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方法文章

利用FRET技术评估活细胞中内在无序区域对高渗应激的结构敏感性

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⸱

DOI：

10.3791/66275

⸱

2024年1月12日

 ,  , 
1Departamento de Bioquímica, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

内在无序区域（IDRs）是一类能够响应环境变化而改变其构象的柔性蛋白质结构域。集合荧光共振能量转移（FRET）可用于在不同条件下估算蛋白质的尺寸。本文介绍了一种FRET方法，用于评估在高渗胁迫下活体酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞中IDR的结构敏感性。

摘要

内在无序区域（IDRs）是参与多种关键细胞过程的蛋白质结构域。在应激条件下，细胞环境的理化性质发生变化，直接影响IDRs的构象集合。IDRs本身对环境扰动具有高度敏感性。研究细胞的理化性质如何调控IDRs的构象集合，对于理解其功能的环境调控机制至关重要。本文介绍了一种在活体酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞中，逐步测量IDRs在高渗应激条件下结构敏感性的实验方法。我们展示了如何利用群体荧光共振能量转移（FRET）技术，评估在任意渗透剂诱导的渐进性高渗应激过程中，IDRs整体尺寸的变化情况。此外，我们还提供了一个用于处理荧光测量数据并比较不同IDRs结构敏感性的分析脚本。通过采用该方法，研究人员可以获得关于IDRs在复杂胞内环境中随外界条件变化所发生构象改变的重要信息。

引言

内在无序区域（IDRs）是细胞过程中的关键组分1。与具有固定结构的结构域协同作用，IDRs 对蛋白质功能至关重要。IDRs 的氨基酸组成具有偏向性，主要由带电荷、亲水性和小分子残基构成。由于这一特性，IDRs 被认为属于低复杂性结构域2,3。大量 IDRs 已引起广泛关注，主要因为这些区域在病理条件下，特别是神经退行性疾病中发挥着关键作用。此类疾病的特点是 IDRs 在神经元内发生自组装，并进一步在细胞外或细胞内沉积4。典型的 IDRs 实例包括阿尔茨海默病中的淀粉样蛋白-β（Aβ）、亨廷顿病中的亨廷顿蛋白（HTT），以及肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆中的 TAR DNA 结合蛋白-43（TDP-43）和肉瘤融合蛋白（FUS）4。光谱学方法，特别是荧光共振能量转移（FRET），极大地推动了在疾病背景下 IDRs 结构重排的研究。

IDR 的亲水性和延伸特性使其对溶液环境理化性质的变化极为敏感5。环境对 IDR 构象集合体产生影响的程度被称为结构敏感性5,6,7。可用于研究 IDR 构象与动力学特性的技术包括圆二色光谱（CD）和小角 X 射线散射（SAXS）8,9。然而，CD 和 SAXS 需要大量纯化的蛋白质，因此不适用于细胞内的研究。相比之下，FRET 技术通过检测两个特异性标记同一 IDR 的荧光分子的荧光强度来实现测量，因而可在如活细胞等复杂的混合体系中进行监测10。在活细胞中动态测量 IDR 的结构敏感性，对于理解环境如何调控无序蛋白质组的构象与功能至关重要。

FRET 是一种强大的方法，可用于量化内在无序区（IDRs）以及在活细胞中球状蛋白和多结构域蛋白的结构敏感性。该方法需要构建一个包含目标 IDR 的序列，其两端分别连接两个荧光蛋白（FP），即所谓的 FRET 对。在本实验方案中，我们建议使用 mCerulean3 作为供体荧光蛋白，Citrine 作为受体荧光蛋白，因为与先前关于 IDR 敏感性研究中报道的其他荧光蛋白相比，这对组合具有较大的动态范围6。此前，FRET 已被用于在不同细胞环境中测量植物 IDR 的结构敏感性6。此外，不同研究团队已利用该技术在体外（in vitro）和体内（in vivo）条件下表征 IDR 的整体蛋白尺寸5,11。

此处，我们描述了利用整体FRET方法研究活体酵母中内在无序区（IDRs）结构敏感性的实验方案。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）) 细胞。我们展示了基于植物固有无序蛋白 AtLEA4-5 的代表性结果。AtLEA4-5 在溶液中处于无序状态，但在大分子拥挤环境诱导下会折叠形成 α-螺旋结构 体外12AtLEA4-5 是该方法的一个良好参照模型，因为它相对较小（158个残基），无序且对环境扰动敏感，如已有报道所示。 计算机模拟 和 体外6,12此处介绍的方法可扩展用于高通量研究，因为酵母细胞易于培养，且处理可在小体积中进行。此外，对该方案进行少量修改后，还可应用于其他细胞系统，如细菌和植物细胞。6该方案可在任何具备荧光模式微孔板读数仪的分子生物学实验室中进行，此类设备在大多数研究机构中均有配备。

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方案

1. 质粒构建

  1. 通过聚合酶链式反应（PCR）扩增编码目标 IDR 的开放阅读框（ORF）。由于 ORF 将被编码荧光蛋白的基因所侧翼，因此引物设计时不应包含终止密码子。扩增时，设计带有 SacI（5'端）和 BglII（3'端）限制性酶切位点的引物。
    注：在代表性结果部分，我们选用 AtLEA4-5 作为目标 IDR。从 pTrc99A-AtLEA4-5 质粒12中扩增 AtLEA4-5 的 ORF。
  2. 使用 SacI 和 BglII 限制性内切酶对 ORF 的 PCR 产物进行连续酶切13。
  3. 从 Addgene 获取商业质粒 pDRFLIP38-AtLEA4-5（#178189）（https://www.addgene.org/178189/）。
  4. 使用 SacI 和 BglII 限制性内切酶对 pDRFLIP38-AtLEA4-5 质粒进行连续酶切，以移除 AtLEA4-5 的 ORF，保留含有 FRET 荧光对的空载体质粒13。
  5. 通过琼脂糖凝胶电泳后切胶回收的方法纯化酶切后的 DNA 片段14，并使用 DNA 连接酶连接经酶切处理的片段15。
  6. 将连接产物转化至感受态 Escherichia coli 细胞（DH5α 或类似菌株）中，并在含有 50 µg/mL 氨苄青霉素的 Luria-Bertani（LB）平板上进行筛选16，37 °C 过夜培养（ON）。
  7. 挑取并培养至少五个转化菌落至新的平板上，通过 PCR 进行基因型鉴定17。使用标准质粒小提方法从阳性克隆中提取质粒 DNA18。
  8. 通过琼脂糖凝胶电泳验证质粒 DNA 的提取结果及完整性19，并通过 Sanger 测序验证构建体的正确克隆20。

2. 质粒在酵母细胞中的表达

注意：执行以下步骤时，应采用标准的无菌技术。使用超净工作台或酒精灯。

  1. 将 S. cerevisiae BJ5465 (ATCC: 208289) 菌株单菌落接种至 3 mL 酵母胰蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基中，于 30 °C、200 rpm 条件下过夜培养。
    注：BJ5465 为蛋白酶缺陷型（CH1）菌株，推荐用于 IDR 相关实验。其他 S. cerevisiae 菌株亦可测试并使用。
  2. 取 1 mL 过夜培养的饱和酵母菌液（OD600 ~ 3–4），在 14,000 × g 条件下离心 1 分钟。用移液器小心移除上清液。
  3. 通过轻弹管壁，将沉淀重悬于 1 mL Tris-EDTA（TE）缓冲液（pH 7.5）中。在 14,000 × g 条件下离心 1 分钟，并小心移除上清液。
  4. 用移液器将沉淀重悬于 500 µL Lazy Bones 缓冲液（40% w/v PEG 3,350；100 mM 醋酸锂；10 mM Tris-HCl；1 mM EDTA；pH 7.5）中。向重悬的酵母细胞中加入 25 µL 煮沸处理的鲑鱼精子 DNA（100 °C 加热 5 分钟，冰上冷却 5 分钟，终浓度为 2 mg/mL）。
  5. 向混合物中加入 100 ng 质粒 DNA，涡旋混匀 1 分钟以确保充分混合。室温静置 1–2 小时。
  6. 将酵母混合物在 42 °C 下进行热激处理 12 分钟，随后冰浴冷却 12 分钟。在 14,000 × g 条件下离心 1 分钟，并小心移除上清液。
  7. 将沉淀重悬于 1 mL TE 缓冲液（pH 7.5）中。取 100 µL 转化后的细胞涂布于含 15 g/L 琼脂的酵母合成缺陷型培养基（不含尿嘧啶，SD-ura）平板上。
  8. 在 30 °C 下培养 2–3 天（图 1）。挑取至少五个酵母转化子，在新的平板上划线并过夜培养。

3. 酵母转化子的验证

  1. 用移液枪头轻轻刮取每个转化子候选菌落的一小部分，并重悬于 5 µL 的 20 mM NaOH 中，分别加入到不同的 PCR 管中。
  2. 将样品置于热循环仪中，在 99 °C 下加热 10 分钟，以裂解细胞并释放 DNA 至溶液中。此步骤对于制备 PCR 所需的 DNA 模板至关重要。
  3. 取 1 µL 煮沸后的样品，加入另一含有适当引物和 PCR 试剂的 PCR 反应体系中，用于基因型鉴定。我们使用的引物序列如下：正向引物：5´-AAATATACCCCAGCCTCGATCTAGA-3´；反向引物：5´-GTAATACGACTCACTATAGGGCG-3´。
  4. 进行 PCR 反应，并通过琼脂糖凝胶电泳验证正确质粒的存在。选择一个转化子用于后续实验。

4. FRET检测用酵母细胞培养物的制备

  1. 将筛选出的酵母转化子单菌落接种至 3 mL 液体 1x SD-Ura 培养基中。
    注意：该操作需在超净工作台中进行，并使用无菌器材。
  2. 在 30 °C、200 rpm 条件下培养至少 12 小时，使其达到饱和生长状态。测定 OD600。菌液生长应处于 OD600 = 1.0–2.0 范围内。
    ​注意：若 OD600 低于 1.0，延长培养时间继续培养；若 OD600 超过 2.0，则不可继续实验，需从步骤 4.1 重新开始。

5. FRET 实验用酵母细胞的制备

  1. 取2 mL过夜培养的酵母菌液，于室温下以14,000 × g 离心。用移液器小心吸除上清液。
  2. 将菌体沉淀重悬于1 mL 50 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液（pH 6）中。
  3. 于室温下以14,000 × g 离心，弃去上清液。
  4. 重复步骤5.2和5.3，将酵母细胞重悬于2 mL、pH 6的MES缓冲液中，并将液体倒入试剂储槽中。

6. 设置荧光测量

注意：本次扫描被认为是在具有荧光模式的微孔板读板机中进行的。

  1. 基础设置：将仪器设置如下：测量类型：荧光强度（FI）光谱；微孔板名称：Greiner 96 F-bottom。
  2. 光学设置：将仪器设置如下：波长扫描点数：91；激发波长：433 nm；激发带宽：10 nm；发射波长：460 - 550；步长宽度：1 nm；发射带宽：10 nm；通过自动对焦获取焦平面高度；焦平面高度：5 mm；用于增益调节的波长：490 nm。
  3. 常规设置：将仪器设置如下：平衡时间：0.1 s；读取方向：单向，从左到右水平，从上到下。
    ​注意：手动输入的增益值必须针对每次测量进行调整，使用在整个波长扫描过程中预期显示最高荧光强度水平的孔位。

7. 高渗溶液的制备与荧光检测

  1. 在96孔透明底黑色板中配制0 M、0.2 M、0.4 M、0.6 M、0.8 M、1 M、1.5 M和2 M的NaCl溶液。每孔终体积为200 µL（150 µL渗透剂溶液 + 50 µL酵母细胞悬液）。
    注意：可使用其他渗透剂以诱导高渗胁迫。所有溶液均须用50 mM MES缓冲液（pH 6）配制。
  2. 在A行的前三个孔（A1、A2、A3）中各加入150 µL的50 mM MES缓冲液（pH 6），随后各孔从左至右依次加入对应浓度的溶液150 µL（图2）。若需测试所有建议浓度，继续在B行中加样。
    注意：该设置针对每个浓度进行3个技术重复的测量。
  3. 使用12通道移液器将50 µL洗涤后的酵母细胞转移至各孔。酵母细胞易在储液槽底部沉淀。转移前务必通过反复吹打充分重悬酵母悬液。
  4. 将细胞加入含有不同溶液的96孔板中，并通过反复吹打至少4次充分混匀。
  5. 立即使用微孔板读板仪，按照步骤6的设定参数测定目标孔的荧光强度发射光谱。对FRET实验中拟测试的每一个IDR重复该操作。
  6. 可选步骤。如有条件，可按照此处所述步骤测定仅含供体的构建体（pDRFLIP38-mCerulean3）。
    注意：建议执行此步骤以计算各条件下的FRET效率。若仪器无法完成该操作，可使用FRET比值法计算FRET。两种FRET计算方法分别在步骤8和9中说明。
  7. 对每个构建体至少在三个独立日期进行三次重复实验。

8. 使用FRET效率法进行数据处理

注意：对于熟悉 R 编程语言的读者，我们提供了一套 R 脚本，用于执行本节所述的数据处理。脚本可在 https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET 获取。请遵循 README 文件中的说明进行操作。

  1. 从酶标仪中将数据导出为 .xlsx 文件。
  2. 将每次扫描波长下的荧光强度值归一化至所用FRET对的等吸收点。
    注意：此步骤对于比较所有测试条件下的光谱是必要的。mCerulean3与Citrine FRET对的等吸收点为515 nm。例如，计算460 nm/515 nm、461 nm/515 nm、462 nm/515 nm等波长处的荧光强度比值。
  3. 在荧光值归一化后，计算每个技术重复的平均值。总共应为每种高渗应激条件设置一列数据。
  4. 在同一张图中可视化所有荧光强度光谱（图3）。每条光谱应显示mCerulean3和Citrine各自荧光发射光谱的组合。在极少数情况下，当FRET效率为0时，仅能观察到供体的荧光发射光谱；而当FRET效率为1时，仅能观察到受体的荧光发射光谱。mCerulean3（供体）的荧光发射峰位于475 nm，Citrine（受体）的荧光发射峰位于525 nm。
  5. 判断荧光测量结果是否显示出对高渗应激的典型FRET变化。如果IDR的构象对处理敏感，则会反映为FRET效率的变化。典型的FRET效率变化表现为供体荧光强度降低的同时受体荧光强度升高，或相反。
  6. 量化FRET效率（EFRET）。获取IDR构建体和仅含供体构建体在每种高渗应激条件下供体（mCerulean3）归一化的峰值比值（475 nm/515 nm）。使用技术重复的平均归一化峰值比值，并对三次独立重复实验均执行此操作。使用以下公式计算EFRET：
    FRET效率方程；公式；荧光共振能量转移定量；方程。
    其中IDA为IDR构建体（FRET对构建体）在475 nm/515 nm处的比值，ID为仅含供体构建体在475 nm/515 nm处的比值。
  7. 比较FRET效率。将每种高渗应激条件下的EFRET值归一化至无应激条件（例如0 M NaCl）下的EFRET值。使用箱形图或平滑曲线图进行比较。采用单因素方差分析（One-way ANOVA），随后进行Tukey事后检验（p值：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001）。

9. 使用FRET比率法进行数据处理

注意：如果无法获取仅供体的测量值，则执行 FRET 比值法。该方法比较不同高渗胁迫条件下的 FRET 比值。应在执行本节步骤之前完成步骤 7.1 至 7.5，以验证典型的 FRET 行为。对于熟悉 R 编程语言的读者，我们提供了一组 R 脚本，用于执行本节所述的数据处理。脚本可在 https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET 获取。请遵循 README 文件中的说明。

  1. 从先前从微孔板读板仪导出的 xlsx 文件中提取 475 nm 和 525 nm 处的数据。这些数值分别对应于 mCerulean3（供体，DxDm）和 Citrine（受体，DxAm）的荧光发射峰，激发波长为 433 nm（供体荧光团激发）。
  2. 将 475 nm 和 525 nm 处的荧光强度值归一化至所用 FRET 对的等吸收点。mCerulean3 和 Citrine FRET 对的等吸收点为 515 nm。计算 FRET 比值（DxAm/DxDm）。
  3. 比较 FRET 比值。将每种高渗胁迫条件下的 DxAm/DxDm 值归一化至无胁迫条件（例如 0 M NaCl）下的平均 DxAm/DxDm 值。使用箱形图或平滑曲线图进行比较（图 4 和 图 5）。采用单因素方差分析（One-way ANOVA），随后进行事后 Tukey 检验（p 值：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001）。

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结果

将酵母细胞转化 pDRFLIP38-AtLEA4-5 质粒后，使用蓝光透射仪配合滤光片观察阳性转化子的荧光信号（图 1）。由于制备不同溶液以诱导高渗胁迫较为耗时，建议按照 图 2 所示的 96 孔板模板进行操作。在施加不同浓度氯化钠的高渗胁迫处理后，立即采集荧光发射光谱（图 3）。获取每种条件下的荧光发射光谱，以验证典型的 FRET 变化行为。为校正实验误差，需将荧光强度值归一化至等吸收点。在这些代表性结果中，我们测试了先前报道的 AtLEA4-5，这是一种高度敏感的植物内在无序区（IDR）6。作为对照，我们还测试了敏感性较低的球状蛋白 ABP（图 3）。可以看出，两种构建体均显示出 mCerulean3 和 Citrine 的发射光谱组合（分别为供体和受体荧光蛋白的峰值），表明在标准条件（0 M NaCl）下具有一定程度的基础 FRET 效率。对于 A...

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讨论

本文介绍的方法提供了一种研究内在无序区（IDR）整体构象如何感知和响应环境扰动的途径。该方法依赖于一种基因编码的构建体，仅需在酵母细胞中实现质粒的稳定表达，无需其他额外组分，因此有望适用于其他细胞类型。此外，该方法还可广泛用于探索真核细胞在其生命周期中所经历的其他理化扰动21。FRET具有显著的分辨率，其能量转移仅在供体与受体荧光蛋白之间的距离小于10 nm时发生。然而，该方法的主要局限性在于无法获得精确的结构信息，这是基于整体FRET方法所固有的不足。

内在无序区（IDRs）固有的异质性和灵活性在细胞环境中研究其构象集合时带来挑战，使得X射线晶体学等技术难以适用。核磁共振（NMR）曾被用于研究细胞内无序蛋白，但由于信号干扰，环境条件的变化可能成为问题。22采用FRET技术研究IDR构象集合体具有独特优势，可实现对活细胞内群体分布的定位。此外，该方法还可与其他技术联用以 体外 单分子FRET（smFRET）等方法，展示了其对多种实验方法和条件的适应性

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢Cuevas-Velazquez实验室成员对本文稿的审阅。本研究得到了墨西哥国立自治大学（UNAM-PAPIIT）学术人员事务总局研究与技术创新项目支持计划（项目编号IA203422）、国家人文、科学与技术理事会（CONAHCYT）（项目编号252952）以及墨西哥国立自治大学化学学院研究与研究生支持计划（Grant 5000-9182）的资助。CET（CVU 1083636）和CAPD（CVU 1269643）感谢CONAHCYT提供的理学硕士奖学金。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96孔板Greiner Bio-One655096
琼脂Sigma-Aldrich5040
BglIINew England BioLabsR0144S
BJ5465细胞American Type Culture Collection208289
50 mM MES缓冲液Sigma-AldrichM8250
10 mM Tris-HCl缓冲液Invitrogen15506017
1 mM EDTAMerck108452
Falcon管Corning352057
LB培养基Sigma-AldrichL2897
0.1 M乙酸锂Sigma-AldrichL6883
低熔点琼脂糖GOLDBIOA-204-25
微量离心机eppendorf5452000010
质粒小提试剂盒ZymoPureD4210
0.02 M NaOHMerck106462
40% PEG 3,350Sigma-Aldrich1546547
质粒pDRFLIP38-AtLEA4-5addgene178189
酶标仪BMG LABTECHCLARIOstar Plus
SacINew England BioLabsR3156S
鲑鱼精DNA（2 mg/mL）Thermo Fisher Scientific15632011
SD-Ura培养基Sigma-AldrichY1501
氯化钠Sigma-AldrichS9888
Taq DNA聚合酶PromegaM5123
凝胶成像仪Accuris instrumentsE4000
紫外-可见分光光度计Thermo Fisher ScientificBiomate3
YPD培养基Sigma-AldrichY1500

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