绝对定量RNA测序（AQRNA-seq）是一种用于量化生物混合物中所有小RNA分布的技术。本文展示了AQRNA-seq的文库构建和数据处理步骤，用于量化在饥饿诱导的休眠期间Mycobacterium bovis BCG中转运RNA（tRNA）群体的变化。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
AQRNA-seq 在测序读段数与生物样本中小RNA拷贝数之间提供了直接的线性关系，从而实现了对小RNA群体的精确定量。本文所述的 AQRNA-seq 文库构建流程包括使用定制设计的测序接头，以及一步去除阻碍逆转录过程持续性的甲基化RNA修饰的步骤，从而提高了全长cDNA的产量。此外，还详细介绍了配套的生物信息学分析流程。本研究通过对营养剥夺20天及复苏6天过程中5个选定时间点采集的牛分枝杆菌BCG（Mycobacterium bovis BCG）中45种tRNA进行定量分析，展示了 AQRNA-seq 的应用。本文还将讨论进一步提高 AQRNA-seq 效率与严谨性的持续努力，包括探索在PCR扩增后避免凝胶纯化以缓解引物二聚体问题的方法，以及提高全长读段比例以实现更精确的读段比对。未来对 AQRNA-seq 的改进将聚焦于推动该技术的自动化和高通量实施，以实现对来自不同生物体的细胞和组织样本中所有小RNA种类的定量分析。
引言
下一代测序（NGS），也称为大规模并行测序，是一种DNA测序技术，包括DNA片段化、接头寡核苷酸连接、基于聚合酶链式反应（PCR）的扩增、DNA测序以及将片段序列重新组装成完整基因组。将NGS技术应用于RNA测序（RNA-seq）是一种强大而有效的方法，可用于鉴定和定量RNA转录本及其变异体1。随着RNA文库构建流程和生物信息学分析流程的不断创新，以及实验室仪器设备的持续进步，RNA-seq的应用范围已显著拓展，不再局限于外显子测序，而是延伸至非编码RNA谱型分析2、单细胞分析3、空间转录组学4,5、可变剪接分析6等先进的功能组学领域。这些先进的RNA-seq方法通过在正常与病变细胞及组织中对转录组进行定量分析，揭示了RNA复杂多样的生物学功能。
尽管RNA测序技术取得了上述进展，但若干关键技术特征仍限制了该方法的定量能力。虽然大多数RNA-seq方法能够对不同实验变量（即生物样本和/或生理状态）之间RNA水平的变化进行精确且准确的定量，但它们无法提供样本内RNA分子水平的定量比较。例如，大多数RNA-seq方法无法准确量化细胞中表达的tRNA池内各个同工受体tRNA分子....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
注意：图1 以图示方式展示了 AQRNA-seq 文库构建过程中涉及的操作步骤。实验中所用试剂、化学品以及层析柱/试剂盒的详细信息见材料表。建议通过以下方法对输入的 RNA 样本进行纯度、完整性和浓度的全面评估：(i) 3% 琼脂糖凝胶电泳，(ii) 用于生物分子样品质量控制的自动化电泳分析工具（参见材料表），以及 (iii) 紫外-可见分光光度法和/或荧光定量法。除非另有说明，所有反应体系和预混液均须置于冰上保存。运输试剂（如酶类）时应使用冷藏盒，从 -20 °C 保存处取用和送回，以延长其有效期，并避免文库中间产物经历多次冻融循环。
1. RNA 去磷酸化
注意：去除5'-磷酸基团（P；供体）可防止其与RNA的3'-羟基（OH；受体）发生自连。由于接头的3'端经过修饰，含有双脱氧胞苷（接头1）或间隔序列（接头2），因此不会发生自连。接头只能通过其5'-P与RNA或cDNA的3'-OH连接而实现连接。
- 在无菌PCR管（例如200 µL或500 µL管）中配制去磷酸化反应体系：加入最多2 µL RNA样品、0.5 µL 40 U/µL RNase抑制剂、1 µL 0.5 µM内标（表1）、0.5 µL 1....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
处于指数生长期的Mycobacterium bovis BCG（卡介苗）1173P2菌株经历了时间序列（0、4、10 和 20 天）的营养饥饿处理，随后在营养丰富的培养基中复苏6天，实验方案如Hu等7先前所述。在五个指定的时间点，从细菌培养物中分离小RNA，并设置三个生物学重复。使用上述AQRNA-seq文库构建流程（图1）构建Illumina文库，随后在麻省理工学院生物微中心的测序仪上进行测序。测序数据随后通过定制的AQRNA-seq数据分析流程（图2）进行处理，用于tRNA丰度的定量分析。
使用测序引物对cDNA文库进行PCR扩增后，所有样品中均观察到大小为175个碱基对（bp）的PCR产物（图3A），提示形成了引物二聚体。为减少引物二聚体的残留，从凝胶中切下大于195 bp的PCR产物并进行纯化（
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
AQRNA-seq文库构建流程旨在最大限度地捕获样本中的RNA，并在逆转录过程中最小化聚合酶脱落7。通过两步连接接头的方法，将新型DNA寡核苷酸（接头1和接头2）过量连接至样本中的RNA，使其完全互补。过量的接头可通过RecJf（一种特异性作用于单链DNA的5'至3'外切核酸酶）高效去除，而连接产物则保持完整。此外，AlkB处理可减少RNA上的甲基化修饰18，这些修饰可能在逆转录过程中导致聚合酶脱落，从而缓解人为截短cDNA产物的问题。AQRNA-seq是首个被报道的系统性优化连接和扩增效率的方法。该方法已验证具有定量准确性且无偏倚性假象，在miRNA表达谱研究中被证明是最准确的技术应用。
AQRNA-seq 流程较为复杂，在文库构建过程中，对于温度和/或时间敏感的步骤，建议谨慎操作。具体而言，在 cDNA 合成之前的步骤（图1；步骤 1-4），由于样品中含有本身不稳定的单链 RNA（ssRNA）或已连接 DNA 接头的单链 R.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
P.C.D. 是两项专利（PCT/US2019/013714，US 2019/0284624 A1）的发明人，这些专利与已发表的研究工作相关。
致谢
本研究的作者们感谢此前描述 AQRNA-seq 技术的原始论文的作者7。本工作获得了美国国立卫生研究院（ES002109、AG063341、ES031576、ES031529、ES026856）以及通过新加坡-麻省理工学院科研与技术联盟抗菌素耐药性独立研究组资助的新加坡国家研究基金会拨款的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-酮戊二酸 | Sigma-Aldrich | 75890 | 配制工作液（1 M），并于 -20 ℃ 保存ºC |
| 2100 生物分析仪 | 安捷伦 | G2938C | |
| 三磷酸腺苷（ATP） | New England Biolabs | M0437M（组分编号：N0437AVIAL） | NEB M0437M 含有 T4 RNA 连接酶 1（30 U/μL）、T4 RNA连接酶反应缓冲液（10X）、PEG 8000（1X）和ATP（100 mM）；配制工作液（10 mM）并于-20℃保存ºC |
| 琼脂糖 GPG/LE | AmericanBio | AB00972-00500 | 室温保存 |
| 六水合硫酸亚铁铵 | Sigma-Aldrich | F2262 | 配制工作液（0.25 M），并于 -20 ℃ 保存 °C |
| 小RNA分析生物分析仪 | 安捷伦 | 5067-1548 | 小RNA分析用于检测输入RNA的质量以及酶促反应的效率（例如接头1连接反应） |
| 牛血清白蛋白（BSA；10 mg/mL） | New England Biolabs | B9000 | 该产品已于2022年12月15日停产，由重组白蛋白（分子生物学级，NEB B9200）替代。 |
| 氯仿 | Macron Fine Chemicals | 4441-10 | |
| 去甲基化酶 | ArrayStar | AS-FS-004 | 去甲基化酶随 rtStar tRNA 预处理提供 & 第一链 cDNA 合成试剂盒 (AS-FS-004) |
| 脱氧核苷酸（dNTP）溶液混合物 | New England Biolabs | N0447L（组分编号：N0447LVIAL） | 该dNTP溶液混合物含有等摩尔浓度的dATP、dCTP、dGTP和dTTP（每种10 mM） |
| 数字双加热模块 | VWR 科学产品 | 13259-052 | 加热块与QIAquick配合使用 凝胶回收试剂盒 |
| DyeEx 2.0 离心柱纯化试剂盒 | Qiagen | 63204 | 可有效去除短片段残留物（例如，长度小于10 bp的寡核苷酸） |
| 电泳电源 | 伯乐实验室 | PowerPac 300 | |
| Eppendorf PCR管（0.5 mL） | Eppendorf | 0030124537 | |
| Eppendorf Safe-Lock 离心管（0.5 mL） | Eppendorf | 022363611 | |
| Eppendorf Safe-Lock 离心管（1.5 mL） | Eppendorf | 022363204 | |
| Eppendorf Safe-Lock 管（2 mL） | Eppendorf | 022363352 | |
| 乙醇（纯） | Sigma-Aldrich | E7023 | 使用Zymo Research公司的Oligo Clean and Concentrator试剂盒时，需采用纯乙醇 |
| 凝胶成像系统 | Alpha Innotech | FluorChem 8900 | |
| 上样缓冲液，紫色（6×），不含SDS | New England Biolabs | N0556S（组分编号：B7025SVIAL） | NEB N0556S 包含 Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder 和上样染料，紫色（6×），不含 SDS |
| GENESYS 180 紫外-可见分光光度计 | 赛默飞世尔科技 | 840-309000 | 分光光度计用于根据比尔定律测定寡核苷酸浓度 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 配制工作液（1 M；用 NaOH 调节 pH 至 8），并于 -20 ℃ 保存 °C |
| 盐酸（HCl） | VWR 科学产品 | BDH3028 | 配制工作液（5 M），并于室温下保存 |
| 异丙醇（异丙醇），纯品 | Macron Fine Chemicals | 3032-16 | 异丙醇与QIAquick一起使用 凝胶回收试剂盒 |
| L-抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A5960 | 配制工作液（0.5 M），并于 -20 ℃ 保存ºC |
| 微型离心机 | Eppendorf | 5415D | |
| NanoDrop 2000 分光光度计 | 赛默飞世尔科技 | ND-2000 | |
| NEBuffer 2 (10X) | New England Biolabs | M0264L（组分编号：B7002SVIAL） | NEB M0264L 含有 RecJf（30 U/μL）μL）和 NEBuffer 2（10X）；于 -20 保存 °C |
| 无核酸酶水（非DEPC处理） | 赛默飞世尔科技 | AM9938 | |
| Oligo Clean & 浓缩试剂盒 | Zymo Research | D4061 | 室温保存 |
| PEG 8000（50% 溶液） | New England Biolabs | M0437M（组分编号：B1004SVIAL） | NEB M0437M 含有 T4 RNA 连接酶 1（30 U/μL）、T4 RNA连接酶反应缓冲液（10X）、PEG 8000（1X）和ATP（100 mM）；配制工作液（10 mM）并于-20℃保存ºC |
| 珀尔帖热循环仪 | MJ Research | PTC-200 | |
| 苯酚：氯仿：异戊醇 乙醇 25:24:1 pH = 5.2 | 赛默飞世尔科技 | J62336 | |
| PrimeScript缓冲液（5X） | TaKaRa | 2680A | |
| PrimeScript 逆转录酶 | TaKaRa | 2680A | |
| QIAquick 凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28704 | 该试剂盒需要使用加热块和异丙醇 |
| Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder | New England Biolabs | N0551S（组分编号：N0551SVIAL） | |
| Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder | New England Biolabs | N0556S（组分编号：N0556SVIAL） | NEB N0556S 包含 Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder 和 Gel Loading Dye, Purple (6X)，不含 SDS |
| RecJf (30 U/μL | 新英格兰生物实验室 | M0264L（组分编号：M0264LVIAL） | NEB M0264L 含有 RecJf（30 U/μL）μL）和 NEBuffer 2（10X）；于 -20 保存 °C |
| RNase抑制剂（小鼠来源；40 U/μL）μL | New England Biolabs | M0314L （组分编号：M0314LVIAL） | -20℃保存 °C |
| SeqAMP DNA聚合酶 | TaKaRa | 638509 | TaKaRa 638509 含有 SeqAMP DNA聚合酶 和 SeqAMP PCR缓冲液（2X） |
| SeqAMP PCR缓冲液（2X） | TaKaRa | 638509 | TaKaRa 638509 含有 SeqAMP DNA聚合酶 和 SeqAMP PCR缓冲液（2X） |
| 虾碱性磷酸酶（1 U/μL) | 新英格兰生物实验室 | M0371L （组分编号：M0371LVIAL） | |
| 氢氧化钠（NaOH） | Sigma-Aldrich | S5881 | 配制工作液（5 M），并在室温下保存 |
| T4 DNA连接酶（400 U/μL | 新英格兰生物实验室 | M0202L （组分编号：M0202LVIAL） | NEB M0202L 含有 T4 DNA 连接酶（400 U/μL）和 T4 DNA 连接酶反应缓冲液（10X） |
| T4 DNA连接酶反应缓冲液（10X） | New England Biolabs | M0202L （组分编号：B0202SVIAL） | NEB M0202L 含有 T4 DNA 连接酶（400 U/μL）和 T4 DNA 连接酶反应缓冲液（10X） |
| T4 RNA连接酶1（30 U/μL | New England Biolabs | M0437M（组分编号：M0437MVIAL） | NEB M0437M 含有 T4 RNA 连接酶 1（30 U/μL）、T4 RNA连接酶反应缓冲液（10X）、PEG 8000（1X）和ATP（100 mM） |
| T4 RNA连接酶反应缓冲液（10X） | New England Biolabs | M0437M（组分编号：B0216SVIAL） | NEB M0437M 含有 T4 RNA 连接酶 1（30 U/μL）、T4 RNA连接酶反应缓冲液（10×）、PEG 8000（1×）和ATP（100 mM） |
参考文献
- Byron, S. A., Van Keuren-Jensen, K. R., Engelthaler, D. M., Carpten, J. D., Craig, D. W. Translating RNA sequencing into clinical diagnostics: opportunities and challenges. Nat Rev Gen. 17 (5), 257-271 (2016).
- Grillone, K., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
