使用 FRET估计活细胞中响应高渗应激的固有无序区域的结构敏感性

Summary

内在无序区域 （IDR） 是灵活的蛋白质结构域，可根据环境变化改变其构象。集成荧光共振能量转移（FRET）可以估计不同条件下的蛋白质尺寸。我们提出了一种FRET方法来评估高渗胁迫下酿酒 酵 母活细胞的IDR结构敏感性。

Abstract

内在无序区域 （IDR） 是参与关键细胞过程的蛋白质结构域。在应激条件下，细胞环境的物理化学性质发生变化，直接影响IDR的构象集合。IDR本身就对环境扰动敏感。研究细胞的物理化学特性如何调节IDR的构象集合对于理解其功能的环境控制至关重要。在这里，我们描述了一种分步方法，用于测量活 酿酒酵 母细胞中IDR对高渗胁迫条件的响应的结构敏感性。我们介绍了使用集成荧光共振能量转移 （FRET） 来估计 IDR 的全局维度在施加于任何渗透压的细胞的高渗应力逐渐增加期间如何变化。此外，我们还提供了一个脚本，用于处理荧光测量和比较不同IDR的结构灵敏度。通过遵循这种方法，研究人员可以获得对IDR在复杂的细胞内环境中不断变化的环境所经历的构象变化的宝贵见解。

Introduction

固有无序区域 （IDR） 是细胞过程中的关键组成部分¹。IDR与结构结构域相结合，对蛋白质功能至关重要。IDRs的氨基酸组成是有偏差的，主要由带电的、亲水的和小残基表示。由于这一特性，IDR 被认为是低复杂度域 ^2,3。许多IDR引起了人们的关注，主要是因为这些区域在病理状况中起着至关重要的作用，尤其是神经退行性疾病。此类疾病的特征是神经元中 IDR 的自组装和随后的细胞外或细胞内沉积⁴。此类 IDR 的例子包括阿尔茨海默病中的淀粉样蛋白 β （Aβ）、亨廷顿病中的亨廷顿蛋白 （HTT） 以及肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆的 TAR DNA 结合蛋白-43 和肉瘤融合蛋白 （FUS）⁴。包括荧光共振能量转移 （FRET） 在内的光谱方法显着增强了对疾病背景下 IDR 结构重排的研究。

IDR的亲水性和扩展性使其对溶液环境的理化性质变化极为敏感⁵。IDR的构象集合被环境改变的程度称为结构敏感性^5,6,7。可以使用不同的技术来研究IDR的构象和动力学，包括圆二色性（CD）和小角X射线散射（SAXS）^8,9。不幸的是，CD和SAXS需要大量的纯化蛋白质，因此它们不适合在细胞中进行研究。相比之下，FRET是一种测量两个荧光分子的荧光强度的技术，这些荧光分子特异性标记一个IDR，这意味着它们可以在复杂的混合物（如活细胞¹⁰）中进行监测。动态测量活细胞中IDR的结构敏感性对于了解环境如何调节无序蛋白质组的构象和功能是必要的。

FRET是一种强大的方法，用于量化活细胞中IDR以及球状和多结构域蛋白的结构敏感性。该方法需要一种由夹在两种荧光蛋白 （FP） 之间的目标 IDR 组成的构建体，称为 FRET对。对于该方案，我们建议使用 mCerulean3 作为供体 FP 和 Citrine 作为受体 FP，因为它们的动态范围很大，与之前关于 IDR 灵敏度⁶ 的研究中报告的其他 FP 相比。FRET以前已被用于测量植物IDR在不同细胞环境中的结构敏感性⁶。此外，该技术已被不同的研究小组用于表征 IDR 的整体蛋白质尺寸 体外和体内 ^5,11。

在这里，我们描述了用于研究活酵母（酿酒酵母）细胞中IDR结构敏感性的集成FRET方法。我们展示了基于名为AtLEA4-5的植物IDR的代表性结果。AtLEA4-5 在溶液中是无序的，但在体外诱导大分子拥挤时折叠成α螺旋 ¹²。AtLEA4-5 是该方法的良好参考模型，因为它相对较小（158 个残基）、无序且对环境扰动敏感，如计算机和体外^{报道的那样 6,12}。这里介绍的方法可以针对高通量方法进行扩展，因为酵母细胞易于生长，并且处理量小。此外，对方案的微小修改可以应用于其他细胞系统，例如细菌和植物细胞⁶。该协议可以在任何分子生物学实验室中进行，可以使用具有荧光模式的酶标仪，这是大多数研究机构提供的设备。

Protocol

1. 质粒构建体

1. 通过聚合酶链反应 （PCR） 扩增编码所需 IDR 的开放阅读框 （ORF）。不要包括终止密码子，因为ORF的两侧是编码荧光蛋白的基因。对于扩增，设计具有 SacI （5'） 和 BglII （3'） 限制性位点的引物。
   注意:对于代表性结果部分，我们使用 AtLEA4-5 作为选定的 IDR。我们从 pTrc99A-AtLEA4-5 质粒¹² 扩增了 AtLEA4-5 的 ORF。
2. 通过用 SacI 和 BglII 酶连续限制来消化 ORF PCR 产物¹³。
3. 从 Addgene （https://www.addgene.org/178189/） 获得商业质粒 pDRFLIP38-AtLEA4-5 （#178189）。
4. 使用 SacI 和 BglII 酶进行连续限制，以从 pDRFLIP38-AtLEA4-5 质粒中去除 AtLEA4-5 ORF，留下含有 FRET 对¹³ 的开放质粒。
5. 使用琼脂糖凝胶电泳中的凝胶回收¹⁴纯化消化的DNA片段。使用 DNA 连接酶¹⁵ 连接受限制的片段。
6. 将克隆反应转化为感受态 大肠杆菌 细胞（DH5α或相关菌株），并在含有50μg/ mL氨苄青霉素¹⁶的Luria-Bertani（LB）板中进行选择。在37°C下生长过夜（ON）。
7. 通过 PCR¹⁷ 在新平板和基因型中分离并培养至少五个转化菌落。使用标准小量制备方法¹⁸从阳性转化的菌落中纯化质粒DNA。
8. 使用琼脂糖凝胶电泳验证质粒DNA的提取和完整性¹⁹。使用 Sanger 测序²⁰ 验证构建体的正确克隆。

2. 酵母细胞中的质粒表达

注意:使用标准无菌技术执行以下步骤。使用培养层流罩或打火机。

1. 将 酿酒酵母 BJ5465（ATCC:208289）菌株接种到3mL酵母蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基中，并在30°C和200rpm下生长。
   注意:BJ5465 是一种蛋白酶缺陷 （CH1） 菌株，推荐用于 IDR。可以测试和使用其他 酿酒酵母 菌株。
2. 将 1 mL 过夜饱和 （OD₆₀₀ ~ 3-4） 酵母培养物以 14,000 x g 离心 1 分钟。通过移液小心地除去上清液。
3. 轻弹管，将沉淀重悬于 1 mL Tris-EDTA （TE） 缓冲液 （pH 7.5） 中。以14,000× g 离心1分钟，小心除去上清液。
4. 通过移液将沉淀重悬于500μL Lazy Bones缓冲液（40%w/v PEG 3,350;100mM醋酸锂;10mM Tris-HCl;1mM EDTA;pH 7.5）中。向重悬酵母细胞中加入25μL煮沸（100°C5分钟，然后在冰上冷却5分钟）鲑鱼精子DNA（2mg / mL）。
5. 将100ng质粒DNA加入混合物中，并将混合物涡旋1分钟以确保充分混合。让混合物在室温下静置1-2小时。
6. 将酵母混合物在42°C下热休克12分钟，然后在冰上再冷却12分钟。将试管以14000× g 离心1分钟，并小心地除去上清液。
7. 将沉淀重悬于 1 mL TE 缓冲液 （pH 7.5） 中。将 100 μL 转化细胞培养到补充有 15 g/L 琼脂的酵母合成脱落培养基（SD-ura）平板上。
8. 将板在30°C孵育2-3天（图1）。在新平板中划线至少五种酵母转化体并生长。

3. 酵母转化体的验证

1. 通过轻轻刮擦并重悬于5μL 20 mM NaOH中，选择每个转化候选物的一小部分到单个PCR管中。
2. 在热循环仪中将样品在99°C下加热10分钟，以裂解细胞并将DNA释放到溶液中。此步骤对于制备用于PCR的DNA模板至关重要。
3. 将 1 μL 煮沸的样品转移到单独的 PCR 反应混合物中，该混合物含有用于基因分型的适当引物和 PCR 试剂。我们使用了以下引物: 正向引物:5'-AAATATACCCCAGCCTCGATCTAGA-3'。反向引物:5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCG-3'。
4. 设置PCR反应并使用琼脂糖凝胶电泳验证正确质粒的存在。选择一种转化体进行进一步实验。

4. FRET测定酵母细胞培养物的制备

1. 将选定的酵母转化体的条纹接种到 3 mL 液体 1x SD-Ura 培养基中。
   注意:在层流罩和无菌材料中执行此过程。
2. 在30°C，200rpm下生长至少12小时以达到饱和。测量 OD₆₀₀。增长应该在OD₆₀₀ = 1.0-2.0之间。
   注意:如果 OD₆₀₀ 低于 1.0，请给予细胞更多的孵育时间来生长。如果 OD₆₀₀ 超过 2.0，请不要继续并从步骤 4.1 重新启动。

5. FRET测定的酵母细胞制备

1. 收集 2 mL 过夜酵母培养物，并在室温下以 14,000 x g 离心。通过移液小心地除去上清液。
2. 将沉淀重悬于 1 mL 50 mM 2-（N-吗啉基）乙磺酸 （MES） 缓冲液 （pH 6） 中。
3. 在室温下以14,000× g 离心。除去上清液。
4. 重复步骤 5.2 和 5.3。将酵母细胞重悬于 2 mL pH 6 的 MES 缓冲液中，并将体积倒入试剂储液槽中。

6. 设置荧光测量

注意:目前的扫描被认为是在具有荧光模式的酶标仪中进行的。

1. 对于基本设置，请按如下方式设置仪器: 测量类型:荧光强度 （FI） 光谱;微孔板名称:Greiner 96 F-bottom。
2. 对于光学设置，请按如下方式设置仪器:否。波长扫描点:91个;激发波长:433 nm;激发带宽:10 nm;发射波长:460 - 550;步幅:1 nm;发射带宽:10 nm;通过自动对焦获得的焦距;焦距:5 mm;用于增益的波长:490 nm。
3. 对于一般设置，请按如下方式设置仪器:稳定时间:0.1 s;阅读方向:单向，水平从左到右，从上到下。
   注意:必须针对每次测量调整手动输入的增益，使用预期在整个波长扫描过程中显示最高荧光强度水平的阱。

7. 高渗溶液的制备和荧光测量

1. 在 96 孔透明底黑板中制备 0 M、0.2 M、0.4 M、0.6 M、0.8 M、1 M、1.5 M 和 2 M NaCl 的溶液。每个孔中的最终体积为 200 μL（150 μL 渗透压溶液 + 50 μL 酵母细胞悬浮液）。
   注意:其他渗透压可用于诱导高渗应激。所有溶液必须在 50 mM MES 缓冲液 pH 6 中制备。
2. 在行A的前三个孔（A1，A2，A3）中加载150μL的50mM MES缓冲液，pH值为6，在随后的孔中，从左到右依次加入150μL相应的溶液（图2）。要测试建议的所有浓度，请继续在 B 行中加载。
   注意:此设置考虑了每种浓度的 3 次技术重复的测量值。
3. 使用 12 通道微量移液器将 50 μL 洗涤的酵母细胞转移到每个孔中。酵母细胞倾向于沉积到水库底部。确保在转移细胞之前通过上下移液彻底重悬酵母悬浮液。
4. 将传感器称重到含有不同溶液的 96 孔板中，并通过上下移液至少 4 次来充分混合。
5. 使用步骤6的规格设置，立即在酶标仪中测量所需孔的荧光强度发射光谱。对FRET测定中要测试的每个IDR重复该过程。
6. 可选步骤。如果可用，请按照此处描述的步骤测量仅供体构建体 （pDRFLIP38-mCerulean3）。
   注意:我们建议执行此步骤来计算每个条件的FRET效率。如果读取器无法执行此步骤，则可以使用FRET比率方法计算FRET。FRET计算的两种方法在步骤8和9中进行了解释。
7. 在三个独立的日内，对每个构建体至少执行三次重复。

8. 使用FRET效率方法进行数据处理

注意:对于了解 R 编程语言的读者，我们提供了一组 R 脚本来执行本节中所述的数据处理。脚本可以在 https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET 上找到。按照 README 文件中的说明进行操作。

1. 从酶标仪将数据导出为.xlsx文件。
2. 将每个扫描波长的荧光强度值归一化为所用FRET对的等渗点。
   注意:此步骤对于比较所有测试条件的光谱是必要的。mCerulean3 和 Citrine FRET对的等渗点为 515 nm。例如，获得 460 nm/515 nm、461 nm/515 nm、462 nm/515 nm 等荧光强度值的比率。
3. 计算荧光值归一化后每个技术重复的平均值。总的来说，每种高渗应激情况都应该有一列。
4. 在同一图中可视化所有荧光强度光谱（图3）。每个光谱应显示单个 mCerulean3 和黄水晶的荧光发射光谱的组合。在极少数情况下，当FRET效率为0时，将仅观察到供体荧光发射光谱，或者当FRET效率为1时，将仅观察到受体荧光。mCerulean3（供体）的荧光发射峰为475 nm，黄水晶（受体）的荧光发射峰为525 nm。
5. 确定荧光测量是否显示响应高渗应激的典型FRET变化。如果IDR的构象对治疗敏感，这将反映为FRET效率的变化。FRET效率的典型变化是供体荧光强度的降低与受体荧光强度的增加，反之亦然。
6. 量化FRET效率（E_FRET）。获得 IDR 构建体的供体 （mCerulean3） 归一化峰值 （475 nm/515 nm） 和仅供体构建体，适用于每种高渗应激条件。使用技术重复的平均归一化峰值。对三个独立重复中的每一个执行此操作。使用以下公式计算 E_FRET :
   
   其中 I_DA 是 IDR 构建体（FRET对构建体）的 475 nm/515 nm 比率，_{I D} 是仅供体构建体的 475 nm/515 nm 比率。
7. 比较FRET的效率。将每个高渗应力条件的 E_FRET 值归一化为非应力条件的 E_FRET 值（例如，0 M NaCl）。使用箱形图或平滑曲线图进行比较。执行单因素方差分析，然后进行事后 Tukey 统计检验（p 值:*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001）。

9. 使用FRET比率法进行数据处理

注意:如果无法获得仅供体的测量值，请执行FRET比率法。该方法比较了不同高渗应激条件下的FRET比率。步骤 7.1 至 7.5 应在执行本节步骤之前执行，以验证典型的 FRET 行为。对于了解 R 编程语言的读者，我们提供了一组 R 脚本来执行本节中所述的数据处理。脚本可以在 https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET 上找到。按照 README 文件中的说明进行操作。

1. 从先前从酶标仪导出的xlsx文件中提取475nm和525nm的数据。这些值对应于供体荧光团被激发时 mCerulean3（供体，DxDm）的荧光发射峰和黄水晶（受体，DxAm）的荧光发射峰 （433 nm）。
2. 将 475 nm 和 525 nm 处的荧光强度值归一化为所用 FRET对的等渗点。mCerulean3 和 Citrine FRET对的等渗点为 515 nm。获得FRET比率（DxAm/DxDm）。
3. 比较FRET比率。将每个高渗应激条件的 DxAm/DxDm 值归一化为非应激条件的平均 DxAm/DxDm（例如，0 M NaCl）。使用箱形图或平滑曲线图进行比较（图 4 和 图 5）。执行单因素方差分析，然后进行事后 Tukey 统计检验（p 值:*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001）。

Results

用 pDRFLIP38-AtLEA4-5 质粒转化酵母细胞后，用蓝光透射仪和滤光片观察阳性转化子的荧光（图 1）。制备不同的溶液来诱导高渗应激非常耗时，因此我们建议遵循 图2中的96孔模板。在用不同浓度的氯化钠进行高渗应激处理后，立即获得荧光发射光谱（图3）。获得每种条件的荧光发射光谱，以验证典型的FRET变化行为。需要将荧光强度值归一化到等渗点以纠正实验误差。对于这些代表性结果，我们测试了先前报道的 AtLEA4-5，这是一种高度敏感的植物 IDR⁶。作为参考，我们还测试了稍微不敏感的ABP球状蛋白（图3）。可以观察到，两种构建体都显示出 mCerulean3 和黄水晶发射光谱（供体和受体 FP 的峰）的组合，表明在标准条件 （0 M NaCl） 下具有一定程度的基础 FRET效率。对于AtLEA4-5，高渗应激导致受体的荧光强度增加，同时供体的荧光强度降低，表明高渗应激诱导的IDR压实（图3A）。在ABP中没有观察到这种趋势（图3B）。为了量化不同高渗应力处理之间结构敏感性的差异，我们绘制了每种条件的FRET比率（DxAm/DxDm），并进行了单因素方差分析统计检验（图4）。最后，我们比较了AtLE4-5和ABP的结构敏感性。我们观察到 AtLEA4-5 显示出明显高于 ABP 的灵敏度（图 5）。

图1: 酿酒酵 母转化体的荧光发射。 用 pDRFLIP38-AtLEA4-5 质粒转化的 酿酒酵母 接种的 SD-ura 培养皿。使用蓝光透射仪和橙色滤光片观察荧光。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 2:FRET系统的96孔板模板。 将每个高渗应激条件的三个技术重复放置在连续的孔中。前两行（A 和 B）符合一个构造 （IDR1） 的八个条件。以下行可以容纳新构造（IDR2、IDR3 等）。 请点击这里查看此图的较大版本.

图3:不同高渗胁迫条件下的归一化荧光发射光谱。 Spectra 验证了响应高渗应激 （NaCl） 处理的典型 FRET 行为。（A） AtLEA4-5，一种高度敏感的IDR。受体荧光强度的增加与供体荧光强度的降低相结合。（B） ABP，一种略微不敏感的球状蛋白。根据 FRET对mCerulean3和Citrine，在475 nm和525 nm处观察到峰。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 4:不同高渗应力条件下结构敏感性的量化。 用不同浓度的 NaCl 处理的活酵母细胞的归一化 FRET比值 （DxAm/DxDm）。（A） AtLEA4-5。（B）阿拉伯糖结合蛋白（ABP）。n = 9 个独立测量值。单因素方差分析。NS:不显著。p 值:*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p< 0.0001。方框表示第 25-75 个百分位数（中位数线）。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 5:AtLEA4-5 和 ABP 结构灵敏度的比较。 （A） AtLEA4-5 和 ABP 在不同高渗应力条件下的归一化 FRET 比值 （DxAm/DxDm）。 n = 3 个独立测量值。（B） AtLEA4-5 和 ABP 的 Delta FRET值（1.5 M - 0 M NaCl）。 变化报告为在FRET系统中在1.5 M NaCl下测量的结构的结构灵敏度。n = 3 个独立测量值。使用以下 p 值的双因素方差分析±标准差分析:*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p< 0.0001。 请点击这里查看此图的较大版本.

Discussion

这里介绍的方法提供了一种方法来深入了解IDR集合的全局维度如何感知和响应环境扰动。该方法依赖于基因编码的构建体，除了酵母细胞中的质粒稳定表达外，不需要其他成分，使其适用于其他细胞类型的潜在应用。此外，它可用于探索真核细胞在其生命周期中经历的其他物理化学扰动²¹.FRET的分辨率是显着的，能量转移仅发生在供体和受体FP之间小于10nm的范围内。然而，主要的局限性是缺乏精确的结构信息，而这些信息无法通过集成FRET方法获得。

IDR固有的异质性和灵活性在细胞环境中研究其集合时带来了挑战，使得X射线晶体学等技术变得不切实际。核磁共振已被考虑用于研究细胞中的无序蛋白质，但由于信号干扰，改变条件可能是一个问题²²。实施FRET技术来研究IDR构象集合提供了独特的功能，可以绘制活细胞内的群体分布图。此外，它可以与单分子FRET（smFRET）等体外方法相辅相成，显示出其对各种方法和实验条件的适应性²³。该协议使用 mCerulean3 作为供体 FP，使用 Citrine 作为受体 FP，提供了一个简单且易于跟踪的系统。选择FRET对必须仔细考虑频谱重叠，以减轻信号之间的串扰^24,25。当使用这种方法报告结构灵敏度的变化时，选择适当的FRET指标，如FRET效率（E_FRET），对于可靠的信号解释至关重要。或者，可以使用FRET比值（DxAm/DxDm）分析和比较结构灵敏度，但这需要仔细校正供体-受体荧光串扰²⁵。解释从酶标仪获得的荧光数据可能受到各种因素的影响，包括荧光团的性质、偶极子取向、分子间FRET与分子内FRET系统、样品制备和数据分析²⁵。

分子间FRET是集成FRET方法的一个主要局限性，因为不可能从数据的初始分析中丢弃它。这对读者提出了重要的考虑因素，因为已知一些IDR会募集到生物分子缩合物^中26,27。生物分子缩合物中大分子的局部浓度很高，这可能会诱导分子间相互作用，从而影响FRET读数。对于 AtLEA4-5，研究表明它在酵母细胞的高渗应激下自组装成离散的点状结构⁶。为了排除分子间FRET的影响，作者将细胞与1,6-己二醇（1,6-HD）一起孵育，1,6-己二醇是一种破坏生物分子缩合物的分子。1,6-HD 处理溶解了 AtLEA4-5 缩合物，但 FRET 水平没有降低，表明蛋白质缩合不会引起不希望的分子间 FRET。由于这种效应将取决于每个 IDR，因此读者应执行其他方法，例如受体光漂白或仅供体和仅受体构建体的共表达⁶。然而，从活细胞中集成FRET获得的信息对于表征IDR的结构敏感性具有重要意义。

这里介绍的协议的一个复杂方面是，它利用了一种对高渗压力表现出反应行为的生物体。在外部高浓度的氯化钠存在下，水离开细胞，增加总蛋白质浓度并建立拥挤的环境²⁸。IDR对大分子拥挤的变化很敏感5,6,11,12。具体来说，AtLEA4-5（该协议中用作模型的蛋白质）对不同分子量的拥挤剂敏感，但对体外^高浓度的盐或甘油不敏感6。由于甘油的积累对于酵母细胞对高渗应激的反应和适应很重要²⁹，因此需要强调的是，AtLEA4-5 压实的主要贡献者是渗透感应早期事件期间的大分子拥挤。当甘油积累时，AtLEA4-5 的结构在随后的驯化阶段如何改变，需要进一步研究。

探索无序蛋白质的构象动力学包括多种技术。在这种情况下，FRET是一种关键方法。根据具体的研究询问和所考虑的特征，研究人员可以使用体内核磁共振波谱来表征 IDR³⁰。此外，smFRET是体内研究的宝贵工具²³。电子顺磁共振 （EPR） 波谱是另一种用于在细胞环境中定量研究 IDR^{的技术 31}。基于质谱的方法也是强大的方法，因为它们可以提供蛋白质细胞构象的结构信息³²。这些方法包括非变性质谱法（NATURAL-MS）和离子淌度质谱法（IM-MS）^32,33。所有这些方法使研究人员能够深入研究IDR的多种构象及其动力学，从而阐明它们对细胞生物学的贡献。本工作中描述的方案可用于以高通量方式进行结构敏感性的初步筛选。后续研究可以侧重于测试所需细胞类型的结构敏感性，或者有可能通过体外方法（如 smFRET、CD 或 SAXS）获得机理见解。这些方法的组合对于清楚地了解IDR在不断变化的细胞环境中的结构敏感性是必要的。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 孔板	Greiner Bio-One	655096
琼脂	Sigma-Aldrich	5040
BglII	New England BioLabs	R0144S
BJ5465 细胞	美国型培养物收藏	208289
缓冲液 MES 50 mM	Sigma-Aldrich	M8250
缓冲液 Tris-HCl 10 mM	Invitrogen
EDTA，1 mM	Merck	108452
Falcon管	康宁	352057
LB培养基	，Sigma-Aldrich	L2897
，醋酸锂，0.1 M	Sigma-Aldrich	L6883
低熔点琼脂糖	，GOLDBIO	A-204-25
微量离心	，eppendorf	5452000010
小量制备试剂盒	ZymoPure	D4210
NaOH 0.02 M	Merck	106462
PEG 3,350 40%	Sigma-Aldrich	1546547
质粒 pDRFLIP38-AtLEA4-5	addgene	178189
读板器	BMG LABTECH	CLARIOstar Plus
SacI	New England BioLabs	R3156S
鲑鱼精子 DNA 2 mg/mLThermo	Fisher Scientific	15632011
SD-Ura	Sigma-Aldrich	Y1501
氯化钠	Sigma-Aldrich	S9888
Taq polymesare	Promega	M5123
Transiluminator	Accuris instruments	E4000
紫外-可见分光光度计	Thermo Fisher Scientific	Biomate3
YPD 培养基	Sigma-Aldrich	Y1500