本文介绍了一种通过在插入片段的3'端引入合适的限制性酶切位点，获得pVAX1-PRRSV表达载体的实验方案。我们可将载体线性化，并通过同源重组技术将DNA片段逐个连接至该载体。
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方法文章
一种无缝克隆方法用于构建猪繁殖与呼吸综合征病毒表达载体
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
基因表达载体的构建是实验生物学实验室工作的重要组成部分。随着Gibson Assembly等技术的进步，载体构建变得相对简单高效。然而，当猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的全长基因组难以通过单次聚合酶链式反应（PCR）从cDNA中扩增，或难以通过多个插入片段的同源重组获得全长基因表达载体时 体外目前的吉布森组装技术无法实现这一目标。
因此，我们旨在将PRRSV基因组分成多个片段，并在反向引物中引入适当的限制性酶切位点，以获得PCR扩增的片段。在通过同源重组技术将前一个DNA片段连接到载体中后，新载体获得了限制性内切酶切割位点。这样，我们就可以利用新添加的酶切位点将载体线性化，并在上游DNA片段的下游引入下一个DNA片段。
上游DNA片段3'端引入的限制性内切酶酶切位点将被消除，同时在下游DNA片段的3'端引入新的酶切位点。通过这种方法，我们可以将DNA片段逐个连接到载体中。该方法适用于成功构建PRRSV表达载体，是将大量片段组装到表达载体中的有效方法。
引言
分子克隆作为构建用于原核和真核细胞表达的基于DNA的实验工具的关键技术，是实验生物学中极为重要的组成部分。分子克隆包括四个步骤：获取插入DNA片段、将插入片段连接至合适的载体、将重组载体转化进入 大肠杆菌 (E. coli阳性克隆的鉴定1迄今为止，已有多种方法采用限制性内切酶来连接DNA分子2,3 以及PCR介导的重组4,5,6同源重组，即无缝克隆技术，是一类克隆方法，可实现将一个或多个DNA片段以序列无关且无痕的方式插入载体中。该技术包括序列与连接酶无关克隆（SLIC）、无缝连接克隆提取物（SLiCE）、In-Fusion克隆以及Gibson组装。该方法利用外切核酸酶降解插入片段和载体的一条DNA链，从而产生黏性末端，并通过以下方式之一完成连接： 体内 修复或 体外 通过形成磷酸二酯键，将插入片段与载体共价连接的重组技术具有显著优势。该技术能够在无任何序列限制的情况下，将单个插入片段以无缝方式连接至载体，极具吸引力。此外，该技术还能够以预定顺序连接5至10个片段，且不受序列限制。
作为众多重组DNA技术之一，吉布森组装（Gibson Assembly）技术目前是最有效的克隆方法7,8，是一种强大而精巧的基于外切核酸酶的方法，可无缝连接一个或多个线性化DNA片段。吉布森组装反应在等温条件下进行，使用三种酶的混合物，即5'外切核酸酶、高保真DNA聚合酶和耐热DNA连接酶。5'→3'外切核酸酶产生单链3'突出端，促使在末端具有互补序列的DNA片段发生退火。高保真DNA聚合酶通过添加dNTP填补退火后单链区域的缺口，随后耐热DNA连接酶封闭切口，形成完整的连接DNA分子8。因此，该技术已广泛应用于基因表达载体的构建。
猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是一种由PRRSV病毒引起的病毒性疾病，可导致各年龄段猪只出现繁殖障碍和呼吸衰竭9。该综合征表现为发热、厌食、肺炎、嗜睡、精神沉郁和呼吸困难。此外，在一些疫情中还观察到耳朵出现红/蓝色变色等临床症状。PRRSV属于动脉炎病毒科，可通过直接接触以及尿液、初乳和唾液等体液交换，在养猪国家广泛传播。由于PRRSV在美国的传播，根据580万头母猪和1.1亿头猪的养殖规模估算，养猪业每年的总经济损失约为6.64亿美元10,11。美国动植物卫生检验局的报告显示，49.8%未接种疫苗的猪血清中可检测到PRRSV12，感染猪体内低水平的PRRSV可通过唾液、鼻腔分泌物、尿液和粪便排出13。目前已实施多种策略以控制PRRSV的传播14,15,16。除采取清除措施以建立完全无病毒的猪群或提高生物安全性和管理水平外，接种疫苗也是控制PRRS的有效手段。
PRRSV 是一种有包膜的单股正链 RNA 病毒，基因组长度约为 15 千碱基（kb）。PRRSV 基因组包含至少 10 个开放阅读框（ORFs）、一段较短的 5' 非翻译区（5' UTR）以及位于 3' 末端的 poly(A) 尾（图 1A）17。负链 RNA 病毒的基因组不具备感染性，而正链 RNA 病毒的基因组具有感染性。目前存在两种主要的 RNA 和 DNA 转染策略用于产生病毒子代18。然而，构建感染性克隆的关键在于克隆出与 RNA 基因组相对应的全长片段。由于 PRRSV 基因组较长且结构复杂，难以通过一次 PCR 扩增获得全长基因组。此外，尽管人工合成 PRRSV 基因是一种有效手段，但长片段的合成通常成本较高。因此，为了获得 PRRSV 全长表达载体，我们尝试采用多片段同源重组方法进行构建19,20。然而，我们未能成功获得全长基因表达载体。因此，在本研究中，我们在反向引物中引入了适当的限制性酶切位点，并通过多轮同源重组反应成功获得了 pVAX1-PRRSV 表达载体。此外，该方法还可实现目的基因的删除或突变，并能高效地将大量 DNA 片段连接至表达载体中。
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方案
1. PRRSV 基因模板的制备
- 在1 mL RNA提取试剂中解冻病毒储备液（参见材料表）。
- 加入0.2 mL氯仿，充分混匀，4 °C孵育3分钟。
- 在4 °C、12,000 × g条件下离心15分钟。
注意：混合物分为三层，分别为无色水相、中间相和红色酚-氯仿相。 - 用移液器吸取无色水相，转移至新离心管中。
- 将水相与0.5 mL异丙醇充分混匀，在4 °C孵育10分钟。
- 在4 °C、12,000 × g条件下离心10分钟。
注意：管底可见白色RNA沉淀。 - 使用微量移液器弃去上清液。
- 加入1 mL 75%乙醇重悬沉淀，短暂涡旋振荡。
- 在4 °C、7,500 × g条件下离心5分钟，使用微量移液器弃去上清液。
- 将RNA干燥5分钟，加入20–50 µL无RNase水重悬RNA，并充分混匀。
- 进行逆转录反应；按照表1所示设置逆转录反应体系。
注意：为确保逆转录成功，请使用高质量的RNA模板。 - 将所得cDNA用于PCR扩增，或于-20 °C保存。
2. PCR 引物设计
- 设计上游引物
- 打开软件并选择 新建DNA文件。
- 将NCBI中的PRRSV基因序列（GenBank: FJ548852.1）粘贴到软件中。点击 确定 以生成序列文件。
- 分析序列并标记片段连接位点。设计各片段的上游特异性序列引物。在大多数情况下，推荐的熔解温度（Tm）为55 °C至62 °C之间，GC含量为40-60%。
- 点击 引物 并选择 添加引物。
- 粘贴特异性序列，并将载体的重叠序列添加至该特异性序列引物的5'端第一个核苷酸处。在每个连接位点附近，选择20-40 bp作为两个相邻片段之间的重叠区域。
- 命名包含悬臂序列和特异性序列的上游引物（见 补充图S1）。
- 点击 将引物添加至模板。
- 设计下游引物
- 在软件中分析序列并标记片段连接位点。设计各片段的下游特异性序列引物。
- 点击 引物 并选择 添加引物。
- 粘贴特异性序列，并将限制性酶切位点添加至该特异性序列引物的5'端第一个核苷酸处。
注意：所添加的限制性酶切位点必须在插入片段和载体中不存在，多克隆位点除外。 - 将载体的20-40 bp悬臂序列添加至限制性酶切位点的5'端第一个核苷酸处。
- 命名包含悬臂序列和特异性序列的下游引物（见 补充图S1）。
- 点击 将引物添加至模板。
3. PCR 扩增片段
- 设置六个独立的PCR反应（表2）：对于片段1，使用引物P1和P2（参见补充图S2）；对于片段2，使用引物P3和P4（参见补充图S2）；对于片段3，使用引物P5和P6（参见补充图S2）；对于片段4，使用引物P7和P8（参见补充图S2）；对于片段5，使用引物P9和P10；对于片段6，使用引物P11和P12（参见补充图S2）。
注意：使用前将各组分解冻、混匀，并短暂离心。 - 按照表2中的三步程序进行PCR扩增。
- 向5 µL PCR产物中加入1 µL 6x DNA上样缓冲液，混匀后短暂离心。
- 采用1%琼脂糖凝胶电泳分析样品。
4. PCR 片段的纯化
注意：使用凝胶回收试剂盒（参见材料表）从凝胶中纯化PCR产物对于载体构建至关重要。
- 向45 µL PCR产物中加入9 µL 6x DNA上样缓冲液，混匀后短暂离心。
- 进行1%琼脂糖凝胶/GoldView电泳以分离DNA片段。
注意：请勿重复使用TAE电泳缓冲液，因其pH值会影响DNA片段的回收。 - 待条带充分分离后，使用锋利的手术刀小心切下目标DNA条带。
注意：修剪掉多余的琼脂糖，尽量减小凝胶切块的体积。 - 将凝胶切块放入洁净的1.5 mL微量离心管中称重，加入与凝胶切块等体积的结合缓冲液（例如，0.3 g切块加入0.3 mL缓冲液），于60 °C孵育7分钟。
- 将微型离心柱插入2 mL收集管中。将步骤4.4中获得的700 µL DNA/琼脂糖溶液加入微型离心柱中。
- 在室温下以10,000 × g离心1分钟。弃去滤液，保留收集管重复使用。
- 加入300 µL结合缓冲液，在室温下以13,000 × g离心1分钟。弃去滤液，保留收集管重复使用。
- 加入700 µL洗涤缓冲液，在室温下以13,000 × g离心1分钟。弃去滤液，保留收集管重复使用。
- 将空的微型离心柱在最大转速下离心2分钟，以干燥柱基质。随后将微型离心柱转移至一支洁净的1.5 mL微量离心管中。
- 直接向柱膜中心加入20 µL去离子水，室温静置2分钟，然后在13,000 × g转速下离心1分钟。
- 将回收的DNA于-20 °C保存。
线性化载体的制备
注意：质粒制备完成后，可使用所选的酶对其进行切割。长时间消化或双酶切对于确保所有DNA的消化至关重要，这将减少后续实验中假阳性克隆的数量。
- pVAX1 线性化
- 按所示顺序在室温下配制反应体系（表3）。
注意：应加入适量水以维持指定的总体积。本反应中使用 1 µg 质粒进行酶切消化。根据质粒浓度，可相应调整反应体系中质粒的体积。 - 轻轻混匀后离心。在 37 °C 的加热块或水浴恒温器中孵育 60 分钟。
- 使用凝胶回收试剂盒（见材料表），参照第 4 节中 PCR 片段的纯化方法进行凝胶纯化。
- 按所示顺序在室温下配制反应体系（表3）。
- pVAX1-F1 线性化
注意：pVAX1-F1 是通过第一轮 pVAX1（NdeI 和 HindIII）与片段 1 重组获得的载体。pVAX1-F2 是通过 pVAX1-F1（NdeI）与片段 2 重组获得的载体。pVAX1-F3 是通过 pVAX1-F2（NdeI）与片段 3 重组获得的载体。pVAX1-F4 是通过 pVAX1-F3（NdeI）与片段 4 重组获得的载体。pVAX1-F5 是通过 pVAX1-F4（EcoRV 和 NtoI）与片段 5 重组获得的载体。- 针对每个载体，分别在室温下按所示顺序配制反应体系（表3）。
- 轻轻混匀后离心。在 37 °C 的加热块或水浴恒温器中孵育 60 分钟。
- 使用凝胶回收试剂盒（见材料表），参照第 4 节中 PCR 片段的纯化方法进行凝胶纯化。
6. 亚克隆至新载体
注意：使用 50-200 ng 的载体和插入片段时，可获得良好的克隆效率。
- 设置ExonArt无缝克隆与组装反应（表4）。使用灭菌去离子H2O将总体积调整至10 µL，并混匀。
- 在PCR仪中于50 °C孵育15–60分钟。将样品置于冰上保存。
注意：将孵育时间延长至60分钟可能提高组装效率。 - 在冰上解冻DH5α化学感受态细胞。
- 将10 µL的组装产物加入感受态细胞中，然后通过移液上下吹打轻轻混匀。
- 将混合物置于冰上静置30分钟。
- 在45 °C热激45秒，随后将离心管转移至冰上放置3分钟。
- 向离心管中加入900 µL SOC培养基。
- 在37 °C摇床培养箱中以225 rpm振荡培养1小时。
- 在6,000 × g条件下离心转化反应物2分钟。弃去上清液，将细胞重悬于100 µL新鲜SOC培养基中。
- 将转化后的细胞悬液涂布于含50 µg/mL卡那霉素的独立LB平板上。
- 在37 °C过夜培养所有平板。从每块实验平板上挑取单个独立菌落。
7. 分析转化子
- 挑取八个菌落至 20 µL 含 50 µg/mL 卡那霉素的 LB 培养基中。
- 设置菌落 PCR 反应并进行 PCR 扩增（表 5）。
注意：针对片段 1 的菌落 PCR 反应，使用引物 P1 和 P2（见 补充文件 1）；针对片段 2，使用引物 P3 和 P4（见 补充文件 1）；针对片段 3，使用引物 P5 和 P6（见 补充文件 1）；针对片段 4，使用引物 P7 和 P8（见 补充图 S2）；针对片段 5，使用引物 P9 和 P10；检测片段 6 时使用引物 P11 和 P12（见 补充图 S2）。 - 向 5 µL PCR 产物中加入 1 µL 6x DNA 上样缓冲液，混匀后短暂离心。
- 采用 1% 琼脂糖凝胶电泳分析结果。
- 挑取一个阳性菌落接种至 5 mL 含 50 µg/mL 卡那霉素的 LB 培养基中，于 37 °C 过夜培养。
- 按照生产商说明书，使用质粒 DNA 小量提取试剂盒（见 材料表）提取质粒。
- 通过 1% 琼脂糖凝胶电泳观察结果。
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结果
本文中，我们介绍了一种 体外 利用反向引物通过持续引入的限制性酶切位点，使用重组系统组装和修复重叠的DNA分子图1B）。该系统是一种简单高效的流程，包括通过带有适当5'端延伸序列和限制性酶切位点的引物进行PCR扩增，制备具有突出末端的线性载体和插入片段；以及随后的连接反应等步骤。 体外 单步等温反应及重组产物向适宜宿主菌的标准化学转化；阳性克隆的筛选以及获取用于下一轮克隆的重组载体。为逐步获得pVAX1-PRRSV载体，插入片段及重组载体的多克隆位点中必须不含限制性酶切位点。
由于通过单次PCR难以获得全长且复杂的基因序列，因此只能通过六次PCR反应扩增PRRSV的插入片段（图1C）。在第一轮重组过程中，PRRSV的片段1成功插入pVAX1载体中，由此构建出含有引入限制性酶切位点（NheI，单一酶切位点）的新型重组质粒，命名为pVAX1-F1（图1D）...
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讨论
Gibson 组装技术是一种基于体外重组的分子克隆方法，用于组装 DNA 片段8。该方法能够在单管等温反应中将多个 DNA 片段组装成环状质粒。然而，Gibson 组装技术的一个障碍是从 cDNA 中获取较长的片段。由于多种原因，长片段难以准确扩增。例如，引物在较长的延伸时间内更容易发生错配，cDNA 可能质量不佳，或富含 GC 的区域会阻碍 DNA 聚合。当无法通过 PCR 从 cDNA 中轻松获得全长片段时，就需要将全长片段分成多个片段进行扩增。然而，随着插入 DNA 片段数量和长度的增加，同源重组实验的效率以及阳性克隆的数量也会显著下降。因此，我们尝试了一种替代方案，即在插入片段的 3' 端引入合适的限制性酶切位点。随后，我们可通过同源重组技术将载体线性化，并逐个将 DNA 片段连接到载体中，再通过同源重组反应消除不需要的限制性酶切位点。
作为全球市场上最具经济重要性的病原体之一，PRRSV 在过去 30 年中始终受到研究人员的关注10,
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到了西华师范大学博士科研启动基金（编号：20E059）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 kb plus DNA Ladder | 天根生化科技（北京）有限公司 | MD113-02 | |
| 2x Universal Green PCR Master Mix | 荣蔚基因生物科技有限公司 | A303-1 | |
| 琼脂糖 | 生工生物工程（上海）股份有限公司 | 9012-36-6 | |
| 台式微量离心机 | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FRESCO17 | |
| 洁净工作台 | 苏净安泰空气技术 有限公司 | VD-650-U | |
| DNA电泳设备 | Cleaver Scientific 有限公司 | 170905117 | |
| DNA上样缓冲液（6x） | 碧硕生物技术有限公司 | BL532A | |
| E. Z. N. A. 凝胶回收试剂盒 | Omega Bio-Tek 公司 | D2500-01 | |
| E.Z.N.A. 质粒DNA小提试剂盒 I | Omega Bio-Tek 公司 | D6943-01 | |
| 电热恒温培养箱 | 上海恒仪科学仪器有限公司 | DHP-9082 | |
| ExonArt无缝克隆与组装试剂盒 | 荣蔚基因生物科技有限公司 | A101-02 | |
| ExonScript RT SuperMix（含dsDNase） | 荣蔚基因生物科技有限公司 | A502-1 | |
| FastDigest Eco321 (EcoRV) | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0303 | |
| FastDigest HindIII | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0504 | |
| FastDigest NheI | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0974 | |
| FastDigest NotI | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0596 | |
| 凝胶成像系统 Gel Doc XR | Bio-Rad Laboratories 有限公司 | 721BR07925 | |
| Goldview 核酸凝胶染料 | 上海翊博生物科技有限公司 | YB10201ES03 | |
| 制冰机 | 上海比朗仪器制造有限公司 | FMB100 | |
| Invitrogen Platinum SuperFi II DNA 聚合酶 | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | 12361010 | |
| LB 琼脂平板（卡那霉素） | 生工生物工程（上海）股份有限公司 | B530113-0010 | |
| LB 无菌液体培养基（卡那霉素） | 生工生物工程（上海）股份有限公司 | B540113-0001 | |
| 微量移液器 | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | — | |
| 微波炉 | 松下电器（中国）有限公司 | NN-GM333W | |
| 旋转摇床 | 上海智城分析仪器制造有限公司 | ZHWY-2102C | |
| PRRSV 病毒 | 四川农业大学 | — | |
| SnapGene | GSL Biotech, LLC | v5.1 | 用于引物设计 |
| T100 PCR 梯度热循环仪 | Bio-Rad Laboratories 有限公司 | T100 Thermal Cycler | |
| TAE 缓冲液 | 生工生物工程（上海）股份有限公司 | B040123-0010 | |
| TRIzol 试剂 | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | 15596026 | RNA 提取试剂 |
参考文献
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