注意：动力学叶绿素荧光用于研究植物在不同环境条件（包括非生物胁迫）下的光合能力，并提供有关光化学量子效率和热耗散（非光化学过程）的有价值信息。
    1. 对光适应植物采用短光程序进行叶绿素荧光测定，以区分不同处理下植物的响应。
    2. 适应35 在配备冷白光LED（6500 K）的适应通道中，将植物置于光照下适应5分钟 500 µmol·m-2·s-1.
      注意：叶绿素荧光成像是在光照适应后用于监测植物光合能力变化的首次测量。
    3. 根据植物大小和所需光照强度选择并优化预设程序。
    4. 优化测量设置，包括相机和光照强度设置，以确保获得具有最佳信噪比的强信号。
      1. 调整相机设置，例如快门（曝光时间、测量闪光持续时间）和灵敏度（相机的电子增益）。将快门设置为 2 ms，灵敏度设置为 12%。
        注意：这些数值需根据叶片大小和形状以及冠层顶部与成像传感器之间的设定距离进行调整。
      2. 调节作用光强度 500 µmol·m-2·s-1 并设置饱和脉冲于 3200 µmol·m-2·s-1，该值至少比作用光高6-7倍。
    5. 在光适应隧道中进行光照稳态（Lss）参数测量前，先将植物光照适应5分钟。
    6. 为了估算光适应植物的光系统II（PSII）稳态量子产量，选择短光程序（图3）并按如下设置程序。
      注意：每株植物的处理时间为10 s。
      1. 通过开启冷白光活化光源开始测量 500 µmol·m-2·s-1 持续3秒以测量光照下的稳态荧光（FtLss 又称 Ft')
      2. 施加饱和脉冲于 3200 µmol·m-2·s-1 持续800毫秒以测量光照下的稳态最大荧光（FmLss 又称 Fm')
      3. 关闭测量光，然后打开远红光（735 nm），使PSII在暗处弛豫800 ms，测定光照下稳态最小荧光（FoLss 又称 Fo').
    7. 为计算相对参数，使用数据处理软件减去背景并提取相关参数。
      注意：从所用方案中提取的参数为：光适应样品在光稳态下的PSII光化学最大效率，测定为Fv/mLss 又称 Fv/Fm光系统II的量子产量或光稳态下光系统II的运行效率，定义为QY_Lss，又称φPSII = Fq/Fm，PSII中开放反应中心的比例（氧化态QA）确定为qL_Lss = (Fq/Fv') × (F0/Ft').
  2. 热红外（IR）成像
    注意：热红外成像用于无创测量冠层实际温度，从而确定不同的气孔调节状态。在热红外成像单元中，热成像相机安装在机械臂的侧面，以从侧视角度测量冠层温度。
    1. 为在图像处理过程中增强背景温度与被成像物体温度之间的对比度，可在热像仪相对侧使用自动控温的加热壁以提高对比度。将加热壁的温度调节至 8 °C 高于成像单元内的空气温度。
      注意：热成像在黑暗环境中使用线扫描模式获取35.
    2. 图像采集后，基于RGB侧视数据生成植物掩膜，并利用该掩膜与热成像数据进行图像分析中的共配准。这可确保精确识别扫描对象，同时消除植物支架等背景干扰。
    3. 为避免整个实验过程中环境条件波动的影响，需计算参数温度差（delta T 或 ΔT）。
      注意：ΔT 定义为叶片表面温度（植物整个被检测表面所有像素的平均值）与成像箱内环境空气温度之间的差值。
  3. RGB成像
    注意：RGB成像基于视觉惯性系统（VIS）相机，可检测400–700 nm可见光范围内的光，用于植物形态、结构的深入分析以及颜色指数特征的提取。
    1. 成像单元包含一个旋转台，可精确调整托盘位置，同时支持多角度成像以获取侧面视图。
    2. 根据侧视成像设置RGB成像，从三个角度捕获植株图像（0°, 120°，以及 240°），以线扫描模式（RGB1）采集，并以快照模式进行顶视成像（RGB2）。
    3. 两台相机均配备基于LED的光源，可确保被成像植物受光均匀，从而准确测定其形态和颜色特征。
    4. 使用数据分析软件提取计算得到的参数。
    5. 根据侧面和顶部视图的额外参数，计算植物体积（数字生物量）36:
      体积计算公式，方程：Volume_plant = sqrt(Area_side view^2 × Area_top view)，方法。
    6. 计算相对生长速率（RGR）37:
      相对生长速率方程示意图；利用体积对数差计算相对生长速率
      其中 Tn 和 Tn+1 表示时间间隔（天）。
  4. 高光谱成像
    注意：高光谱成像用于植物光谱反射率的可视化。叶片反射率的变化是反映植物不同生理状态的指标。
    1. 使用高光谱成像传感器量化冠层在可见光波段的反射率，采用可见光-近红外（VNIR）高光谱相机（380–900 nm）和短波红外相机（SWIR，900–1700 nm）。
    2. 摄像机安装在机械臂上，机械臂配备有600 W卤素管光源，可在图像采集过程中沿XZ区域移动，为样品提供均匀且光谱适宜的照明。
    3. 两台相机均以线扫描模式运行，并置于避光的成像箱中。
    4. 每次测量前，自动执行两次校准测量：暗电流校准和使用光谱反射聚四氟乙烯标准板进行的辐射度学校准。
    5. 从原始图像和白板校准图像中减去暗场校准图像，以消除暗电流噪声。然后，将减去暗场校准后的原始图像除以白板校准图像，生成最终的高光谱图像。

6. 数据导出与图像分析

  1. 使用数据分析软件进行自动提取、背景扣除和 植物掩膜 图像处理流程的分割（图2B).
  2. 该软件执行全自动分析，其中掩膜应用、背景减除（将植株与其背景分离）以及参数计算等步骤均按RGB成像所述方式进行处理38 和热成像20.
  3. 从由RGB图像生成的植物特异性像素中提取测量和计算参数 植物掩膜 和 托盘式口罩.
  4. 如果图像未被完全选中，这可能由于后期发育阶段植被绿色度的变化或胁迫处理的影响所致，此时应打开软件中的本地数据分析部分并重新调整 植物掩膜 数据分析师软件中每个传感器的设置。
  5. 在叶绿素荧光图像处理中，调整叶绿素荧光 植物掩膜 设置分析参数补充图4).
    1. 将阈值设置为 是，意味着植物分割是自动完成的。
    2. 设置 口罩框架索引 作为 错误，意味着对于 植物掩膜 检测时，使用叶绿素荧光实验方案中定义的时间-视觉帧。
  6. 在热成像处理中，设置参数以 植物掩膜 分析补充图5).
    1. 为自动阈值设定 物体掩膜生成 作为 错误.
    2. 设置来自的掩膜 RGB 侧面图像 作为 是 用于分析。
  7. 在RGB图像处理中，调整 植物掩膜 设置分析参数（补充图6 和 补充图7）取决于物种和发育阶段。
    1. 选择公式 4*G-3*B-R，这是对象掩膜生成的定义，并定义了所使用的颜色分量（红色、绿色、蓝色分量）。
      注意：该标准公式及其他设置可能因所用相机类型（顶部或尺寸视图）、处理方式及不同品种而有所变化。
    2. 调整 阈值 用于将绿色通道增强的灰度图像转换为二值图像，以确定植物覆盖的表面面积。
    3. 调整 中值滤波器尺寸 用于减少噪声和无效像素，并填补缺失的像素。
    4. 调整 物体的最小尺寸 以像素为单位，纳入分析。
    5. 调整 孔的最小尺寸 以像素为单位的掩膜对象内部的小孔，通常为几十个像素。小于该值的孔将被闭合，并计入对象像素中。
    6. 设定 使用反射减少 作为 是 用于对每个像素的RGB值进行归一化。
    7. 设置 跳过不良暴露点 作为 是 用于从植物掩膜中裁剪过曝或欠曝的像素（例如，去除表面反射或信号低于噪声的暗像素）。
  8. 使用数据分析软件对从RGB分析得到的分割设置进行着色，以提供与胁迫响应和植物衰老相关的颜色变化信息。
    注意：植物绿色程度的估算基于代表植物发育各个阶段的预定义颜色范围。将对应于植物表面所有像素的颜色通道强度进行分组和聚类，用作颜色分割的源色图。
    1. 提供经过处理的RGB图像（已去除背景）和用于特定分析的色调列表（颜色映射表）作为软件输入。
    2. 为获得无偏结果，应使用“训练”数据集进行色调选择，并选取不同的发育阶段和处理条件。
      注意：分析会保存该训练数据集中每张图像每个像素的 R、G 和 B 值。
    3. 使用软件定义色相数量（选择6种色相），每通道的色值范围为0-255。
    4. 提供数据分析师软件中生成的色相列表（颜色).
  9. 在高光谱图像处理中，使用高光谱分析软件中实现的逐像素分析方法处理所获取的高光谱数据，包括辐射度和暗噪声校准、背景扣除以及植物掩膜分割。采用平均光谱和植被指数进行后续分析。
  10. 使用VNIR高光谱相机拍摄的VNIR图像创建掩膜，以从高光谱图像中提取数据。对于SWIR高光谱扫描，基于SWIR分析生成植物掩膜。
    1. 在 VNIR植物掩膜，使用公式 1.2*(2.5*(R740-R672)-1.3*(R740-R556)) 用于可视化图像，其中 R 代表特定波长下的反射率值（补充图8).
    2. 在 SWIR 植物掩膜，使用公式 (R960-R1450)-(R960-R1200) 在图像处理中用于可视化图像（补充图9).

7. 称重与浇水

  1. 在称重和浇水过程中，记录浇水前的重量。然后进行浇水，并记录浇水后的重量。
  2. 以参考模式对托盘进行浇水——每个托盘在数据库中均有存储的参考值，始终将其浇灌至该参考值。根据处理条件确定参考值。

8. 数据分析

  1. 使用 ANOVA 和 Shapiro 检验分析数据。
  2. 在 R Studio（版本 4.2.3）中使用 (dplyr)、(tidyverse)、(rstatix) 和 (ggpubr) 软件包，通过 Pairwise Wilcox 检验进行不同处理之间的两两比较。
    注意：图像分析已通过数据分析师软件自动完成。如需对图像采集进行进一步分析，请使用传感器特异性数据分析师软件。

结果

本研究采用基于图像的自动化表型分析方法，研究了马铃薯（品种 Lady Rosetta）在单一胁迫及复合胁迫下的形态和生理响应。该方法在块茎起始阶段施加胁迫后，以高时空分辨率揭示了植物的动态响应过程。为评估胁迫的早期和晚期阶段，结果分为三个时间段呈现：[0–5 天表型分析期（DOP）]、[6–10 DOP] 和 [11–15 DOP]（图1）。在0 DOP之前，所有植株均在对照条件（C）下生长；从1–5 DOP开始施加渍水胁迫（W）和热胁迫（H）。因此，各阶段的响应如下：（i）0–5 DOP阶段反映初始的热胁迫和渍水胁迫；（ii）6–10 DOP阶段出现早期干旱胁迫（D），并观察到热与干旱复合胁迫（HD）；（iii）11–15 DOP阶段表现为晚期热胁迫、干旱胁迫以及热+干旱+渍水三重复合胁迫（HDW）。渍水胁迫后的恢复过程在6–10 DOP和11–15 DOP阶段中被观察到。

形态学性状
采用RGB成像技术评估不同胁迫及其组合对地上部植物生长的影响。图4结果显示，与对照相比，热胁迫和涝渍胁迫（0–5 DOP）已导致植物体积和相对生长速率（RGR）下降。在6–10 DOP期间，对照组植物的体积和RGR持续增加，而在热胁迫、以及热胁迫与干旱和涝渍复合胁迫条件下，植物体积的增加明显受到抑制（图4A）。由于植物对涝渍胁迫极为敏感，其RGR下降尤为显著（图4B）。在后期干旱胁迫阶段（11–15 DOP），当土壤相对含水量（SRWC）维持在20%时，RGR较对照组显著降低。然而，在复合HDW胁迫的后期，施加涝渍处理在胁迫最后一天反而导致RGR上升。

生理性状
结合结构和生理表型分析方法，以揭示植物对胁迫的进一步响应。利用多种成像传感器，可检测胁迫早期阶段的生理响应。对叶绿素荧光数据的进一步分析表明，涝渍显著降低了光合效率，其中Fv'/Fm'（Fv/Fm_Lss）在0-5 DOP和6-10 DOP期间急剧下降，但在11-15 DOP期间出现恢复趋势，Fv'/Fm'略有上升（图5A）。在胁迫后期（11-15 DOP），干旱以及高温与干旱复合胁迫下均观察到Fv'/Fm'的降低。在涝渍处理的植株中，其光系统II的实际光化学量子产量（QY_Lss，即φPSII）在0-5 DOP和6-10 DOP期间显著低于其他处理组，但在11-15 DOP期间略有升高，表明植株开始恢复（图5B）。此外，通过计算光稳态下光系统II中开放反应中心所占比例（qL_Lss），可进一步区分调控光系统II效率以实现保护作用的不同机制（图5C）。仅在干旱条件下观察到qL的升高，这可能是由于光抑制所致。

这些发现与红外数据一致，反映了不同胁迫条件下存在的不同潜在机制（图6）。在淹水条件下观察到ΔT（温差）升高，导致气体交换速率降低。在晚期干旱以及高温与干旱复合胁迫下，ΔT的升高是由于气孔关闭，这被认为是避免过度失水的主要响应机制之一。另一方面，在高温处理下观察到ΔT降低，这是由于气孔开放以增强蒸腾效率并冷却叶片表面。

通过分析高光谱数据，从高光谱可见光-近红外（VNIR）数据中选取了两个参数用于评估叶片反射率指数，包括作为叶绿素含量指标的归一化植被指数（NDVI）和作为光合作用效率指标的光化学反射率指数（PRI）。结果显示，仅在涝渍胁迫下，NDVI和PRI出现下降，这与形态性状中观察到的减少趋势一致（图7A，B）。此外，利用短波红外（SWIR）高光谱数据评估植物含水量时发现，在涝渍处理下，0–5天处理后（DOP）水指数有所升高（图7C）。然而，在高温处理下则观察到相反的响应，即水指数低于对照组。这些结果与基于RGB顶视图颜色分割对植被进行的观察一致。色调比例的变化反映了随时间推移的胁迫响应（图8）。色素指数显示，在干旱及后期复合高温-干旱-涝渍（HDW）胁迫下，色素含量减少，而在涝渍处理后则呈现逐渐恢复的趋势。因此，利用多种成像传感器能够反映形态-生理性状之间的相关性，并实现对非生物胁迫下植物整体表现的评估。

植物胁迫处理时间线示意图；对照、热胁迫、干旱、涝渍；表型观测时间点
图1：不同处理措施施用的时间线，包括移栽后植物的天龄 体外 插条 表型分析第0天（DOP）在对照（C）条件下进行测定，随后施加不同持续时间的各类胁迫。在DOP 1-5天期间施加涝渍（W）胁迫，并开始施加高温处理（H）以观察初期响应。在DOP 6-10天期间，施加干旱胁迫（D）的初期阶段以及高温与干旱复合胁迫（HD）。在DOP 11-15天期间，反映植物对干旱和高温处理后期阶段的响应，并对HD处理组施加1天的涝渍胁迫（HDW）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

植物表型分析过程、叶绿素荧光、热红外、RGB、高光谱成像示意图。
图 2：表型分析流程及数据分析的示意图。（A）表型分析流程概述。植物从PSI的FS-WI生长室（受控环境）被运送至表型分析系统。在测量前，植物在光照适应室中以500 µmol.m-2.s-1的光强进行5分钟的光适应。随后利用多种成像传感器获取形态学和生理学性状数据，接着进入称重与浇水工作站。根据处理条件的不同，植物被放回22 °C/19 °C或30 °C/28 °C的受控环境中继续培养。（B）来自各成像传感器的图像处理流程的自动提取与分割。 请点击此处查看该图的放大版本。

叶绿素荧光实验方案示意图；显示了作用光和远红光对 Ft_Lss 和 Fm_Lss 的影响。
图 3：叶绿素荧光成像的短光实验方案概览。 测量程序首先开启冷白作用光，以测定光照条件下的稳态荧光（Ft_Lss），随后施加饱和脉冲，测定光照条件下的最大稳态荧光（Fm_Lss）。接着关闭作用光，开启远红光，以测定光照条件下的最小稳态荧光（Fo_Lss）。该程序每株植物持续 10 秒。 请点击此处查看此图的放大版本。

不同处理下RGB体积和相对生长率的箱线图分析；实验，ANOVA结果。
图4：利用RGB成像进行形态学评估。（A）根据RGB顶部和侧面视图面积计算的植株体积。（B）块茎起始阶段的相对生长率（RGR）。数据表示为平均值±标准差（n = 10）。请点击此处查看该图的放大版本。

植物胁迫响应；方差分析箱线图；对照组与高温、干旱、涝渍处理组。
图5：光照适应植物的叶绿素荧光成像。（A）光照稳态下光照适应样品的PSII光化学最大效率（Fv/Fm_Lss）。（B）光照稳态下光系统II的量子产率或光系统II的工作效率（QY_Lss）。（C）光照稳态下PSII中开放反应中心的比例（氧化态QA）（qL_Lss）。数据表示为平均值±标准差（n = 10）。请点击此处查看该图的放大版本。

不同处理下IrPlant_Avg_deltaT的箱线图，显示ANOVA分析结果。
图6：利用热红外成像技术计算冠层平均温度（从热红外图像中提取）与空气温度之间的差值（ΔT）。数据表示均值 ± 标准差（n = 10）。请点击此处查看该图的放大版本。

可见近红外和短波红外数据的箱线图分析；干旱与高温处理对植物影响的方差分析结果。
图7：高光谱成像用于测定植被指数和水分含量。（A）归一化差异植被指数（NDVI）。（B）基于可见近红外（VNIR）成像计算的光化学反射率指数（PRI）。（C）基于短波红外（SWIR）成像计算的水分指数。数据表示为平均值 ± 标准差（n = 10）。请点击此处查看该图的放大版本。

LadyRosetta 基因型在胁迫条件下的比较；图表显示对照与胁迫条件下百分比变化。
图8：不同处理条件下植物的绿化指数。图像处理基于将原始RGB图像转换为由6种定义色调组成的色谱图。数据表示均值 ± 标准差（n = 10）。请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：表型分析日（DOP）期间测量的光照强度。 测量时间为上午9:00至中午12:35。LI_Buff表示分布在温室内的5个光传感器所采集数据的中位数。请点击此处下载该文件。

补充图2：表型分析日（DOP）期间测得的相对湿度（RH）。 测量时间为上午9:00至中午12:35。RH_Buff表示分布在温室内的5个湿度传感器所测数据的中位数。RH2表示适应室内的相对湿度。请点击此处下载该文件。

补充图3：表型分析日（DOP）期间测得的温度。 测量时间为上午9:00至中午12:35。T_Buff表示分布在温室内的5个温度传感器所测数据的中位值。T2表示适应室内的温度。T3表示加热墙的温度。T4表示热红外成像单元内的温度。请点击此处下载该文件。

补充图4：数据分析软件的截图，显示了叶绿素荧光成像传感器中用于植物掩膜分析的参数设置。请点击此处下载该文件。

补充图5： 数据分析软件的截图，显示了热红外成像传感器中用于植物掩膜分析的参数设置。请点击此处下载该文件。

补充图6： 数据分析软件的截图，显示了RGB单侧成像传感器中用于植物掩膜分析的参数设置。请点击此处下载该文件。

补充图7： 数据分析软件的截图，显示了RGB2顶视成像传感器中用于植物掩膜分析的参数设置。请点击此处下载该文件。

补充图8： 数据分析软件的截图，显示了在VNIR成像传感器中进行植物掩膜分析时调整的参数。 请点击此处下载该文件。

补充图9： 数据分析软件的截图，显示了短波红外成像传感器中用于植物掩膜分析的参数设置。请点击此处下载该文件。

讨论

改进的高分辨率成像工具和计算机视觉技术推动了植物表型分析的快速发展，使得能够以可重复的方式从大量植物图像中获取定量数据39。本研究旨在利用当前可用的一系列成像传感器，调整并优化基于图像的高通量方法，以监测植物在单一及复合非生物胁迫下的动态响应。该方法中若干关键步骤需要进行调整，包括施加胁迫以及选择适合测量的成像方案。使用多种传感器进行图像采集，可实现对关键表型性状（如植株生长、光合效率、气孔调节、叶片反射率等）的量化分析。此外，有助于加深对马铃薯植株如何响应不同非生物胁迫的理解。这是加速植物育种项目、培育耐气候胁迫基因型的关键前提40。植物对诱导胁迫的形态学响应取决于其发育阶段。例如，在匍匐茎或块茎起始阶段施加胁迫会抑制叶片和植株的发育，并减少匍匐茎数量，从而降低最终产量41。然而，在不利条件下，植物会启动胁迫响应机制，作为一种适应性反应，以防止和修复胁迫引起的细胞损伤42。植物具有根据胁迫严重程度不同而避免或耐受胁迫环境的适应机制43。

为了理解植物的响应机制，利用成像传感器诱导适当持续时间和强度的胁迫，并测定植物对胁迫的响应，被认为是关键步骤之一。当多种胁迫同时发生时，某种胁迫的强度可能根据胁迫的组合方式、强度和持续时间而压倒其他胁迫的影响。因此，胁迫效应可能叠加，或相互拮抗的响应可能（部分）相互抵消，最终对植物产生正向或负向的影响。本研究选用的实验方案基于先前经验，以确保施加了足够的胁迫水平。例如，干旱胁迫的施加被调整至中等强度，因为在先前实验中，基于叶绿素荧光成像的检测显示，在胁迫早期阶段，其响应与对照处理无显著差异。这主要是由于光呼吸的发生，其作为类囊体膜中电子传递的替代性电子受体，并起到保护光系统II的作用。 关键词：植物胁迫机制，成像传感器，多胁迫交互作用，光呼吸，叶绿素荧光成像，光系统II，干旱胁迫44,45在复合胁迫响应下，植物暴露于一种较弱的初始胁迫因子可能增强其对后续胁迫因子的耐受性，这种效应可能产生有益或有害的影响46在本研究中，与单独的干旱胁迫相比，复合胁迫下观察到更强的响应。通过检测其他生理反应，结果显示在干旱条件下ΔT（deltaT）升高，这是因为气孔关闭以减少水分过度流失。相反，在热胁迫下则观察到相反的反应，ΔT低于对照组，表明气孔开放以增强叶片冷却，该结果与小麦在热与干旱复合胁迫下的研究发现一致。20在淹水期间，由于土壤缺氧以及根系水分稳态受到破坏，导致气孔关闭，从而引起ΔT升高，同时脱落酸（ABA）增加，ABA是响应水分胁迫的关键激素，其积累进一步降低了蒸腾流。47.

在植物胁迫研究中，胁迫处理及其后续恢复处理的持续时间与胁迫强度呈正相关。例如，中度干旱胁迫（如将土壤含水量维持在田间持水量的20%）会引发可逆的表型变化，通常在重新灌溉一天后即可恢复。相比之下，严重胁迫条件（如淹水）会导致广泛的表型损伤，需要更长的恢复期。尽管标准化处理时间是最理想的做法，但在实验设计中必须考虑胁迫强度本身存在的变异性。

第二个关键步骤是选择合适的实验方案，并针对每个传感器优化设置参数。叶绿素荧光是评估光合作用系统在胁迫条件下性能的有力工具48。可根据研究问题和实验设计，选择适用于光照适应或黑暗适应植物的不同叶绿素荧光测量方案49。本研究中选用的方案（短时光照响应）可用于测定多种性状，包括Fv'/Fm'、φPSII和qL，这些参数可反映植物在不同条件下的光合作用性能50。先前研究表明，在高通量表型分析中所采用的该方案，能够有效评估植物在不同胁迫处理下的光合效率，并区分健康植株与受胁迫植株14,20。根据实验设计，在高通量系统中对大量植株进行测量时，必须充分考虑所选方案的测量时长。因此，本研究选择采用短时测量方案对光照适应的植物进行叶绿素荧光测定，以区分不同处理下的响应差异。基因型与环境互作会影响多种表型性状，这在测量过程中至关重要12。必须注意的是，测量过程应尽可能在短时间内完成，以最大限度减少昼夜节律对光合作用限制的影响51。

热红外成像技术被用于测定冠层温度，并理解不同处理下的气孔调节机制52。需要指出的是，该技术经过优化，加热壁位于相机的对侧，且其温度可动态控制并可编程调节。因此，通过集成环境传感器调节背景加热壁，以提高背景温度与成像物体温度之间的对比度，从而更准确地将植物从背景中识别分离出来，是十分必要的。

尽管图像分析已实现自动化，但仍需调整RGB阈值指数，以在RGB成像中获得合适的二值化掩膜，从而精确选择植物53。此外，选择多个角度对于准确估算数字生物量和生长速率等定量参数至关重要。在本研究中，选取了RGB侧视图上的三个角度（0°、120°和240°），并对其取平均值，以准确计算植物体积和相对生长速率。

根据光谱范围的不同，可以利用高光谱成像技术研究多种生理特征54。有必要确定哪些反射指数能够提供所需信息，并显示植物在不同条件下的响应情况14。在筛选耐受性品种和植物表型分析中，迫切需要明确高光谱指数与其他生理特征之间的相关性55。本研究中，经涝渍处理的植物在VNIR成像中表现出叶绿素含量和光合效率的显著变化。此外，由于气孔调节和叶片含水量的不同，在热处理和涝渍条件下，基于SWIR成像计算的水分指数也表现出不同的响应。

因此，这些研究结果强调了在优化设置后采用该方法的实用性，以及利用多个传感器识别与气候耐受性相关胁迫性状的潜力。通过使用多种成像传感器评估响应动态，可作为改进育种项目的重要工具之一。

披露

作者声明，他们不存在任何已知的相互竞争的经济利益或可能被认为影响本文所报告工作的个人关系。

致谢

本ADAPT项目（多重胁迫耐受马铃薯的加速培育）获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划的资助，资助协议编号为GA 2020 862-858。本研究部分得到了捷克共和国教育、青年与体育部以及欧洲区域发展基金项目"SINGING PLANT"（编号：CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446）的支持。特此感谢CEITEC MU植物科学核心设施为其提供的栽培技术支持。感谢Meijer BV公司为本研究提供了体外扦插材料。感谢Lenka Sochurkova协助完成图2的图形设计，以及Pavla Homolová在捷克共和国Drásov的光子系统仪器（PSI）研究中心开展实验期间对植物材料准备工作的帮助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.1” CMOS 传感器，带 RGB 相机PSI, Drásov, 捷克共和国https://psi.cz/该传感器侧面视角分辨率为 4112 × 4168 像素，顶部视角分辨率为 2560 × 1920 像素。该传感器灵敏度极高，是真正的百万像素 CCD 替代品，可生成清晰、低噪声的图像
FluorCam PSI, Drásov, 捷克共和国FC1300/8080-15 脉冲振幅调制（PAM）叶绿素荧光仪 
Fluorcam 10 软件 PSI, Drásov, 捷克共和国版本 1.0.0.18106用于叶绿素荧光图像的可视化与分析
GigE PSI RGB – 12.36 百万像素相机PSI, Drásov, 捷克共和国https://psi.cz/对于侧面投影，采用线扫描模式，分辨率为每行 4112 像素，每秒 200 行。侧面成像区域为 1205 × 1005 mm（高度 × 宽度），顶部视角成像区域为 800 × 800 mm
高光谱分析软件 PSI, Drásov, 捷克共和国版本 1.0.0.14用于高光谱图像的可视化与分析
高光谱相机 HC-900 系列PSI, Drásov, 捷克共和国https://hyperspec.org/products/可见光-近红外（VNIR）相机，波长范围 380–900 nm，光谱分辨率为 0.8 nm FWHM
高光谱相机 SWIR1700PSI, Drásov, 捷克共和国https://hyperspec.org/products/短波红外（SWIR）相机，波长范围 900–1700 nm，光谱分辨率为 2 nm FWHM
InfraTec 热成像相机（VarioCam HEAD 820(800)) Flir,  美国https://www.infratec.eu/thermography/infrared-camera/variocam-hd-head-800/分辨率为 1024 × 768 像素，热灵敏度 < 20 mK，热发射率默认值设为 0.95 ，扫描速度为 30 Hz，每行包含 768 像素。成像区域为 1205 × 1005 mm（高度 × 宽度）
LED 面板 PSI, Drásov, 捷克共和国https://led-growing-lights.com/products/配备 4 × 240 个红橙色（618 nm）LED、120 个冷白色 LED（6500 K）和 240 个远红光 LED（735 nm），均匀分布于 80 × 80 cm 的成像区域
光照、温度和相对湿度传感器PSI, Drásov, 捷克共和国https://psi.cz/用于监测温室内的受控环境条件
MEGASTOP Blue 地垫 Friedola 75831用于覆盖土壤表面
Morphoanalyzer 软件 PSI, Drásov, 捷克共和国版本 1.0.9.8用于 RGB 图像的可视化与分析，以及颜色分割分析
PlantScreen 数据分析软件（版本 3.3.17.0）PSI, Drásov, 捷克共和国https://plantphenotyping.com/products/plantscreen-modular-system/用于可视化和分析来自所有成像传感器、浇水-称重单元以及温室环境条件的数据 
PlantScreen 模块化系统 PSI, Drásov, 捷克共和国https://plantphenotyping.com/products/plantscreen-modular-system/一种表型分析平台类型
PlantScreen 调度软件 PSI, Drásov, 捷克共和国版本 2.6.8368.25987用于实验规划和测量协议设置
SpectraPen MINIPSI, Drásov, 捷克共和国https://handheld.psi.cz/products/spectrapen-mini/#details用于调节冠层水平的光照强度的光度计
TOMI-2 高分辨率相机 PSI, Drásov, 捷克共和国https://fluorcams.psi.cz/products/handy-fluorcam/分辨率为 1360 × 1024 像素，帧率 20 fps，16 位深度，配备 7 位滤光轮，安装在机械臂上，位于尺寸为 1326 × 1586 mm 的多色 LED 光源面板中央 
步入式 FytoScope 生长室 PSI, Drásov, 捷克共和国https://growth-chambers.com/products/walk-in-fytoscope-fs-wi/用于植物培养的生长室类型

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基于高通量图像的表型分析技术用于确定马铃薯对单一及复合胁迫的形态与生理响应
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