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AQRNA-seq用于小RNA定量

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DOI：

10.3791/66335

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2024年2月2日

 ,  , 
1Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Singapore-MIT Alliance for Research and Technology Antimicrobial Resistance Interdisciplinary Research Group

本文内容

摘要

绝对定量RNA测序（AQRNA-seq）是一种用于量化生物混合物中所有小RNA分布的技术。本文展示了AQRNA-seq的文库构建和数据处理步骤，用于量化在饥饿诱导的休眠期间Mycobacterium bovis BCG中转运RNA（tRNA）群体的变化。

摘要

AQRNA-seq 在测序读段数与生物样本中小RNA拷贝数之间提供了直接的线性关系，从而实现了对小RNA群体的精确定量。本文所述的 AQRNA-seq 文库构建流程包括使用定制设计的测序接头，以及一步去除阻碍逆转录过程持续性的甲基化RNA修饰的步骤，从而提高了全长cDNA的产量。此外，还详细介绍了配套的生物信息学分析流程。本研究通过对营养剥夺20天及复苏6天过程中5个选定时间点采集的牛分枝杆菌BCG（Mycobacterium bovis BCG）中45种tRNA进行定量分析，展示了 AQRNA-seq 的应用。本文还将讨论进一步提高 AQRNA-seq 效率与严谨性的持续努力，包括探索在PCR扩增后避免凝胶纯化以缓解引物二聚体问题的方法，以及提高全长读段比例以实现更精确的读段比对。未来对 AQRNA-seq 的改进将聚焦于推动该技术的自动化和高通量实施，以实现对来自不同生物体的细胞和组织样本中所有小RNA种类的定量分析。

引言

下一代测序（NGS），也称为大规模并行测序，是一种DNA测序技术，包括DNA片段化、接头寡核苷酸连接、基于聚合酶链式反应（PCR）的扩增、DNA测序以及将片段序列重新组装成完整基因组。将NGS技术应用于RNA测序（RNA-seq）是一种强大而有效的方法，可用于鉴定和定量RNA转录本及其变异体1。随着RNA文库构建流程和生物信息学分析流程的不断创新，以及实验室仪器设备的持续进步，RNA-seq的应用范围已显著拓展，不再局限于外显子测序，而是延伸至非编码RNA谱型分析2、单细胞分析3、空间转录组学4,5、可变剪接分析6等先进的功能组学领域。这些先进的RNA-seq方法通过在正常与病变细胞及组织中对转录组进行定量分析，揭示了RNA复杂多样的生物学功能。

尽管RNA测序技术取得了上述进展，但若干关键技术特征仍限制了该方法的定量能力。虽然大多数RNA-seq方法能够对不同实验变量（即生物样本和/或生理状态）之间RNA水平的变化进行精确且准确的定量，但它们无法提供样本内RNA分子水平的定量比较。例如，大多数RNA-seq方法无法准确量化细胞中表达的tRNA池内各个同工受体tRNA分子的相对拷贝数。正如配套出版物7所强调的，RNA-seq的这一局限性源于RNA结构本身以及文库构建过程中涉及的若干生化特性。例如，用于将3'端和5'端测序接头连接至RNA分子的连接酶活性，会受到RNA末端核苷酸以及测序接头序列的影响。这导致接头连接效率存在显著差异，并引发测序读长出现严重的假象性增加8,9,10。

第二类局限性源于RNA分子固有的结构特性。具体而言，RNA二级结构的形成以及表观转录组中数十种转录后RNA修饰的动态变化 ，可能在逆转录过程中导致聚合酶脱落或产生突变。这些错误会造成cDNA合成不完整或截短，或导致RNA序列发生改变。尽管这两种现象可被用于绘制RNA二级结构或某些修饰位点，但如果后续文库构建步骤未能捕获截短的cDNA，或数据分析过程中丢弃了与参考数据集不匹配的突变序列，则会降低RNA-seq的定量准确性11,12。此外，RNA转录本在化学性质、长度和结构上的高度多样性，以及缺乏对长RNA进行均一片段化的工具，限制了大多数RNA-seq方法在所有RNA种类中的适用性13。

AQRNA-seq（绝对定量RNA测序）方法的开发旨在消除若干限制定量准确性的技术和生物学因素7。通过在RNA测序文库构建过程中最大限度地减少捕获、连接和扩增步骤中的序列依赖性偏差，AQRNA-seq相较于其他方法表现出更优的线性关系，能够以2倍以内的准确度对包含963种miRNA的参考文库中75%的miRNA进行精确量化。测序读段数量与RNA丰度之间的线性相关性也在对不同长度RNA寡核苷酸标准品混合物的分析以及与如Northern印迹等正交方法的比较中得到验证。测序读段数量与RNA丰度之间线性关系的确立，使AQRNA-seq能够实现对样本中所有RNA种类的准确绝对定量。

以下是AQRNA-seq文库构建流程及配套下游数据分析流程的方案描述。该方法已用于阐明在饥饿诱导的休眠及随后复苏过程中tRNA丰度的动态变化 的 Mycobacterium bovis 卡介苗（bacilli de Calmette et Guérin, BCG）结核病模型。研究结果展示了测序数据的探索性可视化分析，并结合后续的聚类分析和差异表达分析，揭示了与不同表型相关的tRNA丰度的可辨识模式。

方案

注意：图1 以图示方式展示了 AQRNA-seq 文库构建过程中涉及的操作步骤。实验中所用试剂、化学品以及层析柱/试剂盒的详细信息见材料表。建议通过以下方法对输入的 RNA 样本进行纯度、完整性和浓度的全面评估：(i) 3% 琼脂糖凝胶电泳，(ii) 用于生物分子样品质量控制的自动化电泳分析工具（参见材料表），以及 (iii) 紫外-可见分光光度法和/或荧光定量法。除非另有说明，所有反应体系和预混液均须置于冰上保存。运输试剂（如酶类）时应使用冷藏盒，从 -20 °C 保存处取用和送回，以延长其有效期，并避免文库中间产物经历多次冻融循环。

1. RNA 去磷酸化

注意：去除5'-磷酸基团（P；供体）可防止其与RNA的3'-羟基（OH；受体）发生自连。由于接头的3'端经过修饰，含有双脱氧胞苷（接头1）或间隔序列（接头2），因此不会发生自连。接头只能通过其5'-P与RNA或cDNA的3'-OH连接而实现连接。

  1. 在无菌PCR管（例如200 µL或500 µL管）中配制去磷酸化反应体系：加入最多2 µL RNA样品、0.5 µL 40 U/µL RNase抑制剂、1 µL 0.5 µM内标（表1）、0.5 µL 10x T4 RNA连接酶反应缓冲液、1 µL 1 U/µL虾碱性磷酸酶，并加入无RNase水至总体积为5 µL。
    注意：对于典型样品，使用本方案定量小RNA时，75 ng RNA（或对于80 nt RNA约为2 pmol）已足够。
  2. 在37 °C孵育30分钟以实现RNA去磷酸化，随后在65 °C孵育5分钟以灭活酶并使RNA变性。将样品置于4 °C至少10分钟，以防止RNA复性。

2. 将接头1连接至RNA的3'端

  1. 在无菌PCR管中配制连接子1（Linker 1）连接反应体系：加入5 µL去磷酸化的RNA（步骤1的产物）、0.5 µL 40 U/µL RNase抑制剂、1 µL 100 µM Linker 1（表1）、3 µL 10 mM ATP、2.5 µL 10× T4 RNA连接酶反应缓冲液、15 µL PEG8000（50%溶液）、2 µL 30 U/µL T4 RNA连接酶1，以及1 µL无RNase水。
    注意：试剂可预先配制成预混液以方便样本处理。但PEG8000和T4 RNA连接酶1不应包含在预混液中。
  2. 在25 °C孵育2小时，随后在16 °C孵育16小时，以将Linker 1连接至RNA。
  3. 对连接了Linker 1的RNA进行柱纯化。使用DNA/RNA回收与纯化试剂盒（参见材料表）。
    注意：本柱纯化方案适用于后续所有使用相同试剂盒的柱纯化步骤。此处不可使用基于凝胶过滤技术去除测序反应中染料终止子的试剂盒（参见材料表），因为PEG8000与此类试剂盒中的凝胶过滤柱不兼容。建议在纯化后保留每份样本的等分试样（1.2 µL）。必要时，可通过商业核酸分析仪检测这些等分试样以评估连接效率。将剩余纯化后的样本置于冰上或-20 °C保存，待后续步骤使用。
    1. 若样本体积< 50 µL，加入无RNase水将体积调整至50 µL。向1体积样本中加入2体积的寡核苷酸结合缓冲液（试剂盒提供），并向1体积样本中加入8体积的100%乙醇。
    2. 将样本（每次最多750 µL）上样至置于2 mL收集管（试剂盒提供）中的纯化柱中。为使RNA结合至纯化柱，以10,000 x g离心30秒，弃去穿流液（即收集管中的液体）。将纯化柱重新放回收集管中。
    3. 为洗去杂质，向纯化柱中加入750 µL DNA洗涤缓冲液（试剂盒提供）。以10,000 x g离心30秒，弃去穿流液。将纯化柱重新放回收集管中。
    4. 以最大转速（例如台式微量离心机的16,000 x g）再离心1分钟，以去除残留的DNA洗涤缓冲液。
    5. 为洗脱RNA，小心将纯化柱转移至无菌1.5 mL离心管中，向纯化柱中加入无RNase水。洗脱RNA时应加入比所需体积稍大的水量，以补偿洗脱过程中的潜在体积损失。例如，若下一步需要15 µL，则可加入17 µL无RNase水进行洗脱。以10,000 x g离心30秒。

3. 利用 AlkB 去甲基化酶去除转录后甲基化修饰

注意：AlkB 是一种细菌酶，可去除 DNA 和 RNA 中部分甲基化核苷酸上的甲基，但并非所有甲基化核苷酸均可被去除。去除 RNA 中多种类型的甲基化核糖核苷酸可防止逆转录酶脱落，从而获得更完整的读长并实现修饰位点的鉴定。此步骤需在低 pH 条件下进行控制，以防止 RNA 发生意外降解。

  1. 通过将1.4611 g的2-酮戊二酸（分子量为146.11 g/mol）溶解于10 mL无RNase的水中，配制1 M的2-酮戊二酸储备液。使用0.2 µm针头滤器过滤除菌。将储备液分装至2 mL无菌离心管中，于-20 °C保存。
  2. 通过将0.88 g的L-抗坏血酸（分子量为176.12 g/mol）溶解于10 mL无RNase的水中，配制0.5 M的L-抗坏血酸储备液。使用0.2 µm针头滤器过滤除菌。将储备液分装至2 mL无菌离心管中，于-20 °C保存。
  3. 通过将0.9835 g的六水合硫酸亚铁铵（分子量为392.14 g/mol）溶解于10 mL无RNase的水中，配制0.25 M的六水合硫酸亚铁铵储备液。使用0.2 µm针头滤器过滤除菌。将储备液分装至2 mL无菌离心管中，于-20 °C保存。
  4. 通过将2.383 g的HEPES（分子量为238.30 g/mol）溶解于10 mL无RNase的水中，配制1 M的HEPES储备液。用NaOH调节溶液pH至8，然后使用0.2 µm针头滤器过滤除菌。将储备液分装至2 mL无菌离心管中，于-20 °C保存。
  5. 配制2x AlkB反应缓冲液。配制10 mL缓冲液时，依次加入1.5 µL的1 M 2-酮戊二酸（步骤3.1制备）、80 µL的0.5 M L-抗坏血酸（步骤3.2制备）、6 µL的0.25 M六水合硫酸亚铁铵（步骤3.3制备）、100 µL的10 mg/mL BSA、1000 µL的1 M HEPES（步骤3.4制备；最后加入），以及8812.5 µL无RNase的水。使用0.2 µm针头滤器过滤除菌。
    注意：由于组分化学性质不稳定，2x AlkB反应缓冲液必须在每次实验前新鲜配制。
  6. 在无菌PCR管中配制AlkB消化反应体系，依次加入20 µL的Linker-1连接的RNA（步骤2的产物）、50 µL的2x AlkB反应缓冲液（步骤3.5制备）、2 µL AlkB去甲基化酶、1 µL RNase抑制剂和27 µL无RNase的水。
  7. 在室温孵育2小时，以去除RNA上的转录后甲基化修饰。
  8. 为从反应体系中去除AlkB蛋白，请按以下步骤操作：
    1. 为实现清晰的相分离，向AlkB反应体系中加入50 µL无RNase的水，然后加入100 µL苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1，pH = 5.2）。
    2. 手动振荡10秒，随后在16,000 x g条件下离心10分钟。确保台式离心机的转子与PCR管兼容，必要时使用适配器。
    3. 将RNA（即上层水相，约140 µL）转移至新的无菌1.5 mL离心管中。若氯仿相（即下层）混入水相中，需使用相同条件再次离心。
    4. 向提取的RNA中加入100 µL氯仿以去除残留苯酚。手动振荡10秒，随后在16,000 x g条件下离心10分钟。
    5. 将RNA（即上层水相，约120 µL）转移至新的无菌1.5 mL离心管中。
  9. 对提取的RNA进行柱纯化。使用DNA/RNA回收与纯化试剂盒（参见材料表），并按照步骤2.3中详述的方案进行柱纯化操作。

4. 去除过量的连接子1

注意：建议在纯化后保存每份样品的等分试样（1.2 µL）。如有需要，可通过商用核酸分析仪检测这些等分试样，以评估RecJf消化效率。随后应立即对纯化后的样品进行逆转录。

  1. 在无菌PCR管中配制去腺苷化反应体系，加入15 µL Linker-1连接的RNA（步骤3的产物）、1 µL 40 U/µL RNase抑制剂、2 µL 10x试剂盒缓冲液2（见材料表）和2 µL 50 U/µL 5'-去腺苷化酶。
  2. 在30 °C孵育1小时，以去除Linker 1 5'端的腺苷。向去腺苷化反应体系中加入2 µL 30 U/μL RecJf酶。
  3. 在37 °C孵育30分钟，以消化过量的Linker 1。再向反应体系中加入2 µL 30 U/μL RecJf酶。
  4. 在37 °C继续孵育30分钟，以进一步消化过量的Linker 1，随后在65 °C孵育20分钟以使酶失活。
  5. 对Linker-1连接的RNA进行柱纯化。使用基于凝胶过滤技术的试剂盒去除测序反应中的染料终止物（见材料表），该方法可有效去除短片段残留物（例如长度为2至10 bp的寡核苷酸）。按以下步骤进行纯化：
    1. 根据制造商说明书准备凝胶过滤柱。将柱子放入无菌1.5 mL离心管中，并上样24 µL反应液。
    2. 为纯化RNA，以800 x g离心3分钟，弃去柱子。纯化后的RNA存在于流出液中。

5. 逆转录（RT）反应

注意：以下 RT（参见材料表）反应体系的设置遵循制造商的说明书，仅进行了少量修改以适配 AQRNA-seq。

  1. 在无菌PCR管中配制反转录引物退火反应体系，加入24 µL模板RNA（步骤4的产物）、1 µL 2 µM反转录引物 （表1）以及1 µL dNTP （每种核苷酸浓度为10 mM）。
  2. 在80 °C孵育2分钟，使反转录引物与模板RNA退火，随后立即置于冰上冷却2分钟。
  3. 向退火反应管中加入6 µL 5x反转录反应缓冲液、1 µL 40 U/µL RNase抑制剂和1 µL反转录酶，配制反转录反应体系。
  4. 在50 °C孵育2小时，完成RNA模板的反转录，随后在70 °C孵育15分钟以灭活酶活性。反转录产物（即RNA-cDNA杂合链）可在4 °C或-20 °C保存过夜。

6. RNA 水解

  1. 向RNA-cDNA杂合物（步骤5的产物）中加入1 µL 5 M NaOH。在93 °C孵育3分钟，以水解RNA-cDNA杂合物中的RNA链。
  2. 加入0.77 µL 5 M HCl以中和反应体系。加入HCl后，轻轻振荡混匀，并短暂离心收集液体。中和反应瞬间完成。
    注意：建议在缓冲条件下测试中和1 µL NaOH所需5 M HCl的精确用量（例如使用pH试纸）。
  3. 对单链cDNA进行柱纯化。使用DNA/RNA回收与纯化试剂盒（见材料表）。按照步骤2.3中详述的方案进行柱纯化操作。
    注意：由于此前步骤中存在pH变化，不能使用基于凝胶过滤技术去除测序反应中染料终止物的试剂盒（见材料表）。
  4. 将纯化的cDNA使用真空浓缩仪浓缩至< 5 µL，然后加入无RNase的水将体积调至5 µL。注意避免将cDNA完全干燥。
  5. 将纯化的cDNA转移至无菌PCR管中。纯化的cDNA可在-20 °C保存最多1周。

7. 将接头2连接至cDNA的3'端

  1. 在无菌PCR管中配制连接子2（Linker 2）连接反应体系：加入5 µL cDNA（步骤6的产物）、1 µL 50 µM的连接子2（表1）、2 µL 10x T4 DNA连接酶反应缓冲液、1 µL 10 mM ATP、9 µL PEG8000（50%溶液）以及2 µL 400 U/µL T4 DNA连接酶。
    注意：试剂可预先配制成总混合液以方便样本处理，但PEG8000和T4 DNA连接酶不应包含在总混合液中。
  2. 在16 °C下孵育16小时，使连接子2与cDNA连接。
  3. 对连接了连接子2的cDNA进行柱纯化。使用DNA/RNA回收与纯化试剂盒（见材料表），并按照步骤2.3中详述的方案进行柱纯化操作。

8. 去除过量的连接子2

  1. 在无菌PCR管中配制去腺苷化反应体系：加入16 µL Linker-2连接的cDNA、2 µL 10x试剂盒缓冲液2和2 µL 50 U/µL的5'-去腺苷化酶。在30 °C孵育1小时，以去除Linker 2 5'端的腺苷酸。
  2. 向去腺苷化反应体系中加入2 µL 30 U/μL的RecJf酶，在37 °C孵育30分钟，以消化过量的Linker 2。再向反应体系中加入2 µL 30 U/μL的RecJf酶。
  3. 在37 °C继续孵育30分钟，以进一步消化过量的Linker 2，随后在65 °C孵育20分钟，使酶失活。

9. 使用测序引物对cDNA进行PCR扩增

  1. 为样品分配PCR引物。每个样品需要独特的正向和反向引物组合（表1），以实现有效的多重扩增。
  2. 加入无RNase的水，使样品体积达到25 µL。将每个样品的5 µL保存至无菌PCR管中作为备份，以防需要重复PCR反应。
  3. 通过加入20 µL cDNA（来自步骤8的产物）、1 µL 2.5 µM正向引物、1 µL 2.5 µM反向引物、25 µL 2x DNA聚合酶缓冲液、2 µL无RNase的水和1 µL DNA聚合酶，配制PCR反应体系（参见材料表中的PCR试剂盒）。
    注意：可将试剂预先配制成总混合液（master mix）以方便样品处理。切勿将DNA聚合酶加入总混合液中。
  4. 进行PCR扩增，初始变性条件为94 °C、1分钟，随后进行18个循环的扩增：98 °C变性20秒、58 °C退火20秒、68 °C延伸1分钟。
    注意：避免PCR扩增超出线性范围。对于大多数实验，18个循环为最佳选择，但具体循环数可能因实验条件而异。
  5. 使用真空浓缩仪将PCR产物浓缩至体积小于25 µL，然后加入无RNase的水将体积调回25 µL。取5 µL PCR产物转移至无菌0.5 mL离心管中，用于检测片段大小分布（见步骤9.6）。将剩余的20 µL PCR产物于-20 °C保存，待后续步骤使用。
  6. 按以下方法检测PCR产物的片段大小分布。
    1. 用TAE缓冲液配制3%琼脂糖凝胶。
      注意：本实验方案中，使用溴化乙锭（EtBr）进行电泳后的凝胶染色（见步骤9.6.5）。也可在此步骤将合适的DNA染料加入凝胶溶液中，或在电泳后用于染色。
    2. 将1 µL 6x上样染料与5 µL PCR产物（来自步骤9.5）混合，并将混合液上样至凝胶孔中。
    3. 在第一个样品前和最后一个样品后的加样孔中各加入5 µL DNA分子量标记物（DNA ladder）。使用50 bp或100 bp的DNA ladder，以便更准确地区分150 bp至300 bp范围内的PCR产物大小。
    4. 进行凝胶电泳以定位PCR产物。合适的电泳条件可能因实验条件而异。此处，对尺寸为17.78 cm（宽）× 10.16 cm（高）× 1 cm（厚）的凝胶，以120 V、400 mA恒定电流运行75分钟。
    5. 将凝胶放入容器中，加入去离子水（DI水）直至完全浸没凝胶。向水中加入10 µL EtBr，用铝箔包裹容器并置于摇床上，振荡染色30分钟。
    6. 将含EtBr的废液倒入通风橱内的废液瓶中。用去离子水冲洗凝胶一次，并将含EtBr的冲洗液倒入废液瓶中。
    7. 再次向容器中加入去离子水，直至完全浸没凝胶。用铝箔包裹容器并置于摇床上，振荡洗涤10分钟。
    8. 将含EtBr的洗涤液倒入通风橱内的废液瓶中。使用凝胶成像系统观察条带，并获取高分辨率的凝胶图像。

10. 凝胶纯化

  1. 在TAE缓冲液中制备3%琼脂糖凝胶。使用宽齿梳（厚度1 mm，宽度5 mm，深度15 mm）制备厚度为1 cm的凝胶，使每个加样孔至少可容纳25 µL样品-上样染料混合物。
  2. 将4 µL 6x上样染料与20 µL PCR产物（来自步骤9.5）混合，并将该混合物加入凝胶加样孔中。样品之间应留出空泳道，以减少凝胶切胶过程中的交叉污染。
  3. 加入DNA分子量标记物，进行凝胶电泳，染色并洗涤凝胶，随后按照步骤9.6所述方法拍摄凝胶图像。
  4. 切下含有目标大小范围内PCR产物的凝胶区域。为尽量减少引物二聚体（175 bp无插入片段的接头）的污染，仅提取长度大于195 bp的PCR产物（175 bp接头 + 20 bp miRNA）。
  5. 使用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化（参见材料表）。纯化步骤基于试剂盒制造商提供的说明书，并针对AQRNA-seq兼容性进行了轻微修改。除非另有说明，所有离心步骤均应在室温下使用台式离心机以17,900 x g离心1分钟。请按以下步骤操作：
    1. 测量凝胶块在离心管内的重量。按每1体积凝胶块加入6体积Buffer QG（试剂盒提供）的比例加入（1 mg凝胶约等于1 µL）。
    2. 在50 °C孵育10分钟，或直至凝胶块完全溶解。每2分钟涡旋振荡一次以促进溶解。凝胶完全溶解后，混合物颜色应与Buffer QG未溶解凝胶时的颜色一致。若溶液呈橙色或紫色，加入10 µL 3 M乙酸钠（pH = 5.0），并充分混匀。
    3. 向混合物中加入相当于凝胶体积的异丙醇，并充分混匀。将离心柱放入2 mL收集管中（试剂盒提供）。
    4. 为结合DNA，将样品（每次最多750 µL）加入离心柱中并离心。弃去穿流液，将离心柱放回同一收集管中。每个离心柱最多可处理400 mg凝胶。
    5. 向离心柱中加入500 µL Buffer QG，离心后弃去穿流液，将离心柱放回同一收集管中。
    6. 为洗涤杂质，向离心柱中加入750 µL Buffer PE（试剂盒提供），静置5分钟，然后离心。弃去穿流液，将离心柱放回同一收集管中。再次离心以去除残留的洗涤缓冲液。
    7. 将离心柱转移至无菌的1.5 mL离心管中。为洗脱DNA，向离心柱膜中心加入30 µL Buffer EB（试剂盒提供），静置4分钟，然后离心。
    8. 使用真空浓缩仪浓缩，并将凝胶纯化的PCR产物重悬于12 µL Buffer EB中。
  6. 通过紫外-可见分光光度法和/或荧光定量法测定构建文库的浓度。

11. 文库测序

  1. 将构建好的文库提交至外部测序中心进行质量评估和Illumina测序。为确保小RNA图谱定量分析的足够灵敏度，建议采用双端测序，每个方向读长为75 bp（即PE75），每个样本每个方向至少获得150万条原始测序读段。对于NextSeq测序，使用定制引物（表1），但在MiSeq平台上测序时此步骤可选。
    注意：测序可使用MiSeq或NextSeq500平台。平台的选择可能取决于样本性质及总样本数量。

12. 数据分析流程

注意：图2 以图示方式展示了数据分析流程的简化步骤，该流程以原始测序读段（FASTQ 格式）作为输入，生成一个丰度矩阵，其中行代表感兴趣的 small RNA 物种成员，列代表样本。对于双端测序，每个样本对应两个 FASTQ 文件，一个用于正向读段，另一个用于反向读段。完整的数据分析流程（包含所有相关脚本以及对每一步骤进行详细注释的手册）可在 GitHub 上获取（https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git）。

  1. 从外部测序中心获取原始序列读段，并使用开源程序（如 FastQC14 或 fastp15）评估测序质量。
  2. 创建 FASTA 格式的参考序列文库。
    注意：该分析流程能够适应多种小 RNA 类别的关键在于构建合适的参考序列文库。为准确估计特定 RNA 类别（例如 miRNA）成员的丰度，用户需精心整理一份适用于该流程的参考序列文库。除参考文库外，其余所有流程执行步骤在不同小 RNA 类别间保持一致。
  3. 创建名为 AQRNA-seq 的目录以部署数据分析流程，并将所有脚本、经过质量过滤的序列读段以及参考序列文库放入该目录中。请参照 GitHub 上的详细说明（https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git），设置子目录，并对文件进行必要的修改，以适配不同的生物体和/或小 RNA 种类，以及不同的操作系统和/或作业调度系统。
  4. 按照 GitHub 手册（https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git）中列出的步骤执行数据分析流程，手册中包含每一步的说明、输入与输出文件以及命令行指令。总体而言，该流程包括：(i) 从读段中切除接头序列和随机核苷酸，(ii) 根据读段长度进行过滤，(iii) 将读段比对至参考序列，(iv) 解决比对中的歧义映射问题，以及 (v) 生成丰度矩阵。

结果

处于指数生长期的Mycobacterium bovis BCG（卡介苗）1173P2菌株经历了时间序列（0、4、10 和 20 天）的营养饥饿处理，随后在营养丰富的培养基中复苏6天，实验方案如Hu等7先前所述。在五个指定的时间点，从细菌培养物中分离小RNA，并设置三个生物学重复。使用上述AQRNA-seq文库构建流程（图1）构建Illumina文库，随后在麻省理工学院生物微中心的测序仪上进行测序。测序数据随后通过定制的AQRNA-seq数据分析流程（图2）进行处理，用于tRNA丰度的定量分析。

使用测序引物对cDNA文库进行PCR扩增后，所有样品中均观察到大小为175个碱基对（bp）的PCR产物（图3A），提示形成了引物二聚体。为减少引物二聚体的残留，从凝胶中切下大于195 bp的PCR产物并进行纯化（图3B）。

经过质量过滤和修剪的测序读段被比对至一个自定义的参考序列文库，该文库包含45种tRNA同工受体、内参标准以及对照序列（即23S rRNA、16S rRNA、5S rRNA、rnpB和ssr）。在特定样本的总比对读段中，tRNA同工受体占比为10.5%至40.2%，其丰度显著高于对照序列（图4）。值得注意的是，tRNA同工受体相对较低的读段比例可归因于内参标准物的相对丰度较高。因此，操作者可通过精确调节加入反应体系的内参标准物的量，来控制tRNA同工受体相对于内参标准物的读段比例（图4，粉色与绿色色块对比）。

原始tRNA丰度数据使用DESeq2软件包版本（下文简称v）1.36.0中的比率中位数法进行标准化。16 在 R 统计编程环境（以下简称 R）v 4.2.1 中17标准化后，tRNA同工受体的定量图谱 Mycobacterium bovis 在营养饥饿及复苏的时间过程中实现 BCG 的研究（图5).

为了揭示基于tRNA同工受体丰度模式的不同表型样本的显著聚类，使用R语言中的stats包v 4.2.117对标准化的tRNA丰度数据进行了主成分分析（PCA）（图6）。该分析将饥饿第0天和复苏第6天的样本与饥饿第4、10和20天的样本区分开来，表明在营养缺乏培养基和营养丰富培养基中培养的Mycobacterium bovis BCG在tRNA图谱上存在显著差异。

为了分析每种tRNA同工受体在五个指定时间点的丰度动态变化，使用R语言中的DESeq2软件包（v 1.36.0）对标准化后的tRNA丰度数据进行了差异表达分析（图7）。分析结果显示，在20个同工受体家族中，有17个家族包含至少在一个时间点显著上调或下调的同工受体，表明tRNA库的调控可能在结核分枝杆菌卡介苗（Mycobacterium bovis BCG）的持续感染状态中发挥潜在作用。

RNA测序工作流程图；步骤：去磷酸化、连接、甲基化、逆转录、PCR。
图1：AQRNA-seq文库构建工作流程示意图。 工作流程中的关键步骤列于示意图中央，并通过虚线与各自对应的图示相连。每个步骤的详细说明见“实验方案”部分。 请点击此处查看该图的放大版本。

测序工作流程图：质量评估、剪切、过滤、比对、配对、解析。
图 2：AQRNA-seq 数据分析流程示意图。 流程中列出的关键步骤位于示意图中央，并通过虚线与各自对应的图形说明相连。各步骤的详细描述可在 GitHub 获取（https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git）。请点击此处查看该图的放大版本。

饥饿和复苏阶段DNA模式的凝胶电泳结果。
图3：使用测序引物进行PCR扩增后cDNA片段的琼脂糖凝胶电泳图。（A）凝胶提取和纯化前的凝胶图像。从左侧起第7和第14泳道含有5 µL的50 bp DNA标记物，其余泳道各含有20 µL的15个样品。PCR产物的大小定位显示其浓度最高的片段范围在175 bp（引物二聚体）至300 bp（两个引物+120 bp 5S rRNA）之间。（B）凝胶提取和纯化后的凝胶图像。对每个样品，切取200 bp至400 bp之间的凝胶区域，以尽量减少测序文库中引物二聚体的污染。请点击此处查看该图的放大版本。

饥饿和复苏不同天数下各样本累积读长数分析的柱状图。
图4：成功比对到参考序列文库的测序读长数量。 横轴显示按时间点（例如，饥饿第0天）分组的样本名称（例如，D18-69XX）。对于每个样本，与不同目标类别相关的读长数以堆叠的彩色块表示。位于彩色块中心的数字表示在给定样本中对应目标类别的读长所占比例。请点击此处查看该图的放大版本。

tRNA 丰度分析，柱状图；饥饿，复苏；教育研究工具。
图 5：Mycobacterium bovis BCG 在饥饿与复苏时间进程中的 tRNA 同工受体在不同时间点的定量图谱。原始 tRNA 丰度数据采用比值中位数法进行标准化。图中每一行表示在每个时间点三个生物学重复样本的标准化 tRNA 丰度（y 轴），以均值 ± 标准误差表示。x 轴上，来自同一家族的同工受体被归为一组，并以相应的氨基酸标注。请点击此处查看该图的放大版本。

显示细菌饥饿-复苏阶段的多维尺度分析图；数据聚类分析。
图 6：基于主成分分析（PCA）得到的样本的平方余弦图。 PCA 分析基于标准化的 tRNA 丰度进行。平方余弦值表示主成分对样本的重要性，样本按前两个主成分的平方余弦值进行绘制。样本使用样本编号标记，并按时间点进行颜色编码。请点击此处查看该图的放大版本。

氨基酸丰度比较；多条件图表；标准化读数计数；实验数据。
图 7：不同时间点tRNA同工受体的差异表达。 标准化的tRNA丰度以3次生物学重复的均值（线条结点）±标准误（误差线）表示。由于空间限制，实验条件缩写如下：S0-S20 = 饥饿第0-20天；R6 = 复苏第6天。对每个tRNA同工受体进行差异表达分析，使用似然比检验和Wald检验对不同时间点进行两两比较。采用紧凑字母法表示统计学显著性，即在同一tRNA同工受体中，若不同时间点共享至少一个相同字母，则它们之间的丰度差异不显著。例如，tRNA-Lys-CTT-1-1（赖氨酸面板中）的丰度从S0到S4以及从S4到S10均显著下调，但从S10到S20无显著变化；随后从S20到R6显著上调。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：AQRNA-seq文库构建流程中所用的寡核苷酸。 内参标准品为RNA，其余所有寡核苷酸均为DNA。所列的PCR引物和定制测序引物针对特定测序平台设计。可根据新的索引序列设计额外的PCR引物。 请点击此处下载该表格。

讨论

AQRNA-seq文库构建流程旨在最大限度地捕获样本中的RNA，并在逆转录过程中最小化聚合酶脱落7。通过两步连接接头的方法，将新型DNA寡核苷酸（接头1和接头2）过量连接至样本中的RNA，使其完全互补。过量的接头可通过RecJf（一种特异性作用于单链DNA的5'至3'外切核酸酶）高效去除，而连接产物则保持完整。此外，AlkB处理可减少RNA上的甲基化修饰18，这些修饰可能在逆转录过程中导致聚合酶脱落，从而缓解人为截短cDNA产物的问题。AQRNA-seq是首个被报道的系统性优化连接和扩增效率的方法。该方法已验证具有定量准确性且无偏倚性假象，在miRNA表达谱研究中被证明是最准确的技术应用。

AQRNA-seq 流程较为复杂，在文库构建过程中，对于温度和/或时间敏感的步骤，建议谨慎操作。具体而言，在 cDNA 合成之前的步骤（图1；步骤 1-4），由于样品中含有本身不稳定的单链 RNA（ssRNA）或已连接 DNA 接头的单链 RNA（DNA-linker-ligated ssRNA），应避免不必要的中断，连续操作为宜。使用强碱在高温条件下进行 RNA 水解（图1；步骤 6）在逆转录后降解 RNA 模板方面效率很高19。然而，需特别注意避免样品长时间暴露于强碱环境中，以及未能及时用强酸中和，尤其是在处理大量样品时。通常建议将所有反应体系在冰上配制，并避免文库中间产物经历反复冻融循环，这是 高度推荐的操作规范。

建议在实验流程的关键节点取样检测文库中间产物，以进行质量控制并及时排查问题。使用自动化电泳设备分析样品，可评估接头连接反应的成功率与效率（图1；步骤2和步骤7）。通过琼脂糖凝胶电泳观察在添加测序引物的PCR反应后索引化cDNA产物的定位情况（图1；步骤9），有助于评估PCR循环次数是否充分，并识别样品可能发生的降解和/或引物二聚体的存在。PCR引物和测序引物可重新设计，以适配操作者所使用的特定测序平台。

由于文库构建过程中涉及的独特设计，AQRNA-seq 数据分析流程主要由自定义脚本构成，仅少量采用了现有的生物信息学程序。然而，在将测序读段比对至参考序列文库时，采用了基本局部比对搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool, BLAST）20，因其具备多项优势，能够满足 AQRNA-seq 数据分析的特定需求。这些优势包括：(i) 能够比对短于 20 bp 的读段并执行子序列比对，(ii) 对模糊碱基（N）的合理处理能力，(iii) 略高的比对准确性，以及 (iv) 提供包含错配和空缺等丰富细节的 informative 输出结果，有利于多种下游分析。

值得注意的是，在AQRNA-seq的文库构建流程和数据分析流程中，仍存在若干设计挑战，需要进一步优化，这也是当前正在进行的工作重点。首先，AQRNA-seq相较于传统RNA-seq方法所实现的更优定量准确性，是在50–75 ng小RNA输入量下达成的；目前该流程正在使用更少的RNA输入量以提高其灵敏度，并尝试使用更长的RNA以拓展其应用范围。其次，尽管通过AlkB酶处理可去除转录后甲基化修饰，但仍存在其他可能在逆转录过程中导致聚合酶脱落的RNA修饰10。这可能导致产生人工截短的cDNA产物，难以有效区分其是源于逆转录过程中的技术假象，还是全长tRNA真实的生物学5'端降解。因此，目前正评估多种可能进一步提升逆转录酶持续合成能力的方法，以确定其在AQRNA-seq中的有效性与兼容性。第三，通过凝胶电泳提取和纯化去除引物二聚体的效率较低，不可避免地造成目标片段的损失，并增加文库间的变异度。因此，如何在不损失目标片段的前提下有效减少引物二聚体的残留，是进一步提升AQRNA-seq灵敏度和定量准确性的关键方向。尤为重要的是，AlkB处理以及凝胶提取与纯化步骤均耗时耗力，不利于大规模样本的处理。随着上述各方面的改进，未来有望实现AQRNA-seq方法的自动化和高通量操作。当前对数据分析流程的持续优化，重点在于提升效率、定量准确性与灵活性。尽管现有流程能有效从测序读段中切除3'接头序列，但部分读段仍含有5'接头序列，可能源于连接过程中对衔接子3'末端阻断不充分。5'接头序列的存在可能干扰测序读段的比对，从而影响定量准确性。因此，将引入如Cutadapt等额外的接头切除工具，以确保对3'和5'接头序列的充分去除21。为提升分析效率，改进后的流程将整合合理策略以减少计算时间，包括通过识别显著重叠区域将成对末端读段进行拼接，并提取每个文库中唯一的序列及其出现频次。这些策略有望显著减少下游计算时间，避免对（i）来自正反方向的重复读段和（ii）可能在AQRNA-seq文库测序读段池中占主导地位的重复序列进行冗余分析。展望未来，AQRNA-seq文库构建流程与数据分析流程的协同优化，有望为各类RNA（如转录组、tRNA片段以及循环肿瘤RNA等稀有RNA种类）的严格定量研究、tRNA修饰图谱绘制，以及其他生物标志物发现和发现生物学关键领域开辟广泛的应用前景。

披露

P.C.D. 是两项专利（PCT/US2019/013714，US 2019/0284624 A1）的发明人，这些专利与已发表的研究工作相关。

致谢

本研究的作者们感谢此前描述 AQRNA-seq 技术的原始论文的作者7。本工作获得了美国国立卫生研究院（ES002109、AG063341、ES031576、ES031529、ES026856）以及通过新加坡-麻省理工学院科研与技术联盟抗菌素耐药性独立研究组资助的新加坡国家研究基金会拨款的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-酮戊二酸 Sigma-Aldrich75890配制工作液（1 M），并于 -20 ℃ 保存ºC
2100 生物分析仪安捷伦G2938C
三磷酸腺苷（ATP） New England BiolabsM0437M（组分编号：N0437AVIAL）NEB M0437M 含有 T4 RNA 连接酶 1（30 U/μL）、T4 RNA连接酶反应缓冲液（10X）、PEG 8000（1X）和ATP（100 mM）；配制工作液（10 mM）并于-20℃保存ºC
琼脂糖 GPG/LEAmericanBioAB00972-00500室温保存
六水合硫酸亚铁铵Sigma-AldrichF2262配制工作液（0.25 M），并于 -20 ℃ 保存 °C
小RNA分析生物分析仪安捷伦5067-1548 小RNA分析用于检测输入RNA的质量以及酶促反应的效率（例如接头1连接反应）
牛血清白蛋白（BSA；10 mg/mL） New England BiolabsB9000该产品已于2022年12月15日停产，由重组白蛋白（分子生物学级，NEB B9200）替代。
氯仿 Macron Fine Chemicals4441-10
去甲基化酶 ArrayStarAS-FS-004去甲基化酶随 rtStar tRNA 预处理提供 & 第一链 cDNA 合成试剂盒 (AS-FS-004)
脱氧核苷酸（dNTP）溶液混合物New England BiolabsN0447L（组分编号：N0447LVIAL）该dNTP溶液混合物含有等摩尔浓度的dATP、dCTP、dGTP和dTTP（每种10 mM）
数字双加热模块VWR 科学产品13259-052加热块与QIAquick配合使用 凝胶回收试剂盒 
DyeEx 2.0 离心柱纯化试剂盒 Qiagen63204 可有效去除短片段残留物（例如，长度小于10 bp的寡核苷酸）
电泳电源伯乐实验室PowerPac 300
Eppendorf PCR管（0.5 mL）Eppendorf0030124537
Eppendorf Safe-Lock 离心管（0.5 mL）Eppendorf022363611
Eppendorf Safe-Lock 离心管（1.5 mL）Eppendorf022363204
Eppendorf Safe-Lock 管（2 mL）Eppendorf022363352
乙醇（纯）Sigma-AldrichE7023 使用Zymo Research公司的Oligo Clean and Concentrator试剂盒时，需采用纯乙醇
凝胶成像系统Alpha InnotechFluorChem 8900
上样缓冲液，紫色（6×），不含SDSNew England BiolabsN0556S（组分编号：B7025SVIAL）NEB N0556S 包含 Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder 和上样染料，紫色（6×），不含 SDS
GENESYS 180 紫外-可见分光光度计赛默飞世尔科技840-309000分光光度计用于根据比尔定律测定寡核苷酸浓度
HEPESSigma-AldrichH4034配制工作液（1 M；用 NaOH 调节 pH 至 8），并于 -20 ℃ 保存 °C
盐酸（HCl） VWR 科学产品BDH3028 配制工作液（5 M），并于室温下保存
异丙醇（异丙醇），纯品Macron Fine Chemicals3032-16异丙醇与QIAquick一起使用 凝胶回收试剂盒 
L-抗坏血酸Sigma-AldrichA5960配制工作液（0.5 M），并于 -20 ℃ 保存ºC
微型离心机Eppendorf5415D
NanoDrop 2000 分光光度计赛默飞世尔科技ND-2000
NEBuffer 2 (10X)New England BiolabsM0264L（组分编号：B7002SVIAL）NEB M0264L 含有 RecJf（30 U/μL）μL）和 NEBuffer 2（10X）；于 -20 保存 °C
无核酸酶水（非DEPC处理）赛默飞世尔科技AM9938 
Oligo Clean & 浓缩试剂盒 Zymo ResearchD4061 室温保存
PEG 8000（50% 溶液） New England BiolabsM0437M（组分编号：B1004SVIAL）NEB M0437M 含有 T4 RNA 连接酶 1（30 U/μL）、T4 RNA连接酶反应缓冲液（10X）、PEG 8000（1X）和ATP（100 mM）；配制工作液（10 mM）并于-20℃保存ºC
珀尔帖热循环仪MJ ResearchPTC-200
苯酚：氯仿：异戊醇 乙醇 25:24:1 pH = 5.2 赛默飞世尔科技J62336 
PrimeScript缓冲液（5X）TaKaRa2680A 
PrimeScript 逆转录酶TaKaRa2680A 
QIAquick 凝胶回收试剂盒 Qiagen28704该试剂盒需要使用加热块和异丙醇
Quick-Load Purple 100 bp DNA LadderNew England BiolabsN0551S（组分编号：N0551SVIAL）
Quick-Load Purple 50 bp DNA LadderNew England BiolabsN0556S（组分编号：N0556SVIAL）NEB N0556S 包含 Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder 和 Gel Loading Dye, Purple (6X)，不含 SDS
RecJf (30 U/μL 新英格兰生物实验室M0264L（组分编号：M0264LVIAL）NEB M0264L 含有 RecJf（30 U/μL）μL）和 NEBuffer 2（10X）；于 -20 保存 °C
RNase抑制剂（小鼠来源；40 U/μL）μL New England BiolabsM0314L （组分编号：M0314LVIAL）-20℃保存 °C
SeqAMP DNA聚合酶 TaKaRa638509 TaKaRa 638509 含有 SeqAMP DNA聚合酶 和 SeqAMP PCR缓冲液（2X）
SeqAMP PCR缓冲液（2X） TaKaRa638509 TaKaRa 638509 含有 SeqAMP DNA聚合酶 和 SeqAMP PCR缓冲液（2X）
虾碱性磷酸酶（1 U/μL) 新英格兰生物实验室M0371L （组分编号：M0371LVIAL）
氢氧化钠（NaOH）Sigma-Aldrich S5881配制工作液（5 M），并在室温下保存
T4 DNA连接酶（400 U/μL 新英格兰生物实验室M0202L （组分编号：M0202LVIAL）NEB M0202L 含有 T4 DNA 连接酶（400 U/μL）和 T4 DNA 连接酶反应缓冲液（10X）
T4 DNA连接酶反应缓冲液（10X） New England BiolabsM0202L （组分编号：B0202SVIAL）NEB M0202L 含有 T4 DNA 连接酶（400 U/μL）和 T4 DNA 连接酶反应缓冲液（10X）
T4 RNA连接酶1（30 U/μL New England BiolabsM0437M（组分编号：M0437MVIAL）NEB M0437M 含有 T4 RNA 连接酶 1（30 U/μL）、T4 RNA连接酶反应缓冲液（10X）、PEG 8000（1X）和ATP（100 mM）
T4 RNA连接酶反应缓冲液（10X） New England BiolabsM0437M（组分编号：B0216SVIAL）NEB M0437M 含有 T4 RNA 连接酶 1（30 U/μL）、T4 RNA连接酶反应缓冲液（10×）、PEG 8000（1×）和ATP（100 mM）

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