内在无序区域（IDRs）是一类能够响应环境变化而改变其构象的柔性蛋白质结构域。集合荧光共振能量转移（FRET）可用于在不同条件下估算蛋白质的尺寸。本文介绍了一种FRET方法，用于评估在高渗胁迫下活体酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞中IDR的结构敏感性。
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方法文章
利用FRET技术评估活细胞中内在无序区域对高渗应激的结构敏感性
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
内在无序区域（IDRs）是参与多种关键细胞过程的蛋白质结构域。在应激条件下，细胞环境的理化性质发生变化，直接影响IDRs的构象集合。IDRs本身对环境扰动具有高度敏感性。研究细胞的理化性质如何调控IDRs的构象集合，对于理解其功能的环境调控机制至关重要。本文介绍了一种在活体酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞中，逐步测量IDRs在高渗应激条件下结构敏感性的实验方法。我们展示了如何利用群体荧光共振能量转移（FRET）技术，评估在任意渗透剂诱导的渐进性高渗应激过程中，IDRs整体尺寸的变化情况。此外，我们还提供了一个用于处理荧光测量数据并比较不同IDRs结构敏感性的分析脚本。通过采用该方法，研究人员可以获得关于IDRs在复杂胞内环境中随外界条件变化所发生构象改变的重要信息。
引言
内在无序区域（IDRs）是细胞过程中的关键组分1。与具有固定结构的结构域协同作用，IDRs 对蛋白质功能至关重要。IDRs 的氨基酸组成具有偏向性，主要由带电荷、亲水性和小分子残基构成。由于这一特性，IDRs 被认为属于低复杂性结构域2,3。大量 IDRs 已引起广泛关注，主要因为这些区域在病理条件下，特别是神经退行性疾病中发挥着关键作用。此类疾病的特点是 IDRs 在神经元内发生自组装，并进一步在细胞外或细胞内沉积4。典型的 IDRs 实例包括阿尔茨海默病中的淀粉样蛋白-β（Aβ）、亨廷顿病中的亨廷顿蛋白（HTT），以及肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆中的 TAR DNA 结合蛋白-43（TDP-43）和肉瘤融合蛋白（FUS）4。光谱学方法，特别是荧光共振能量转移（FRET），极大地推动了在疾病背景下 IDRs 结构重排的研究。
IDR 的亲水性和延伸特性使其对溶液环境理化性质的变化极为敏感5。环境对 IDR 构象集合体产生影响的程度被称为结构敏感性5,6<....
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方案
1. 质粒构建
- 通过聚合酶链式反应（PCR）扩增编码目标 IDR 的开放阅读框（ORF）。由于 ORF 将被编码荧光蛋白的基因所侧翼，因此引物设计时不应包含终止密码子。扩增时，设计带有 SacI（5'端）和 BglII（3'端）限制性酶切位点的引物。
注：在代表性结果部分，我们选用 AtLEA4-5 作为目标 IDR。从 pTrc99A-AtLEA4-5 质粒12中扩增 AtLEA4-5 的 ORF。 - 使用 SacI 和 BglII 限制性内切酶对 ORF 的 PCR 产物进行连续酶切13。
- 从 Addgene 获取商业质粒 pDRFLIP38-AtLEA4-5（#178189）（https://www.addgene.org/178189/）。
- 使用 SacI 和 BglII 限制性内切酶对 pDRFLIP38-AtLEA4-5 质粒进行连续酶切，以移除 AtLEA4-5 的 ORF，保留含有 FRET 荧光对的空载体质粒13。
- 通过琼脂糖凝胶电泳后切胶回收的方法纯化酶切后的 DNA 片段14
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结果
将酵母细胞转化 pDRFLIP38-AtLEA4-5 质粒后，使用蓝光透射仪配合滤光片观察阳性转化子的荧光信号（图 1）。由于制备不同溶液以诱导高渗胁迫较为耗时，建议按照 图 2 所示的 96 孔板模板进行操作。在施加不同浓度氯化钠的高渗胁迫处理后，立即采集荧光发射光谱（图 3）。获取每种条件下的荧光发射光谱，以验证典型的 FRET 变化行为。为校正实验误差，需将荧光强度值归一化至等吸收点。在这些代表性结果中，我们测试了先前报道的 AtLEA4-5，这是一种高度敏感的植物内在无序区（IDR）6。作为对照，我们还测试了敏感性较低的球状蛋白 ABP（图 3）。可以看出，两种构建体均显示出 mCerulean3 和 Citrine 的发射光谱组合（分别为供体和受体荧光蛋白的峰值），表明在标准条件（0 M NaCl）下具有一定程度的基础 FRET 效率。对于 A.......
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讨论
本文介绍的方法提供了一种研究内在无序区（IDR）整体构象如何感知和响应环境扰动的途径。该方法依赖于一种基因编码的构建体，仅需在酵母细胞中实现质粒的稳定表达，无需其他额外组分，因此有望适用于其他细胞类型。此外，该方法还可广泛用于探索真核细胞在其生命周期中所经历的其他理化扰动21。FRET具有显著的分辨率，其能量转移仅在供体与受体荧光蛋白之间的距离小于10 nm时发生。然而，该方法的主要局限性在于无法获得精确的结构信息，这是基于整体FRET方法所固有的不足。
内在无序区（IDRs）固有的异质性和灵活性在细胞环境中研究其构象集合时带来挑战，使得X射线晶体学等技术难以适用。核磁共振（NMR）曾被用于研究细胞内无序蛋白，但由于信号干扰，环境条件的变化可能成为问题。22采用FRET技术研究IDR构象集合体具有独特优势，可实现对活细胞内群体分布的定位。此外，该方法还可与其他技术联用以 体外 单分子FRET（smFRET）等方法，展示了其对多种实验方法和条件的适应性
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢Cuevas-Velazquez实验室成员对本文稿的审阅。本研究得到了墨西哥国立自治大学（UNAM-PAPIIT）学术人员事务总局研究与技术创新项目支持计划（项目编号IA203422）、国家人文、科学与技术理事会（CONAHCYT）（项目编号252952）以及墨西哥国立自治大学化学学院研究与研究生支持计划（Grant 5000-9182）的资助。CET（CVU 1083636）和CAPD（CVU 1269643）感谢CONAHCYT提供的理学硕士奖学金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔板 | Greiner Bio-One | 655096 | |
| 琼脂 | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| BglII | New England BioLabs | R0144S | |
| BJ5465细胞 | American Type Culture Collection | 208289 | |
| 50 mM MES缓冲液 | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| 10 mM Tris-HCl缓冲液 | Invitrogen | 15506017 | |
| 1 mM EDTA | Merck | 108452 | |
| Falcon管 | Corning | 352057 | |
| LB培养基 | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| 0.1 M乙酸锂 | Sigma-Aldrich | L6883 | |
| 低熔点琼脂糖 | GOLDBIO | A-204-25 | |
| 微量离心机 | eppendorf | 5452000010 | |
| 质粒小提试剂盒 | ZymoPure | D4210 | |
| 0.02 M NaOH | Merck | 106462 | |
| 40% PEG 3,350 | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| 质粒pDRFLIP38-AtLEA4-5 | addgene | 178189 | |
| 酶标仪 | BMG LABTECH | CLARIOstar Plus | |
| SacI | New England BioLabs | R3156S | |
| 鲑鱼精DNA（2 mg/mL） | Thermo Fisher Scientific | 15632011 | |
| SD-Ura培养基 | Sigma-Aldrich | Y1501 | |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Taq DNA聚合酶 | Promega | M5123 | |
| 凝胶成像仪 | Accuris instruments | E4000 | |
| 紫外-可见分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | Biomate3 | |
| YPD培养基 | Sigma-Aldrich | Y1500 |
参考文献
- Wright, P. E., Dyson, H. J. Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (1), 18-29 (2015).
- Covarrubias, A. A., Romero-Pérez, P. S., Cuevas-Velazquez, C. L., Rendón-Luna, D. F. The functional diversity of struc....
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重印与许可
