方法文章

用于定量小 RNA 的 AQRNA-seq

DOI：

10.3791/66335

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2024年2月2日

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1Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Singapore-MIT Alliance for Research and Technology Antimicrobial Resistance Interdisciplinary Research Group

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

绝对定量 RNA 测序 （AQRNA-seq） 是一种用于定量生物混合物中所有小 RNA 景观的技术。在这里，展示了 AQRNA-seq 的文库制备和数据处理步骤，量化了饥饿诱导休眠期间 牛分枝杆菌 BCG 中转移 RNA （tRNA） 库的变化。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AQRNA-seq 在生物样品中的测序读长计数和小 RNA 拷贝数之间提供直接的线性关系，从而能够准确定量小 RNA 库。此处描述的 AQRNA-seq 文库制备程序涉及使用定制设计的测序接头和减少甲基化 RNA 修饰的步骤，这些修饰会阻断逆转录持续合成能力，从而增加全长 cDNA 的产量。此外，还介绍了随附的生物信息学管道的详细实施。AQRNA-seq 的演示是通过对牛 分枝杆菌 BCG 中的 45 个 tRNA 进行定量分析来进行的，这些 tRNA 是在 20 天的营养剥夺和 6 天的复苏过程中在 5 天的选定时间内收获的。本文还将讨论为提高 AQRNA-seq 的效率和严谨性而做出的持续努力。这包括探索避免凝胶纯化以减轻 PCR 扩增后引物二聚体问题的方法，以及增加全长读长的比例以实现更准确的读长映射。AQRNA-seq 的未来增强功能将侧重于促进该技术的自动化和高通量实施，以量化来自不同生物体的细胞和组织样本中的所有小 RNA。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

下一代测序 （NGS），也称为大规模平行测序，是一种 DNA 测序技术，涉及 DNA 片段化、接头寡核苷酸连接、基于聚合酶链反应 （PCR） 的扩增、DNA 测序以及将片段序列重组到基因组中。NGS 对 RNA 测序的适应 （RNA-seq） 是鉴定和定量 RNA 转录本及其变体的有力方法1。RNA 文库制备工作流程和生物信息学分析管道的创新发展，加上实验室仪器的进步，扩展了 RNA-seq 的应用范围，从外显子组测序发展到高级功能组学，如非编码 RNA 分析2、单细胞分析3、空间转录组学 4,5、选择性剪接分析6等。这些先进的 RNA-seq 方法通过定量分析正常和患病细胞和组织中的转录组来揭示复杂的 RNA 功能。

尽管 RNA-seq 取得了这些进展，但几个关键技术特征限制了该方法的定量能力。虽然大多数 RNA-seq 方法允许精确定量实验变量（即生物样品和/或生理状态）之间 RNA 水平的变化，但它们无法提供样品中 RNA 分子水平的定量比较。例如，大多数 RNA-seq 方法无法准确量化表达的 tRNA 细胞库中单个 tRNA 同受体分子的相对拷贝数。正如配套出版物7 中所强调的那样，RNA-seq 的这种限制源于 RNA 结构的几个特征和文库制备的生物化学。例如，用于将 3'-和 5'-末端测序接头连接到 RNA 分子的连接酶的活性受 RNA 末端核苷酸和测序接头身份的强烈影响。这导致接头连接效率的巨大变化和测序读长的显著人为增加 8,9,10。

第二组限制来自 RNA 分子的固有结构特性。具体来说，表观转录组的数十种转录后 RNA 修饰中的 RNA 二级结构形成和动态变化会导致逆转录过程中聚合酶脱落或突变。这些错误会导致 cDNA 合成不完整或截短或 RNA 序列改变。虽然这两种现象都可用于绘制二级结构或一些修饰，但如果后续文库制备步骤无法捕获截短的 cDNA，或者数据处理丢弃与参考数据集不匹配的突变序列，它们会降低 RNA-seq 的定量准确性11,12。此外，RNA 转录本的巨大化学、长度和结构多样性，以及缺乏均匀片段化长 RNA 的工具，降低了大多数 RNA-seq 方法对所有 RNA 种类的适用性13。

AQRNA-seq（绝对定量 RNA 测序）方法的开发是为了消除限制定量准确性的几个技术和生物学限制7。通过在 RNA 测序文库制备过程中最大限度地减少捕获、连接和扩增中的序列依赖性偏差，AQRNA-seq 实现了与其他方法相比的卓越线性，以 2 倍的准确度准确定量了 963 个 miRNA 参考文库的 75%。测序读长计数和 RNA 丰度的这种线性相关性也存在于对可变长度 RNA 寡核苷酸标准品库的分析中，以及参考 Northern 印迹等正交方法。建立测序读长计数和 RNA 丰度之间的线性使 AQRNA-seq 能够对样品中的所有 RNA 种类进行准确、绝对的定量。

以下是 AQRNA-seq 文库制备工作流程的协议和随附的下游数据分析管道的描述。该方法用于阐明牛分 枝杆菌 卡介苗 （BCG） 结核病模型中饥饿诱导休眠和随后复苏期间 tRNA 丰度的动力学。结果用于测序数据的探索性可视化，以及随后的聚类和差异表达分析，揭示了与各种表型相关的 tRNA 丰度的可识别模式。

方案

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注意: 图 1 提供了 AQRNA-seq 文库制备所涉及的程序的图形说明。有关程序中使用的试剂、化学品和色谱柱/试剂盒的详细信息，请参阅 材料表。建议使用 （i） 3% 琼脂糖凝胶电泳，（ii） 用于生物分子样品质量控制的自动电泳工具（参见 材料表），以及 （iii） 紫外-可见分光光度法和/或荧光定量法，对输入 RNA 样品的纯度、完整性和数量进行全面评估。除非另有说明，否则所有反应物和预混液都必须放在冰上。将冷藏箱中的试剂（例如酶）运输到 -20 °C 储存和从 -20 °C 储存，以延长其保质期并避免文库中间体的多次冻融循环。

1. RNA 的去磷酸化

注:去除 5'-磷酸盐（P;供体）会阻止与 RNA 的 3'-羟基（OH;受体）自连接。接头不会自连接，因为它们的 3' 末端被修饰为掺入二脱氧胞苷 （Linker 1） 或间隔区 （Linker 2）。接头只能通过将其 5'-P 连接到 RNA 或 cDNA 的 3'-OH 来连接。

  1. 在无菌 PCR 管（例如，200 μL 或 500 μL 管）中制备去磷酸化反应，添加多达 2 μL RNA 样品、0.5 μL 40 U/μL RNase 抑制剂、1 μL 0.5 μL 0.5 μL 10x T4 RNA 连接酶反应缓冲液、1 μL 1 U/μL 虾碱性磷酸酶， 以及足够的不含 RNase 的水，使总体积达到 5 μL。
    注:对于典型样品，75 ng RNA（或 80 nt RNA 约为 2 pmol）被认为足以使用此方案定量小 RNA。
  2. 在 37 °C 下孵育 30 分钟以使 RNA 去磷酸化，然后在 65 °C 下孵育 5 分钟以灭活酶并使 RNA 变性。将样品在 4 °C 下保存至少 10 分钟以防止复性。

2. 接头 1 与 RNA 的 3' 端连接

  1. 在无菌 PCR 管中加入 5 μL 去磷酸化 RNA（步骤 1 中的产物）、0.5 μL 40 U/μL RNase 抑制剂、1 μL 100 μM 接头 1（表 1）、3 μL 10 mM ATP、2.5 μL 10x T4 RNA 连接酶反应缓冲液、15 μL PEG8000（50% 溶液）、 2 μL 30 U/μL T4 RNA 连接酶 1 和 1 μL 不含 RNase 的水。
    注:试剂可以制成预混液，以便于处理样品。不要在预混液中加入 PEG8000 和 T4 RNA 连接酶 1。
  2. 在 25 °C 下孵育 2 小时，然后在 16 °C 下孵育 16 小时，以将 Linker 1 连接到 RNA 上。
  3. 柱纯化 Linker-1 连接的 RNA。使用试剂盒进行 DNA/RNA 回收和纯化（参见 材料表）。
    注:该色谱柱纯化方案适用于使用同一试剂盒的所有后续色谱柱纯化。使用凝胶过滤技术从测序反应中去除染料终止子的试剂盒（参见 材料表）不能在此处使用，因为PEG8000与此类试剂盒的凝胶过滤器不兼容。建议在纯化后为每个样品保存一份等分试样 （1.2 μL）。必要时，这些等分试样可用于通过运行市售核酸分析仪来检查连接效率。将剩余的纯化样品保存在冰上或 -20 °C 直至进一步的步骤。
    1. 对于< 50 μL 的样品体积，添加不含 RNase 的水，使其达到 50 μL。将 2 体积的寡核苷酸结合缓冲液（试剂盒中提供）添加到 1 体积的样品中。向 1 体积的样品中加入 8 体积的 100% 乙醇。
    2. 将样品（一次最多 750 μL）上样到放置在 2 mL 收集管（试剂盒中提供）内的色谱柱中。要将 RNA 结合到色谱柱上，以 10,000 x g 离心 30 秒，然后弃去流出物（即收集管中的液体）。将色谱柱放回收集管中。
    3. 要洗去色谱柱上的杂质，向色谱柱中加入 750 μL DNA 洗涤缓冲液（试剂盒中提供）。以 10,000 x g 离心 30 秒并丢弃流出物。将色谱柱放回收集管中。
    4. 以最大速度离心（例如，台式微量离心机为 16,000 x g ）再离心 1 分钟，以去除残留的 DNA 洗涤缓冲液。
    5. 要洗脱 RNA，请小心地将色谱柱移至无菌 1.5 mL 试管中，向色谱柱中加入不含 RNase 的水。洗脱 RNA 时使用比所需体积更大的体积，以解决洗脱过程中可能出现的体积损失。例如，如果后续步骤需要 15 μL，则加入 17 μL 不含 RNase 的水进行洗脱。以 10,000 x g 离心 30 秒。

3. 通过 AlkB 去甲基化酶去除转录后甲基化

注:AlkB 是一种细菌酶，可从 DNA 和 RNA 中的一些（但不是全部）甲基化核苷酸中去除甲基。去除 RNA 中的几种类型的甲基化核糖核苷酸可防止逆转录酶脱落，从而允许更全长的读长和修饰位点的鉴定。此步骤需要在低 pH 值下进行控制，以防止 RNA 意外降解。

  1. 通过将 1.4611 g 2-酮戊二酸（146.11 g/M）溶解在 10 mL 不含 RNase 的水中，制备 1 M 2-酮戊二酸的储备溶液。过滤器通过 0.2 μm 注射器过滤器对溶液进行消毒。将储备液分装到 2 mL 无菌管中，并在 -20 °C 下储存。
  2. 通过将 0.88 g L-抗坏血酸（176.12 g/M）溶解在 10 mL 不含 RNase 的水中，制备 0.5 M L-抗坏血酸的储备液。过滤器通过 0.2 μm 注射器过滤器对溶液进行消毒。将储备液分装到 2 mL 无菌管中，并在 -20 °C 下储存。
  3. 将 0.9835 g 硫酸亚铁六水合物铵（392.14 g/M）溶解在 10 mL 不含 RNase 的水中，制备 0.25 M 硫酸亚铁六水合物储备液。过滤器通过 0.2 μm 注射器过滤器对溶液进行消毒。将储备液分装到 2 mL 无菌管中，并在 -20 °C 下储存。
  4. 通过将 2.383 g HEPES（238.30 g/M）溶解在 10 mL 不含 RNase 的水中，制备 1 M HEPES 的储备溶液。使用 NaOH 将溶液的 pH 值调节至 8，并通过 0.2 μm 注射器过滤器对溶液进行过滤消毒。将储备液分装到 2 mL 无菌管中，并在 -20 °C 下储存。
  5. 准备 2x AlkB 反应缓冲液。要制备 10 mL 缓冲液，请混合 1.5 μL 1 M 2-酮戊二酸（在步骤 3.1 中制备）、80 μL 0.5 M L-抗坏血酸（在步骤 3.2 中制备）、6 μL 0.25 M 硫酸亚铁铵六水合物（在步骤 3.3 中制备）、100 μL 10 mg/mL BSA、1000 μL 1 M HEPES（在步骤 3.4 中制备;最后添加）， 和 8812.5 μL 不含 RNase 的水。过滤器通过 0.2 μm 注射器过滤器对缓冲液进行灭菌。
    注:由于组分的化学不稳定性，2x AlkB 反应缓冲液必须在每次实验前立即新鲜制备。
  6. 通过添加 20 μL 接头-1 连接的 RNA（步骤 2 中的产物）、50 μL 的 2x AlkB 反应缓冲液（在步骤 3.5 中制备）、2 μL AlkB 去甲基化酶、1 μL RNase 抑制剂和 27 μL 不含 RNase 的水，在无菌 PCR 管中制备 AlkB 消化反应。
  7. 在室温下孵育 2 小时以从 RNA 中去除转录后甲基化。
  8. 要从反应中去除 AlkB，请按照以下步骤操作。
    1. 为了实现清洁相分离，向 AlkB 反应中加入 50 μL 不含 RNase 的水，然后加入 100 μL 苯酚:氯仿:异戊醇 25:24:1 （pH = 5.2）。
    2. 用手摇动 10 秒，然后以 16,000 x g 离心 10 分钟。确保台式离心机的转子与 PCR 管兼容。如果需要，请使用适配器。
    3. 将 RNA（即顶部的水层;约 140 μL）转移到无菌的 1.5 mL 试管中。如果将氯仿（即底层）混合到水层中，请使用相同的设置再次离心。
    4. 向提取的 RNA 中加入 100 μL 氯仿以去除残留的苯酚。用手摇动 10 秒，然后以 16,000 x g 离心 10 分钟。
    5. 将 RNA（即顶部的水层;约 120 μL）转移到无菌的 1.5 mL 试管中。
  9. 对提取的 RNA 进行柱纯化。使用试剂盒进行 DNA/RNA 回收和纯化（参见 材料表）。按照步骤 2.3 中详述的方案进行色谱柱纯化。

4. 去除多余的 Linker 1

注:建议在纯化后为每个样品保存一份等分试样 （1.2 μL）。必要时，这些等分试样可用于通过运行市售核酸分析仪来检查 RecJf 酶解的效率。立即对纯化的样品进行逆转录。

  1. 通过添加 15 μL Linker-1 连接的 RNA（步骤 3 中的产物）、1 μL 40 U/μL RNase 抑制剂、2 μL 10x 试剂盒缓冲液 2（参见 材料表）和 2 μL 50 U/μL 5'-脱基酶，在无菌 PCR 管中制备脱腺苷化反应。
  2. 在 30 °C 下孵育 1 小时以去除接头 1 5' 末端的腺嘌呤。向脱腺苷化反应中加入 2 μL 30 U/μL RecJf。
  3. 在 37 °C 下孵育 30 分钟以消化过量的 Linker 1。向反应中再加入 2 μL 30 U/μL RecJf。
  4. 在 37 °C 下孵育 30 分钟以继续消化过量的接头 1，然后在 65 °C 下孵育 20 分钟以使酶变性。
  5. 柱纯化 Linker-1 连接的 RNA。使用使用凝胶过滤技术的试剂盒从测序反应中去除染料终止子（参见 材料表），因为它可以有效去除短残基（例如，长度为 2 至 10 bp 的寡核苷酸）。请按照下面描述的步骤进行纯化。
    1. 根据制造商的方案准备凝胶过滤柱。将色谱柱放入无菌 1.5 mL 试管中，并在色谱柱中加入 24 μL 样品。
    2. 要纯化 RNA，请以 800 x g 离心 3 分钟，然后弃去色谱柱。纯化的 RNA 位于洗脱液中。

5. 逆转录 （RT） 反应

注:以下 RT（参见 材料表）反应设置遵循制造商的方案，稍作修改以允许 AQRNA-seq 兼容性。

  1. 通过添加 24 μL 模板 RNA（步骤 4 中的产物）、1 μL 2 μM RT 引物（表 1）和 1 μL dNTP（每种核苷酸 10 mM），在无菌 PCR 管中制备 RT 引物退火反应。
  2. 在 80 °C 下孵育 2 分钟，使 RT 引物与模板 RNA 退火，然后立即在冰上冷却 2 分钟。
  3. 通过向退火反应管中加入 6 μL 5x RT 反应缓冲液、1 μL 40 U/μL RNase 抑制剂和 1 μL 逆转录酶来制备 RT 反应。
  4. 在 50 °C 下孵育 2 小时以逆转录 RNA 模板，然后在 70 °C 下孵育 15 分钟以灭活酶。RT 产物（即 RNA-cDNA 杂交体）可以在 4 °C 或 -20 °C 下储存过夜。

6. RNA 水解

  1. 将 1 μL 的 5 M NaOH 添加到 RNA-cDNA 杂交体中（步骤 5 中的产物）。在 93 °C 下孵育 3 分钟以水解 RNA-cDNA 杂交体的 RNA 链。
  2. 加入 0.77 μL 5 M HCl 以中和反应。加入 HCl 后，轻弹混合，然后向下旋转试管。中和是瞬间的。
    注:建议在缓冲条件下测试中和 1 μL NaOH（例如，使用 pH 试纸条）所需的 5 M HCl 的精确量。
  3. 对单链 cDNA 进行柱纯化。使用试剂盒进行 DNA/RNA 回收和纯化（参见 材料表）。按照步骤 2.3 中详述的方案进行色谱柱纯化。
    注:由于前面步骤中的 pH 值变化，使用凝胶过滤技术从测序反应中去除染料终止子的试剂盒（参见 材料表）不能在此处使用。
  4. 将纯化的 cDNA 快速真空至 <5 μL，然后加入不含 RNase 的水，使体积恢复到 5 μL。小心不要快速真空 cDNA 以完全干燥。
  5. 将纯化的 cDNA 转移到无菌 PCR 管中。纯化的 cDNA 可在 -20 °C 下储存长达 1 周。

7. 连接子 2 连接到 cDNA 的 3' 端

  1. 通过添加 5 μL cDNA（步骤 6 中的产物）、1 μL 50 μM Linker 2（表 1）、2 μL 10x T4 DNA 连接酶反应缓冲液、1 μL 10 mM ATP、9 μL PEG8000（50% 溶液）和 2 μL 400 U/μL T4 DNA 连接酶，在无菌 PCR 管中制备 Linker 2 连接反应。
    注:试剂可以制成预混液，以促进样品的处理。不要在预混液中加入 PEG8000 DNA 和 T4 DNA 连接酶。
  2. 在 16 °C 下孵育 16 小时，以将 Linker 2 连接到 cDNA 上。
  3. 柱纯化 Linker-2 连接的 cDNA。使用试剂盒进行 DNA/RNA 回收和纯化（参见 材料表）。按照步骤 2.3 中详述的方案进行色谱柱纯化。

8. 去除多余的 Linker 2

  1. 通过添加 16 μL Linker-2 连接的 cDNA、2 μL 10x 试剂盒缓冲液 2 和 2 μL 50 U/μL 5'-脱腺苷酶，在无菌 PCR 管中制备脱腺苷化反应。在 30 °C 下孵育 1 小时以去除接头 2 5' 末端的腺嘌呤。
  2. 向脱腺苷化反应中加入 2 μL 30 U/μL RecJf。在 37 °C 下孵育 30 分钟以消化过量的 Linker 2。向反应中再加入 2 μL 30 U/μL RecJf。
  3. 在 37 °C 下孵育 30 分钟以继续消化过量的 Linker 2，然后在 65 °C 下孵育 20 分钟以使酶变性。

9. 使用测序引物对 cDNA 进行 PCR 扩增

  1. 将 PCR 引物分配给样品。每个样品都需要正向和反向引物的独特组合（表 1）才能进行有效的多重检测。
  2. 加入不含 RNase 的水，使样品体积达到 25 μL。将每个样品的 5 μL 保存到无菌 PCR 管中，以备不时之需。
  3. 通过添加 20 μL cDNA（步骤 8 中的产物）、1 μL 2.5 μM 正向引物、1 μL 2.5 μM 反向引物、25 μL 2x DNA 聚合酶缓冲液、2 μL 不含 RNase 的水和 1 μL DNA 聚合酶来制备 PCR 反应（参见 PCR 试剂盒 材料表 ）。
    注:试剂可以制成预混液，以促进样品的处理。不要将 DNA 聚合酶添加到预混液中。
  4. 进行 PCR，在 94 °C 下初始变性 1 分钟，然后在 98 °C 下进行 18 个变性循环 20 秒 - 在 58 °C 下退火 20 秒 - 在 68 °C 下延伸 1 分钟。
    注:请勿在线性范围之外进行 PCR 扩增。对于大多数实验来说，总共 18 个循环是最佳的，但这可能取决于上下文。
  5. 将 PCR 产物快速真空至 25 μL 以下，然后加入不含 RNase 的水，使体积恢复到 25 μL。将 5 μL PCR 产物转移到无菌的 0.5 mL 试管中，以检查尺寸分布（参见步骤 9.6）。将剩余的 20 μL PCR 产物储存在 -20 °C 直至进一步的步骤。
  6. 如下所述检查 PCR 产物的大小分布。
    1. 在 TAE 缓冲液中制备 3% 琼脂糖凝胶。
      注意:在本方案中，溴化乙锭 （EtBr） 用于电泳后凝胶染色（参见步骤 9.6.5）。在此步骤中，可以将适当的 DNA 染料添加到凝胶溶液中，或稍后用于凝胶染色。
    2. 将 1 μL 的 6x 上样染料混合到 5 μL 的 PCR 产物中（来自步骤 9.5），并将混合物加载到凝胶中。
    3. 将 5 μL DNA 分子量标准加载到第一个样品之前和最后一个样品之后的孔中。使用 50 bp 或 100 bp DNA 分子量标准可以提高 150 bp 和 300 bp 之间 PCR 产物的大小鉴别能力。
    4. 运行凝胶电泳以定位 PCR 产物。适当的运行条件可能取决于上下文。在这里，在 120 V、400 mA 下运行 75 分钟，以获得 17.78 cm（宽）x 10.16 cm（高）x 1 cm（厚）凝胶板。
    5. 将凝胶放入盒子中，并在盒子中加入去离子 （DI） 水，直到凝胶完全浸没。将 10 μL EtBr 加入去离子水中，浸泡凝胶。用箔纸包住盒子，然后将其放在摇摇器上。摇动时对凝胶染色 30 分钟。
    6. 将含有 EtBr 的废物丢弃到放置在通风橱中的废液瓶中。用去离子水冲洗凝胶一次，然后将含有 EtBr 的水倒入废液瓶中。
    7. 用去离子水填充盒子，直到凝胶完全浸入。用箔纸包住盒子，然后将其放在摇摇器上。摇动时洗涤凝胶 10 分钟。
    8. 将含 EtBr 的水倒入通风橱中的废液瓶中。使用凝胶成像仪可视化条带。获取凝胶的高分辨率图像。

10. 凝胶纯化

  1. 在 TAE 缓冲液中制备 3% 琼脂糖凝胶。用宽梳子（1 mm 厚;5 mm 宽;15 mm 深）制备 1 cm 厚的凝胶，使每个孔至少可包含 25 μL 的样品加载染料混合物。
  2. 将 4 μL 的 6x 上样染料与 20 μL 的 PCR 产物（来自步骤 9.5）混合，并将混合物加载到凝胶中。在样品之间留出空泳道，以尽量减少凝胶切除过程中的交叉污染。
  3. 加载 DNA 分子量标准，运行凝胶电泳，染色和洗涤凝胶，并按照步骤 9.6 中的说明拍摄凝胶图像。
  4. 切除含有目标大小范围内的 PCR 产物的凝胶块。为了尽量减少引物二聚体（175 bp 接头，无插入片段）的污染，提取大小超过 195 bp 的 PCR 产物（175 bp 接头 + 20 bp miRNA）。
  5. 使用凝胶提取纯化 PCR 产物。使用凝胶提取试剂盒（参见 材料表）。纯化方案基于制造商的方案，对 AQRNA-seq 兼容性进行了细微修改。除非另有说明，否则所有离心步骤应在室温下使用台式离心机以 17,900 x g 的速度进行 1 分钟。请按照以下步骤操作。
    1. 测量管内凝胶块的重量。将 6 体积的缓冲液 QG（试剂盒中提供）添加到 1 体积的凝胶块中（1 mg 凝胶约为 1 μL）。
    2. 在 50 °C 下孵育 10 分钟或直到凝胶块完全溶解。每 2 分钟涡旋试管以促进凝胶溶解。溶解凝胶后，混合物应类似于没有溶解凝胶的缓冲液 QG 的颜色。如果颜色为橙色或紫色，则加入 10 μL 3 M 乙酸钠 （pH = 5.0） 并充分混合。
    3. 向混合物中加入 1 凝胶体积的异丙醇并充分混合。将离心柱放入 2 mL 收集管（试剂盒中提供）中。
    4. 要结合 DNA，请将样品（每次最多 750 μL）上样到色谱柱上并离心。弃去流通液，将色谱柱放回同一收集管中。每个离心柱的最大凝胶量为 400 mg。
    5. 向色谱柱中加入 500 μL 缓冲液 QG 并离心。弃去流通液，将色谱柱放回同一收集管中。
    6. 要洗涤杂质，向色谱柱中加入 750 μL 缓冲液 PE（试剂盒中提供），让色谱柱静置 5 分钟，然后离心。弃去流通液，将色谱柱放回同一收集管中。再次离心以去除残留的洗涤缓冲液。
    7. 将色谱柱放入无菌 1.5 mL 试管中。要洗脱 DNA，在柱膜中心加入 30 μL 缓冲液 EB（试剂盒中提供），让柱静置 4 分钟，然后离心。
    8. Speed-vac 并将凝胶纯化的 PCR 产物重悬于 12 μL 缓冲液 EB 中。
  6. 通过 UV-可见分光光度法和/或荧光定量法测量构建的文库的浓度。

11. 文库测序

  1. 将构建的文库提交给外部测序中心进行质量评估和 Illumina 测序。为确保小 RNA 景观定量映射的足够灵敏度，选择从每个方向（即 PE75）具有 75 bp 读数的双端测序，目标是每个样品在每个方向上至少有 1.5 M 原始序列读数。使用定制引物（表 1）进行 NextSeq 测序，但对于 MiSeq 测序，这是可选的。
    注:可以使用 MiSeq 或 NextSeq500 平台进行测序。平台的选择可能取决于样品的性质和总样品计数。

12. 数据分析管道

注意: 图 2 提供了数据分析管道中涉及的简化程序的图形说明，该流程以原始序列读数（FASTQ 格式）作为输入并生成一个丰度矩阵，其中行代表感兴趣的小 RNA 物种的成员，列代表样品。对于双端测序，每个样本对应于两个 FASTQ 文件，一个用于正向读取，另一个用于反向读取。GitHub （https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git） 上提供了完整的数据分析管道，其中包含所有相关脚本和带有每个步骤大量注释的手册。

  1. 从外部测序中心检索原始序列读数，并使用 FastQC14 或 fastp15 等开源程序评估测序质量。
  2. 以 FASTA 格式创建参考序列库。
    注:该管道对各种小 RNA 类别适应性的关键是合适的参考序列库。为了实现特定目标 RNA 类别（例如 miRNA）成员的准确丰度估计，用户需要精心策划一个用于管道的参考序列库。用于管道执行的所有其他指令在不同的小 RNA 类别中保持一致。
  3. 创建一个名为 AQRNA-seq 的目录，用于实施数据分析管道，并将所有脚本、质量过滤序列读取和参考序列库放入此目录中。按照 GitHub （https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git） 上的详细说明准备子目录并对文件进行必要的修改，以靶向不同的生物体和/或小 RNA 物种，以及操作系统和/或作业调度程序的兼容性。
  4. 按照 GitHub 上的手册 （https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git） 中概述的步骤实施数据分析管道，该手册包含每个步骤的描述、输入和输出文件以及命令行。总之，该流程包括 （i） 从读数中修剪接头序列和随机核苷酸，（ii） 根据其长度过滤读数，（iii） 将读数映射到参考序列，（iv） 解析模糊映射，以及 （v） 生成丰度矩阵。

结果

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牛分枝杆菌 经历指数增长的 BCG（卡介苗和盖兰杆菌）菌株 1173P2 受到营养饥饿的时间序列（0、4、10 和 20 天）的影响，然后在营养丰富的培养基中进行 6 天的复苏，如之前在 胡 等人所述7。从细菌培养物中分离出小 RNA，在 5 个指定时间点中的每一个时间点进行 3 次生物学重复。使用上述 AQRNA-seq 文库制备工作流程构建 Illumina 文库（图 1），然后在麻省理工学院 BioMicro 中心的测序仪上进行测序。然后使用为定量 tRNA 丰度定制的 AQRNA-seq 数据分析管道（图 2）处理测序数据。

使用测序引物对 cDNA 文库进行 PCR 扩增后，在所有样品中观察到 175 个碱基对 （bp） 大小的 PCR 产物的存在（图 3A），表明引物二聚体的形成。为了减少引物二聚体的残留，从凝胶中切除大小超过 195 bp 的 PCR 产物并纯化（图 3B）。

将质量过滤和修剪的序列读数映射到自定义参考序列文库，包括 45 个 tRNA 同工受体、内标和对照序列（即 23S rRNA、16S rRNA、5S rRNA、rnpB 和 ssr）。tRNA 同工受体占给定样品总映射读数的 10.5% 至 40.2%，并且显示出比对照序列高得多的丰度（图 4）。重要的是，tRNA 同工受体的相对低读取比例可能归因于内标的相对丰度较高。因此，操作者可以通过微调加标到反应中的内标量来控制 tRNA 同工受体相对于内标的读取比例（图 4，粉红色与绿色块）。

使用 R 统计规划环境（以下简称 R）v 4.2.117 中的 DESeq2 包版本（以下简称 v）1.36.016 实施的比率中位数方法对原始 tRNA 丰度数据进行归一化。正常化后，在营养饥饿和复苏的时间过程中实现了牛分枝杆菌 BCG 中 tRNA 同工受体的定量景观（图 5）。

为了根据 tRNA 同种受体丰度的模式揭示具有不同表型的不同样品簇，使用 R 中的统计包 v 4.2.117 对归一化 tRNA 丰度数据进行主成分分析 （PCA）（图 6）。分析区分了饥饿第 0 天和复苏第 6 天的样本与饥饿第 4 、 10 和 20 天的样本，表明牛 分枝杆菌 BCG 在营养匮乏培养基和营养丰富的培养基中生长的 tRNA 景观存在相当大的差异。

为了分析每个 tRNA 同工受体在五个指定时间点的丰度动态，使用 R 中的 DESeq2 包 v 1.36.0 对归一化的 tRNA 丰度数据进行差异表达分析（图 7）。分析显示，20 个同位受体家族中有 17 个包含至少一个时间点差异表达（即显着上调或下调）的同受体，这表明 tRNA 库的调节在结核病期间牛 分枝杆菌 BCG 的持续状态中具有潜在作用。

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图 1:AQRNA-seq 文库制备工作流程示意图。 工作流程中概述的关键步骤列在原理图的中心，并通过虚线连接到各自的图形插图。每个步骤的详细说明可在 Protocol 部分找到。 请单击此处查看此图的较大版本。

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图 2:AQRNA-seq 数据分析管道示意图。 管道中概述的关键步骤列在原理图的中心，并通过虚线连接到各自的图形图示。GitHub （https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git） 上提供了每个步骤的详细说明。 请单击此处查看此图的较大版本。

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图 3:使用测序引物进行 PCR 扩增后 cDNA 片段的琼脂糖凝胶电泳。 （A） 凝胶提取和纯化前的凝胶图像。左侧泳道 7 和 14 含有 5 μL 的 50 bp DNA 分子量标准，而其他泳道则含有 15 个样品中的每一个 20 μL。PCR 产物的大小定位表明它们在 175 bp（引物二聚体）到 300 bp（两个引物 + 120 bp 5S rRNA）的范围内最高浓度。（B） 凝胶提取和纯化后的凝胶图像。对于每个样品，切除 200 bp 至 400 bp 之间的凝胶模块，以最大限度地减少测序文库中引物二聚体的污染。 请单击此处查看此图的较大版本。

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图 4:成功映射到参比序列库的序列读长数。 x 轴显示按时间点分组的样本名称（例如，D18-69XX），例如饥饿第 0 天。对于每个样本，与各种目标主题类别相关的读取计数使用彼此堆叠的色块表示。位于色块中心的数字表示与给定样本中相应目标主题相对应的读长比例。 请单击此处查看此图的较大版本。

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图 5: 牛分枝杆菌 BCG 的 tRNA 同工同工受体在饥饿和复苏时间过程中不同时间点的定量景观。 使用比率中位数方法对原始 tRNA 丰度数据进行归一化。在这里，每行将归一化 tRNA 丰度（y 轴）描述为每个时间点 3 个生物学重复的平均值±标准误差。在 x 轴上，将来自同一家族的同种受体分组在一起，并用相应的氨基酸标记。 请单击此处查看此图的较大版本。

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图 6:从主成分分析 （PCA） 得出的样品的平方余弦图。 根据标准化的 tRNA 丰度进行 PCA。平方余弦表示主成分对样本的重要性，并且样本是相对于前两个主成分的平方余弦绘制的。使用样品 ID 标记样品，并按时间点进行颜色编码。 请单击此处查看此图的较大版本。

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图 7:不同时间点 tRNA 同工受体的差异表达。 归一化 tRNA 丰度总结为 3 个生物学重复的平均值（线结）±标准误差（误差线）。由于空间限制，条件缩写如下:S0-S20 = 饥饿天数 0-20;R6 = 复苏第 6 天。对每个 tRNA 同工受体进行差异表达分析，使用似然比检验和 Wald 检验以成对方式比较各个时间点。使用紧凑字母来表示统计显着性，其中给定 tRNA 同工受体在共享至少一个共同字母的时间点的丰度彼此之间没有显着差异。例如，tRNA-Lys-CTT-1-1 的丰度（在赖氨酸面板中）从 S0 到 S4 和从 S4 到 S10 显著下调，但从 S10 到 S20 没有。然后它从 S20 显着上调到 R6。 请单击此处查看此图的较大版本。

表 1:AQRNA-seq 文库制备工作流程中涉及的寡核苷酸。 内标是 RNA，而所有其他寡核苷酸是 DNA。列出的 PCR 引物和定制测序引物对测序平台具有特异性。可以使用新的索引序列设计额外的 PCR 引物。 请点击此处下载此表格。

讨论

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AQRNA-seq 文库制备工作流程旨在最大限度地捕获样品中的 RNA，并最大限度地减少逆转录过程中聚合酶的流失7。通过两步接头连接，新型 DNA 寡核苷酸（接头 1 和接头 2）被过量连接，以完全互补样品中的 RNA。RecJf 是一种对单链 DNA 具有特异性的 5' 至 3' 核酸外切酶，可有效去除多余的接头，同时保持连接的产物完好无损。此外，AlkB 处理减少了 RNA18 上的甲基修饰，这可能导致逆转录过程中聚合酶脱落，从而缓解人为截短 cDNA 产物的问题。AQRNA-seq 是第一个系统优化连接和扩增效率的报道方法。AQRNA-seq 的定量准确性和无偏倚伪影已经过验证，已被证明是 miRNA 分析研究最准确的应用。

AQRNA-seq 非常广泛，建议在文库制备过程中对温度和/或时间敏感的步骤进行操作。具体来说，cDNA 合成之前的步骤（图 1;步骤 1-4），其中样品含有固有不稳定的单链 RNA （ssRNA） 或 DNA 接头连接的 ssRNA，应进行不必要的中断。在高温下使用强碱进行 RNA 水解（图 1;步骤 6）在逆转录后消化 RNA 模板非常有效19。但是，需要注意避免样品长时间暴露于强碱和延迟强酸中和，尤其是在样品数量较多的情况下。通常，强烈建议在冰上制备所有反应，并避免文库中间产物的重复冻融循环。

建议在工作流程的关键点对文库中间体进行采样，以便进行质量检查和及时排除工艺故障。在自动电泳工具上分析样品可以确定接头连接的成功和效率（图 1;步骤 2 和 7）。通过琼脂糖凝胶电泳在 PCR 添加测序引物后（图 1;步骤 9）观察标定 cDNA 产物的定位，有助于评估 PCR 循环的充分性，以及识别样品可能降解和/或引物二聚体的存在。PCR 和测序引物可以重新设计，以与操作员感兴趣的测序平台兼容。

部分由于文库制备涉及的不同设计，AQRNA-seq 数据分析管道主要由自定义脚本构建，仅包含少数现有的生物信息学程序。然而，为了将序列读数与参考序列库进行比对，采用了基本局部比对搜索工具 （BLAST）20 ，因为它具有满足 AQRNA-seq 数据分析特定需求的各种优势。这些包括:（i） 对齐短于 20 bp 的读数并执行子串对齐的能力，（ii） 合理处理模棱两可的碱基 （N），（iii） 略高的对齐精度，以及 （iv） 提供大量细节（如不匹配和间隙）的信息输出，这有利于多样化的下游分析。

值得注意的是，AQRNA-seq 的文库制备工作流程和数据分析管道仍然存在一些设计挑战，这些挑战需要进一步优化，并代表了当前正在进行的工作的重点。首先，与传统的 RNA-seq 方法相比，AQRNA-seq 的定量准确性更高，只需 50-75 ng 的小 RNA 起始量即可实现，而目前该工作流程的测试是减少起始 RNA 的量以提高其灵敏度，并使用更长的 RNA 以扩大其实用性。其次，尽管 AlkB 通过酶促去除了转录后甲基化，但还有其他 RNA 修饰可能导致逆转录过程中聚合酶脱落10。这可能导致人为的截短 cDNA 产物，这些产物无法与全长 tRNA 的具有生物学意义的 5' 降解有效区分。因此，目前正在评估进一步提高逆转录酶持续合成能力的几种可能方法的有效性和与 AQRNA-seq 的相容性。第三，通过凝胶提取和纯化去除引物二聚体效率低下，并且总是会导致靶片段丢失和文库之间的变异性增加。因此，在不丢失靶标片段的情况下减少引物二聚体的潜在残留代表了进一步提高 AQRNA-seq 的灵敏度和定量准确性的机会。重要的是，AlkB 处理以及凝胶提取和纯化都是劳动密集型的，因此它们不是处理大量样品的最佳选择。随着上述领域取得的改进，未来将实现 AQRNA-seq 方法的自动化和高通量处理。数据分析管道的不断完善优先考虑效率、定量准确性和灵活性的提高。虽然目前的流程有效地从序列读数中修剪了 3' 接头子，但一部分读数也具有 5' 接头子序列，这可能是由于连接过程中接头的 3' 末端阻断不充分。5' 接头序列的存在可能会干扰序列读取比对，从而影响定量准确性。因此，通过使用额外的适配器修整工具（如 Cutadapt21）可以保证充分去除 3' 和 5' 适配器序列。为了提高效率，修改后的管道将整合减少计算时间的合理策略。这涉及一个配对末端读长组装步骤，通过识别显著重叠来合并正向和反向读长，并提取独特序列及其在每个文库中出现的序列。预计此类策略将通过避免对 （i） 来自两个方向的读取和 （ii） 可能主导 AQRNA-seq 文库序列读取池的重复序列的冗余分析来大大减少下游计算时间。展望未来，AQRNA-seq 文库制备工作流程和数据分析管道的协同优化可能会为所有形式的 RNA（例如转录组、tRNA 片段和循环肿瘤 RNA 等稀有 RNA 物种）的严格定量研究、tRNA 修饰的作图以及生物标志物和发现生物学的其他关键领域带来多种机会。

披露

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P.C.D. 是两项与已发表作品相关的专利（PCT/US2019/013714、US 2019/0284624 A1）的发明人。

致谢

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本工作的作者感谢描述 AQRNA-seq 技术的原始论文的作者7。这项工作得到了美国国立卫生研究院 （ES002109、AG063341、ES031576、ES031529、ES026856） 和新加坡国家研究基金会通过新加坡-麻省理工学院研究和技术联盟抗菌素耐药性 IRG 的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-酮戊二酸 Sigma-Aldrich75890准备工作溶液 （1 M） 并将其储存在 -20ºC
2100 生物分析仪仪器安捷伦G2938C
腺苷 5'-三磷酸 （ATP） New England BiolabsM0437M（组分 #：N0437AVIAL）NEB M0437M 含有 T4 RNA 连接酶 1 （30 U/μL）、T4 RNA 连接酶反应缓冲液 （10X）、PEG 8000 （1X） 和 ATP （100 mM）;制备工作溶液 （10 mM） 并将其储存在 -20º 下;C
琼脂糖 GPG/LEAmericanBioAB00972-00500在环境温度下储存
铁（II）铵六水合物Sigma-AldrichF2262制备工作溶液 （0.25 M） 并储存在 -20 °C;C
生物分析仪 小 RNA 分析Agilent5067-1548 小 RNA 分析用于检查输入 RNA 的质量和酶促反应（例如，接头 1 连接）的效率
牛血清白蛋白 （BSA;10 mg/mL） New England BiolabsB9000该产品已于 2022 年 12 月 15 日停产，并替换为分子生物学级重组白蛋白 （NEB B9200）。
氯仿 Macron Fine Chemicals4441-10
去甲基化酶 ArrayStarAS-FS-004去甲基化酶配有 rtStar tRNA 预处理和第一链cDNA合成试剂盒（AS-FS-004）
脱氧核苷酸（dNTP）溶液混合物NewEngland BiolabsN0447L（组分#：N0447LVIAL）这种dNTP溶液混合物含有等摩尔浓度的dATP、dCTP、dGTP和dTTP（各10 mM）
数字双加热块VWR Scientific Products13259-052加热块与QIAquick一起使用 凝胶提取试剂盒 
染料2.0 旋转套件 Qiagen63204 有效去除短残基（例如，长度小于 10 bp 的寡核苷酸）
电泳电源Bio-Rad LabrotoriesPowerPac 300
Eppendorf PCR 管 （0.5 mL）Eppendorf0030124537
Eppendorf Safe-Lock Tubes （0.5 mL）Eppendorf022363611
Eppendorf Safe-Lock Tubes （1.5 mL）Eppendorf022363204
Eppendorf Safe-Lock Tubes （2 mL）Eppendorf022363352
乙醇（乙醇），纯Sigma-AldrichE7023 纯乙醇与 Zymo Research 的 Oligo Clean and Concentrator 试剂盒配合使用
凝胶成像系统Alpha InnotechFluorChem 8900
凝胶上样染料，紫色 （6X），无 SDSNew England BiolabsN0556S（组分 #：B7025SVIAL）NEB N0556S 包含快速加载紫色 50 bp DNA 分子量标准和凝胶上样染料，紫色 （6X），无 SDS
GENESYS 180 紫外-可见分光光度计Thermo Fisher Scientific840-309000分光光度计用于使用比尔定律
HEPESSigma-AldrichH4034制备工作溶液（1 M;pH = 8，含 NaOH）并将其储存在 -20 °C;C
盐酸 （HCl） VWR Scientific 产品BDH3028 准备工作溶液 （5 M） 并将其储存在环境温度下
异丙醇（异丙醇），纯Macron 精细化学品3032-16异丙醇与 QIAquick 凝胶提取试剂盒 
L-抗坏血酸Sigma-AldrichA5960制备工作溶液 （0.5 M） 并将其储存在 -20ºC
微量离心机Eppendorf5415D
NanoDrop 2000 分光光度计Thermo Fisher ScientificND-2000
NEBuffer 2 （10X）New England BiolabsM0264L（组件 #：B7002SVIAL）NEB M0264L 含有 RecJf （30 U/μL） 和 NEBuffer 2 （10X）;储存在 -20 °C
无核酸酶水（未经 DEPC 处理）Thermo Fisher ScientificAM9938 
寡核苷酸纯化 &集中器套件 Zymo ResearchD4061 在环境温度下储存
PEG 8000 （50% 溶液） New England BiolabsM0437M（组分 #：B1004SVIAL）NEB M0437M 含有 T4 RNA 连接酶 1 （30 U/μL）、T4 RNA 连接酶反应缓冲液 （10X）、PEG 8000 （1X） 和 ATP （100 mM）;制备工作溶液 （10 mM） 并将其储存在 -20º 下;C
Peltier 热循环仪MJ ResearchPTC-200
苯酚：氯甲状：异戊酰 酒精度 25：24：1 pH = 5.2 Thermo Fisher ScientificJ62336 
PrimeScript 缓冲液 （5X）TaKaRa2680A 
PrimeScript 逆转录酶TaKaRa2680A 
QIAquick 凝胶提取试剂盒 Qiagen28704该试剂盒需要加热块和异丙醇才能与
快速加载紫色 100 bp DNA 分子量标准New England BiolabsN0551S（组分 #：N0551SVIAL）
快速加载紫色 50 bp DNA 分子量标准New England BiolabsN0556S（组分 #：N0556SVIAL）NEB N0556S 包含快速加载紫色 50 bp DNA 分子量标准和凝胶上样染料，紫色 （6X），无 SDS
RecJf （30 乌拉姆;L） New England BiolabsM0264L（组分#：M0264LVIAL）NEB M0264L含有RecJf（30 U/μL） 和 NEBuffer 2 （10X）;储存在 -20 °C
RNase 抑制剂（小鼠;40 U/μL） 新英格兰生物实验室M0314L （组件 #： M0314LVIAL）存储在 -20 °C
SeqAMP DNA 聚合酶 TaKaRa638509 TaKaRa 638509 含有 SeqAMP DNA 聚合酶 和 SeqAMPPCR 缓冲液 （2X）
SeqAMP PCR 缓冲液 （2X） TaKaRa638509 TaKaRa 638509 含有 SeqAMP DNA 聚合酶 和 SeqAMPPCR 缓冲液 （2X）
虾碱性磷酸酶 （1 U/μL） 新英格兰生物实验室M0371L （组分 #： M0371LVIAL）
氢氧化钠 （NaOH）Sigma-Aldrich S5881制备工作溶液 （5 M） 并将其储存在环境温度下
T4 DNA 连接酶 （400 U/μL） 新英格兰生物实验室M0202L （组分 #：M0202LVIAL）NEB M0202L 含有 T4 DNA 连接酶 （400 U/μL） 和 T4 DNA 连接酶反应缓冲液 （10X）
T4 DNA 连接酶反应缓冲液 （10X） 新英格兰生物实验室M0202L （组分 #：B0202SVIAL）NEB M0202L 含有 T4 DNA 连接酶 （400 U/μL） 和 T4 DNA 连接酶反应缓冲液 （10X）
T4 RNA 连接酶 1 （30 u/μL） New England BiolabsM0437M（组分#：M0437MVIAL）NEB M0437M含有T4 RNA连接酶1（30 U/μL）、T4 RNA 连接酶反应缓冲液 （10X）、PEG 8000 （1X） 和 ATP （100 mM）
T4 RNA 连接酶反应缓冲液 （10X） New England BiolabsM0437M（组分#：B0216SVIAL）NEB M0437M含有T4 RNA连接酶1（30 U/μL）、T4 RNA 连接酶反应缓冲液 （10X）、PEG 8000 （1X） 和 ATP （100 mM）
硫酸 测量寡核苷酸浓度 配合使用

参考文献

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