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方法文章

用于胰岛分离的猪胰腺手术灌注与分离

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DOI：

10.3791/66350

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2024年6月7日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Section of Vascular Surgery, Washington University School of Medicine, 2CardioVascular Research Innovation in Surgery and Engineering Center, Washington University School of Medicine, 3Department of Medicine, Division of Nephrology, Washington University School of Medicine, 4Department of Medicine, Division of Endocrinology, Washington University School of Medicine, 5Department of Surgery, Section of Transplant Surgery, Washington University School of Medicine, 6Division of Molecular Cell Biology, Washington University School of Medicine, 7Department of Biomedical Engineering, Washington University McKelvey School of Engineering

本文内容

摘要

本方案提供了用于胰岛分离与纯化的猪胰腺获取的逐步操作指南。

摘要

胰岛移植是治疗1型糖尿病的一种新兴疗法，但其应用受到供体匹配和可获得性的限制。猪胰岛异种移植为同种移植提供了一种有前景的替代方案，有望实现按需大规模生产具有功能的胰岛。所分离胰岛的产量和存活率高度依赖于供体胰腺的质量以及获取方法，尤其是热缺血时间的长短。为了改善器官保存效果以及后续胰岛的产量和存活率，我们开发了一种猪胰腺的手术灌注与切除方案。该方案采用直接的肾下腹主动脉插管和器官灌注，既能最大限度地缩短热缺血时间，又可简化操作流程，适用于外科经验有限的操作人员。通过主动脉对胰腺进行后续动脉灌注，可冲洗微血管系统中的滞留血液，从而减少血栓形成和组织的氧化损伤。本文提供了一套详细的猪胰腺手术灌注与切除操作方案，并包括后续的胰岛分离与纯化步骤。

引言

1型糖尿病是由自身免疫系统对胰腺β细胞的破坏所引起的1。 因此，患者需依赖外源性胰岛素，易发生血糖波动，并出现高血糖和低血糖事件2。同种异体胰岛移植是治疗1型糖尿病的一种潜在治愈方法；然而，胰腺器官供体的稀缺性仍是该技术广泛推广应用的主要障碍2,3。来自猪的异种胰岛移植是一种有前景的替代方案，因为这些动物来源充足。猪胰岛的分离技术优化与规模化生产对于推动异种胰岛移植的发展至关重要。

尽管已有多种猪胰腺获取技术被发表，但这些手术方法大多描述的是在诱导心脏死亡或放血后进行的胰腺切除术4,5,6,7,8,9,10。这些技术的一个主要缺点是，在心脏死亡至开始动脉内和/或导管内灌注保存液之间，存在不稳定的热缺血时间（WIT）。即使仅10分钟的WIT也会对胰岛的产量和活性产生负面影响5。为最大限度缩短WIT，需迅速使用保存液对胰腺进行灌注。在腹部器官获取过程中，经主动脉插管后使用威斯康星大学（UW）溶液进行体内灌注，对于清除血液、防止血管内血栓形成、保护组织免受缺血损伤以及减少细胞损伤至关重要11,12。

既往研究表明，在猪胰腺获取过程中，通过乌威溶液（UW溶液）对腹腔干和肠系膜上动脉进行低压灌注，可提高胰岛的得率和纯度4。然而，以往发表的猪胰腺获取方法均涉及开腹主动脉插管，该操作技术难度较高，尤其在体型较小的猪中更具挑战性13,14,15。在本论文中，我们提供了一套详细的分步操作方案，并配有相应的可视化辅助图示，涵盖猪胰腺的手术灌注与获取过程，继而进行胰岛的分离与纯化。该胰岛分离过程中采用的新型主动脉插管技术，旨在最大限度地减少热缺血时间（WIT），并使胰腺获取过程在无血视野下完成，从而提高胰岛分离的得率和活性。

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方案

所有涉及动物的操作均须经华盛顿大学医学院比较医学部机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。成年约克夏猪，体重范围为35至35 kg，是本操作的理想选择；然而，可根据实验的具体情况对不同体型的猪进行方案调整。整个操作应在手术室环境中以无菌方式进行。

1. 术前准备与麻醉

  1. 使用以下混合药物对猪进行镇静：每千克体重注射4 mg替来他明-唑拉西泮（tiletamine和zolazepam）、20 mg氯胺酮（ketamine）和2 mg赛拉嗪（xylazine），肌肉注射。
  2. 通过耳缘静脉建立外周静脉通路。
  3. 使用100%氧气中吸入1%-3%异氟烷诱导全身麻醉，并对猪进行气管插管。
    注意：与吸入性麻醉剂相比，使用丙泊酚或其他任何静脉诱导药物进行诱导可能更有利于实现更平稳的诱导和插管过程。需监测生命体征及呼气末 CO₂2持续监测血氧饱和度和心电波形，以评估和维持麻醉深度。通过床旁超声确认腹部手术平面。
  4. 用氯己定葡萄糖酸盐从胸骨切迹至双侧腹股沟对猪进行剃毛和皮肤准备。
  5. 用无菌巾铺置手术区域，确保整个腹部视野清晰可见（图1A).

2. 手术准备及腹膜后腔的暴露

  1. 行正中腹切口（图1B）。
    1. 使用10号刀片手术刀和电凝设备，从剑突至耻骨行正中腹切口。注意使切口在下腹部泌尿生殖孔周围呈弧形弯曲。
  2. 行右侧内脏旋转。
    1. 将右半结肠和小肠移出腹腔，并用无菌毛巾包裹。
    2. 轻柔地将结肠和肠管向左侧牵拉，以暴露右侧后腹膜，同时避免肠管扭转或位置异常。
  3. 引流膀胱（可选步骤）。
    1. 若膀胱充盈并影响术野暴露，可用两把DeBakey镊夹住膀胱，在膀胱腹侧壁使用11号刀片手术刀切开。
    2. 将Yankauer吸引头插入膀胱内，吸出尿液以减压膀胱。
  4. 安置腹腔牵开器，以充分暴露右侧后腹膜（图1C）。

3. 腹膜后解剖

  1. 开始腹膜后解剖（图2A）。
    1. 使用电凝刀在中线右侧切开腹膜，从右肾水平至腹主动脉分叉处。
    2. 锐性分离暴露肾下腹主动脉、下腔静脉（IVC）以及右侧肾动脉和肾静脉。
  2. 使用大号血管环对远端肾下腹主动脉进行环周控制。
  3. 结扎下腔静脉（图2B）。
    1. 对中段肾下部下腔静脉进行环周控制。
    2. 使用2-0丝线结扎下腔静脉。
  4. 结扎肾血管（图2C）。
    1. 对左右两侧肾动脉和肾静脉进行环周控制。
    2. 使用2-0丝线结扎这些结构。
    3. 若存在多支肾动脉，应分别分离并逐一结扎每支血管。

4. 胸腔内解剖

  1. 切开右侧膈肌（图3A）。
    1. 轻柔地将肝脏向下牵拉，以暴露右侧膈肌。在右侧膈肌的膜性部分施加两个艾利斯钳，并使用电凝在两个钳子之间切开膈肌。
    2. 将膈肌切口水平向延长至约7 cm。
  2. 实现对胸腔内下腔静脉的环周控制（图3B）。
    1. 用一根2-0丝线环绕胸腔内下腔静脉，并用小止血钳夹住缝线两端，注意不要阻断下腔静脉血流。
  3. 将膈肌切口延伸至左侧膈肌（图3C）。
    1. 使用两个艾利斯钳将膈肌切口边缘向下牵拉，并向左侧膈肌方向延长切口。
      注意：进行膈肌切开时应避免进入心包腔。
  4. 暴露左侧后内侧胸腔区域的降主动脉。

5. 肾下腹主动脉插管、内脏隔离与灌注

  1. 对猪进行全身抗凝。
    1. 通过外周静脉通路给予全身肝素（100 U/kg）。在进行主动脉插管前等待3分钟。
  2. 使用18 G微穿刺针进入肾下腹主动脉（图4A）。
  3. 将J型导丝经针穿入腹主动脉，然后沿导丝撤出穿刺针。
  4. 沿导丝置入10Fr鞘管进入腹主动脉，随后撤出导丝（图4B）。
  5. 将静脉输液管连接至10Fr鞘管，并以无菌方式经鞘管灌注UW溶液。以40–60滴/分钟的速度灌注UW溶液。
    注意：在胸主动脉被阻断前，灌注不会开始。确保静脉输液管无张力，以避免主动脉内鞘管移位。
  6. 快速连续进行内脏隔离与灌注。
    1. 使用主动脉钳夹闭肾下腹主动脉。
    2. 使用主动脉钳夹闭降胸主动脉。
    3. 用先前放置的2-0缝线结扎胸腔内下腔静脉。
    4. 通过外周静脉通路给予100 mg/kg氯化钾（KCl）实施安乐死。
      注意：给予KCl后即开始心脏死亡过程。
    5. 在2-0结扎线近端的肾下段下腔静脉做静脉切开，经切口插入带孔吸引管（图4C）。
    6. 用2–3 L冷UW溶液灌注内脏器官。
    7. 在灌注过程中继续解剖，实施全胰腺切除术。
      注意：随着UW溶液灌注至实质器官区域，内脏尤其是胰腺应逐渐变为苍白（图5A）。

6. 全胰腺切除术

  1. 在UW溶液灌注期间，解除对小肠的牵拉。
  2. 开始解剖胰腺的十二指肠叶、连接叶和脾叶 内脏灌注期间将胃向上方牵拉以暴露胰腺。结合钝性分离与电凝术，将胰腺从其网膜附着处游离。
    注意：胰腺体部实际上环绕门静脉。操作时需注意避免损伤位于十二指肠叶后方，随后走行至桥接叶和连接叶前方的门静脉。
  3. 分离胰管（图5B). 找到胰管进入十二指肠的位置。使用两根3-0丝线结扎胰管，并在两结扎线之间横断胰管。
  4. 全胰切除术（图5C).
    1. 从十二指肠的C形袢开始解剖剩余的十二指肠叶，直至其完全游离。
    2. 将胰腺从其余相连组织中分离。仔细结扎并切断来自肠系膜上动脉至胰腺的小血管。
    3. 将胰腺与门静脉分离。从门静脉上解剖出胰腺体部及连接的胰叶。结扎从门静脉通向胰腺的所有静脉分支，包括脾静脉。
      1. 在连接叶与脾叶之间的胰腺峡部进行横断，以实现从门静脉的自由游离。
        注意：操作时需小心，避免破坏胰腺十二指肠叶与脾叶之间的连接。
  5. 将整个胰腺浸入冰冷的无菌UW溶液中，并立即将容器置于冰上。将胰腺运送至无菌操作台以进行胰岛分离。开始进行胰腺胰岛分离（图6).

7. 胰管插管

  1. 将胰腺置于生物安全柜内冰上的无菌托盘中。
  2. 剥离胰腺周围的多余纤维组织和血液。
  3. 如有必要，横向切开导管以更清楚地观察管腔。找到导管后，使用合适尺寸的导管（16 G）将套管插入并推进至导管内。
  4. 用2.0丝线固定导管位置，但避免阻塞管腔。
  5. 配制三种去污溶液，并将插管后的胰腺依次浸入每种去污溶液中，各浸泡60秒。

8. 胰腺的灌注与扩张

  1. 制备酶消化液（图6）。
    1. 将100 mg市售的胶原酶1和胶原酶2溶液（详见材料表）与所需量的1x HBSS和10,000 U肝素溶液混合。若分离的胰腺组织重量在100 g至200 g之间，则将酶与总共200 mL的1x HBSS和肝素溶液混合。
  2. 用酶溶液灌注胰腺。
    1. 以可控的适度压力，将酶溶液以每次60 mL的剂量注入胰管。持续此操作，直至全部酶溶液均注入胰腺。
      注意：有效的灌注应导致胰腺组织膨胀。
    2. 若部分酶溶液从胰腺组织泄漏至无菌托盘中，可在步骤8.3中将剩余溶液重新注入胰腺，或在步骤9.2中将其加入Ricordi室中。
  3. 使用22 G针头将任何剩余的酶溶液直接注射至膨胀不良的胰实质区域。

9. 胰腺的消化

  1. 将含有 500 mL 1x HBSS 的循环储液罐置于 47 °C 水浴中，预热储液罐中的溶液。
    注意：酶溶液在 36–38 °C 时功能最佳，且在启动蠕动泵后 5 分钟内需达到此温度。Ricordi 装置内的内容物（包括灌注了酶的胰腺）初始温度为 4 °C。通过将循环储液罐预热至 47 °C，储液罐与 Ricordi 室内的液体混合后，可在启动蠕动泵 5 分钟内使整个循环系统的温度升至 36–38 °C。
  2. 移除并丢弃胰管中的导管，将胰腺切成约 1–3 cm 的小块。
  3. 准备消化循环系统。蠕动泵将把消化循环储液罐中的溶液经加热盘管泵入 Ricordi 室（图 6）。
  4. 将胰腺组织块与九颗 1.5 cm 的氮化硅珠一同放入 Ricordi 室中，并用剩余的酶溶液填充至滤网水平。
  5. 为密封 Ricordi 室，先将滤网和橡胶垫圈放置到位，然后盖上盖子。拧紧螺丝以固定 Ricordi 室的盖子，并确保室体密封良好后再进行后续操作。
  6. 将加热盘管置于 47 °C 的热水浴中。
  7. 将进液和出液套管插入含有 500 mL 1x HBSS 的消化循环储液罐中。
  8. 以 450 mL/min 的流速启动泵，直至整个室腔充满消化液。当液体在循环系统中流动时，将流速降低至 100 mL/min。
  9. 手动摇动消化室，使组织与氮化硅珠充分搅动。
  10. 从 8 分钟消化开始，从循环储液罐中取 1 mL 样本进行二苯硫腙（DTZ）染色，以监测消化进程。
    1. 配制 DTZ 染色液：将 10 mg DTZ 溶解于 2 mL 二甲基亚砜（DMSO）中。
    2. 向 1 mL 消化样本中加入 10 µL 配制好的 DTZ 染色液。在 4 倍放大镜下观察样本。经 DTZ 染色后，胰岛呈深红色至黑色。
      注意：当观察到大多数或全部胰岛“游离”且完整，而腺泡组织已分散为较小的团块时，表明消化完成。
  11. 判断消化完成后，将盘管转移至冰浴中，将进液套管从储液罐中取出，并将泵速提高至 210–250 mL/min。使消化后的组织从 Ricordi 室流入循环储液罐中。
    注意：消化完成后，Ricordi 室中通常仅残留极少量组织。一般情况下，未消化的胰腺组织残留量 <10%，但具体比例可能因样本个体差异而有所不同。
  12. 称量剩余组织以评估消化效率。将消化后的组织从循环储液罐转移至置于冰上保持低温的 250 mL 锥形管中。

10. 胰腺组织的采集

  1. 将消化后的胰腺组织放入 250 mL 锥形管中，在 4 °C 条件下以 250 × g 离心 1 分钟，离心过程中不启用刹车。
  2. 小心从离心机中取出管子，使用刻度移液管吸除上清液，避免扰动沉淀物。
  3. 轻柔地重悬各锥形管中的沉淀物，并将其合并至一个 250 mL 锥形管中。若组织体积 ≤50 mL，用胰岛收集液将沉淀物重悬至总体积为 100 mL；若组织体积 >50 mL，则用胰岛收集液重悬至总体积为 200 mL。若收集的组织体积超过 100 mL，需进行两次细胞分离仪纯化循环。
  4. 用 RPMI 培养基重悬组织至总体积为 100 mL（假设收集的组织为 50 mL），然后加载至细胞分离仪中。

11. 使用连续梯度法纯化胰岛

  1. 按照制造商的说明对细胞处理器进行预灌注。
  2. 将125 mL高密度梯度溶液加入连续梯度形成器中，然后使用设定为200 mL/min的泵将高密度梯度溶液注入细胞处理器。
  3. 启动细胞处理器离心功能，转速设为1,000 RPM。
  4. 释放系统中的空气，并用高密度梯度溶液重新进行预灌注。
  5. 向梯度形成器中加入125 mL高密度梯度溶液和130 mL低密度溶液。
  6. 加载100 mL消化后的组织悬液。
  7. 将细胞处理器转速提高至2,000 RPM，持续3分钟。
  8. 准备16个50 mL锥形管用于收集纯化的胰岛组分。每管加入25 mL RPMI培养基，并将所有试管按升序排列。
  9. 将纯化的胰岛组分收集至已准备好的锥形收集管中。

12. 胰岛评估与染色

  1. 从每份纯化的胰岛组分中收集 100–200 µL 等分试样，置于 24 孔组织培养板中，进行 DTZ 染色以评估胰岛含量及各纯化组分的情况。使用 4 倍放大倍数的光学显微镜检查每一份组分。经 DTZ 染色后，胰岛呈现深红色至黑色。
  2. 确定胰岛后，选择胰岛含量最高的组分。在 4 °C 条件下，以 250 × g 离心 1 分钟（不启用刹车）纯化组分。
  3. 小心吸除上清液，并将胰岛沉淀重悬于胰岛生长培养基中。将纯化的胰岛转移至 1–4 个 T-125 培养瓶中。
  4. 纯化完成后，对胰岛进行数量、活力和功能的评估。
    1. 使用胰岛细胞计数器评估胰岛数量和大小分布（图 7A）。一个完整的胰腺通常可获得 100 万至 200 万个胰岛当量。
    2. 进行活力染色时，将 2 µL 钙黄绿素 AM（calcein AM）和 2 µL 碘化丙啶同型二聚体-1（ethidium homodimer-1, CaAM/EthD-1）与 1,000 µL PBS 混合（图 7B）。染色 30 分钟后，在 4 倍或 10 倍放大倍数下观察胰岛。活胰岛呈绿色荧光，死胰岛呈红色荧光。

13. 胰岛细胞培养

  1. 最初48小时内，在37 °C条件下使用恢复培养基培养胰岛，以提供充足的营养（约1,000个胰岛/mL恢复培养基）。
  2. 第2至21天，在37 °C条件下使用标准生长培养基培养胰岛。

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结果

手术设置及正中剖腹手术如图1所示。剖腹切口应呈弧形，以避开泌尿生殖道开口（图1B）。安装拉钩时，应将Omni或Bookwalter拉钩的支架固定在手术台左下方角落。理想的牵拉方式包括：使用两个拉钩片牵开右侧腹壁，两个拉钩片牵开左侧腹壁，以及1-2个拉钩片用于牵开包裹在无菌毛巾中的右半结肠和小肠（图1C）。可根据助手情况和术者偏好，选用腹壁、内脏或可塑性拉钩片。若无Omni或Bookwalter拉钩，可在两侧使用1-2个自持式Balfour拉钩牵开腹壁。助手则可手动牵拉包裹在无菌毛巾中的右半结肠和小肠。

如图2所示，腹膜后分离可结合钝性与锐性分离技术进行。虽然需要对肾下腔静脉（IVC）和腹主动脉实现周向控制，但该分离无需继续向下至分叉处。手术的胸腔内部分技术难度最高（图3），因为胸腔内或肝...

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讨论

使用猪作为供体的胰岛异种移植是治疗1型糖尿病的一种有前景的策略。胰岛分离具有挑战性，最终胰岛的活力和得率极易受到器官获取过程中出现的低血压和组织缺血的影响16,17。为了优化胰腺的获取与保存，本方案提出了一种新的主动脉插管、内脏隔离及灌注方法，用于胰岛分离前猪胰腺的获取过程。

猪胰岛分离的成功依赖于供体胰腺的最佳获取与保存。彻底清除胰腺组织中的全部血液对于优化胰岛分离至关重要，因为组织中残留的血液可导致补体激活及胰腺微血管血栓形成，从而降低胰岛的产量和活性4,18。以往的技术还包括经肾下腹主动脉插管进行动脉内灌注13,14,15,

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本手稿得到了中西部移植基金会临床创新资助的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 M NaOH，100 mLMillipore Sigma1310-73-2
10x HBSS，500 mL（15 至 30 °C）Thermo Fisher14065056
1x D-PBS，500 mLThermo Fisher14200075
1x HBSS，1 LThermo Fisher14025076
250 mL 圆锥形离心管Millipore SigmaCLS430236-6EA
两性霉素 B [50 mg]Millipore SigmaPHR1662
10% 聚维酮碘消毒剂Millipore Sigma25655-41-8
BioRad 梯度形成器BioRad395
氯化钙二水合物Thermo Fisher10035-04-8
COBE 细胞处理仪Ebay317690 
消化回路储液瓶，Gibco 瓶，1 LThermo Fisher10341001
二甲基亚砜（DMSO）Thermo Fisher85190
双硫腙Thermo Fisher60-10-6
梯度形成器连接套件BioRad1652008
肝素 [1000 U/mL]Emergency Medical Products0409-2720-01
HEPES 缓冲液（1 M），100 mLThermo Fisher15630080
人血清白蛋白 25%，100 mLCelprogenHSA2001-25-1
异氟烷Covetrus货号：11695067772
氯胺酮Patterson货号：07-894-8462
Liberase（100 mg）Millipore Sigma5401020001
LIVE/DEAD 活力/细胞毒性检测试剂盒Thermo FisherL3224
Lympholyte 1.1 培养基，500 mLCedarlane LabsCL5020
Masterflex LS 16 泵管Masterfle96419-16
Masterflex 蠕动泵Masterflex07522-30
青霉素-链霉素（2 mg/mL）CelprogenPS-30-002
Pulmozyme（1 mg/mL，2.5 mL/瓶）Dornase Alfa8931278
复苏培养基，PIM(R)Prodo Laboratories, Inc.PIM-R001GMP
RPMI 1640Millipore SigmaR8758-1L
标准培养基，PIM(S)Prodo Laboratories, Inc.PIM-S001GMP
Tzed™（替拉明和唑拉西泮）注射液 CPatterson货号：07-894-6240
威斯康星大学（UW）溶液，3 LGlobal Transplant Solutions1000-0046-06
水浴锅Sigma AlderichCLS6783-1EA
赛拉嗪Patterson货号：07-891-6165

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